НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
БЄЛИХ ІРИНА АНАТОЛІЇВНА
УДК 57.043:577.11:612.014.464
Дія озону на біополімери та озонові методи в кріобіології
03.00.19 – кріобіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України
Науковий керівник:
Доктор біологічних наук, професор Зінченко Василь Демидович, Інститут
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий
співробітник відділу кріобіофізики, м. Харків
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач
відділом низькотемпературного консервування, м. Харків
Доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут
біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, головний науковий співробітник
відділу молекулярної біології, м. Київ
Провідна установа:
Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерство
освіти і науки України, кафедра біохімії
Захист відбудеться „21” березня 2006 р. о 13.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, м. Харків, 61015
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, м.
Харків, 61015
Автореферат розісланий „16” лютого 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Зберігання живих систем при температурах нижче
температури склування рідини в системі і можливість відновлення
життєздатності після дії низьких температур набуває статусу
біотехнології, практичне застосування якої швидко розвивається.
Кріоконсервування клітин покликане, в першу чергу, до вирішення таких
проблем, як зберігання рідких та зникаючих біологічних видів і
застосування кріоконсервованих клітин у наукових дослідженнях і
лікуванні.
При довгостроковому зберіганні клітин враховуються результати досліджень
і досвід, які отримані при кріоконсервуванні інших біологічних об’єктів,
а також механізми кріоконсервування і кріозахисту, які мають загальний
характер для різних біологічних систем. За останні 50 років встановлено
декілька більш чи менш детальних механізмів ушкодження та виживання
живих систем при низьких температурах.
Вагомим фактором кріоушкодження є осмотична дегідратація клітин при
виморожуванні частини води в системі, що призводить до зморщування
клітин і до високих (токсичних) концентрацій розчинених сполук у
цитоплазмі. Висока концентрація позаклітинних солей викликає “сольове
навантаження” при низьких температурах, що може призвести до осмотичного
дисбалансу і надмірного набрякання клітин і лізису при відтаюванні
[B.J. Lyuet, 1953].
Інший механізм дії гіперконцентрації солей полягає у тому, що ушкодження
виникає в результаті зневоднення клітини до мінімально можливого
значення.
Витіснення клітин у вузькі канали між кристалами льоду призводить до
щільної упаковки клітин і тісного контакту з льодом, що викликає
механічні ушкодження [T. Меryman, 1963, 1989].
До ушкоджуючих факторів заморожування біологічних систем відносять
також змінення рН, термотропні перебудови мембран і зв’язані з цим
змінення бар’єрної функції мембран, руйнування біологічного об’єкту в
результаті термомеханічних напружень.
Однак, термін “ушкодження” вимагає уточнення. В деяких випадках
біологічні об’єкти можуть витримувати глибоке охолодження, і хоча після
дії холоду відбуваються метаболічні зрушення, вони можуть зникати з
часом у нормальних фізіологічних умовах. У таких випадках говорять про
нелетальні ушкодження. Виявлено, що деякі сполуки та іони, наприклад,
неоміцин, пептон, Mg2+, Са2+ ефективно відновлюють холодові ушкодження.
В останні роки з’явилось багато публікацій відносно стимулюючої дії
малих доз озону на функціонування різних біологічних систем, що свідчить
на користь можливості використання вказаної властивості озону для
інтенсифікації репараційних процесів у біологічних системах після дії
холоду. Інший аспект застосування озонових технологій у кріобіології
пов’язаний зі здатністю озону у високих дозах знешкоджувати
мікроорганізми. Кріобіологічні технології у більшості випадків пов’язані
з чисельними лабораторними маніпуляціями над біологічним матеріалом, де
стерильність має велике значення, оскільки на кожному етапі існує ризик
контамінації біологічного матеріалу мікроорганізмами. Озонові технології
є також дуже привабливими для розробки способів стерилізації
кріобіологічного обладнання.
Ці посилки були підґрунтям для виконання даної роботи і зумовили
необхідність детального вивчення дії озону на клітинному і молекулярному
рівнях.
Чутливість клітин до факторів кріоушкодження зв’язують, в першу чергу,
із станом цитоплазматичних мембран, що вимагає дослідження дії малих доз
озону на цілісність клітинних мембран в умовах, які моделюють
заморожування біологічних систем.
Розуміння механізмів дії озону на біологічні системи вимагає знання
особливостей взаємодії озону з біополімерами. Для досліджень в даній
роботі були вибрані бичий сироватковий альбумін і ацетилхолінестераза.
Отримані в роботі результати використані з одного боку для
експериментальної перевірки і чисельної оцінки ефектів дії різних доз
озону на деякі біологічні системи, а з іншого – для розробки
рекомендацій щодо використання озонових технологій на різних етапах
кріоконсервування для покращення технологій кріоконсервування
біологічних об’єктів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відділі кріобіофізики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України у відповідності з планами науково-дослідних робіт за темами
“Дослідження можливих механізмів профілактичної і терапевтичної дії
озону і перекису водню, які генеруються у газовому розряді при
використанні в акушерстві, гінекології, а також як стимуляторів
метаболічних процесів в біологічних об’єктах після кріоконсервування”
(номер державної реєстрації 0102U002025) і “Підвищення ефективності
технологій кріоконсервування біологічних систем шляхом інтенсифікації
репараційних процесів після дії холоду і зниження ризику мікробної
контамінації на різних етапах кріоконсервування” (номер державної
реєстрації 0105U03918).
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – встановити особливості впливу
малих доз озону на репараційні процеси в деяких біологічних об’єктах
після дії холоду в реальних і модельних експериментах, ступінь
вираженості цього впливу, а також особливості дії високих доз озону у
газовій фазі і у водних розчинах на мікроорганізми.
Для досягнення цієї мети були вирішені наступні задачі:
Дослідити дію малих доз озону в ростовому середовищі на кінетику росту
мікроорганізмів Escherichia coli у нормальних фізіологічних умовах.
Дослідити вплив малих доз озону на проліферативні властивості
мікроорганізмів (бактерій, дріжджоподібних грибів) після
заморожування-відтавання і у нормальних умовах.
Дослідити вплив малих доз озону на стійкість еритроцитів до
гіпертонічного гемолізу.
Дослідити вплив озону на структурний стан білка – бичого сироваткового
альбуміну та ферментативну активність ацетилхолінестерази.
Дослідити динаміку інактивації деяких мікроорганізмів (бактерій,
дріжджоподібних грибів, спорових форм бактерій) озоном у газовій фазі і
водних розчинах.
На підставі отриманих експериментальних результатів рекомендувати
можливі шляхи використання озону в технологіях кріоконсервування
біологічних об’єктів.
Об’єкт дослідження. Репараційні і проліферативні процеси в
біологічних об’єктах після дії різних доз озону і
заморожування-відтавання, процеси інактивації мікроорганізмів озоном у
газовій фазі та у водних розчинах.
Предмет дослідження. Озон у газовій фазі і водних розчинах, культури
бактерій Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
дріжджоподібні гриби Candida albicans, бичий сироватковий альбумін,
фермент ацетилхолінестераза, еритроцити донорської крові людини.
Методи дослідження. У роботі було використано біофізичні (оптична
спектроскопія), біохімічні та мікробіологічні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше експериментально показано,
що в присутності озону в певних дозах у ростовому середовищі М9 зростає
проліферативна активність бактерій Escherichia coli.
Уперше встановлено, що під дією малих доз озону після
заморожування-відтавання активізуються репараційні процеси у
дріжджоподібних грибах Сandida albicans і величина цього ефекту є
дозо-залежною.
Доведено, що стійкість еритроцитів до гемолізу в гіпертонічних умовах
зростає у присутності певних доз озону і знижується при перевищенні цих
доз.
Уперше показано, що активність ацетилхолінестерази зростає під дією
малих доз озону і знижується при підвищенні деякого порогового значення
дози.
На підставі отриманих результатів встановлено, що озон у визначених
дозах може сприяти інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду
на біологічні об’єкти і тому може бути використаний у технології
кріоконсервування біологічних об’єктів.
Практичне значення одержаних результатів. Виявлений у роботі ефект
стимуляції репараційних процесів в мікроорганізмах малими дозами озону
після заморожування-відтавання може бути підґрунтям для розробки нових
протоколів кріоконсервування. Встановлений експериментально ефект дії
малих доз озону на стійкість еритроцитів до гіпертонічного лізису може
знайти застосування при оптимізації процедури кріоконсервування
еритроцитів і, можливо, інших клітин. Важливе в практичному плані
значення має також встановлення факту, що озон стимулює ріст деяких
видів бактерій у нормальних фізіологічних умовах. Цей ефект може знайти
застосування в експериментальній та промисловій мікробіології.
Результати дослідження інгібування росту мікроорганізмів високими дозами
озону в газовій фазі і встановлені при цьому концентрації і дози озону,
необхідні для повної інактивації мікроорганізмів, можуть мати
безпосереднє практичне застосування при стерилізації озоном
низькотемпературних сховищ та іншого кріобіологічного обладнання,
приміщень, низькотемпературних банків, боксів і медичного
інструментарію.
Особистий внесок здобувача полягає у підготовці аналітичного огляду
літератури, проведенні експериментальних досліджень, аналізі і
узагальненні результатів досліджень та їх підготовці до опублікування. В
наукових працях, виконаних у співавторстві здобувачу належить планування
дослідницької роботи, організація експерименту та участь в його
реалізації, обробка та аналіз результатів досліджень.
Співавторами робіт, опублікованих за темою дисертації є:
Зінченко В.Д. – консультації щодо вибору методик досліджень в роботах
[2,3,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15]; Грищенко В.І. – консультації з методів
дослідження біологічної дії озону в роботах [6,14]; Зінченко О.В. –
консультації щодо вибору методики дослідження в роботах [8,11,15]; Дюбко
Т.С. – допомога у підготовці експериментів і консультації щодо
проведення досліджень біологічних об’єктів методами спектроскопії і
спектрофлуориметрії в роботах [2,9,13]; Висеканцев І.П., Каднікова Н.Г.,
Казанжан С. В. – консультації з проведення мікробіологічних досліджень і
допомога у підготовці експериментів з дослідження дії озону на
мікроорганізми в роботах [1,3,7,10,11,14,15]; Гузій Ю.І., Голота В.І.,
Сухомлин Є.О., Ковальчук І.М.,– консультації та допомога в збірці
експериментального озонаторного обладнання [1,6]; Сахаров Г.В. –
допомога в підборі матеріалів з проблеми дезінфекції та зберігання води
в роботах [1,8]; Мусіна І.А. – допомога в оформленні патенту [7]. В
роботах [5,15] участь Мусіної І.А. полягає у виконанні частини
дослідження дії озону на стан гемоглобіну в еритроцитах, що не ввійшло
до даної дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на: VIII Українському біохімічному з’їзді
(м. Чернівці, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції
“Методи спектроскопії в спеціальних технологіях” (м. Київ, 2003 р.);
Міжнародній конференції з озонотерапії (м. Харків, 2003 р.); Конференції
“Сучасні проблеми науки та освіти” (м. Алушта, 2004 р.); Конференціях
молодих вчених Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
“Холод в біології і медицині”(м. Харків, 2004, 2005 р.р.); III
Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових
досліджень, 2004”
(м. Дніпропетровськ); І Українській науковій конференції “Проблеми
біологічної і медичної фізики” (м. Харків, 2004 р.); VIII Міжнародній
конференції “Клінічна мікробіологія і антибактеріальна терапія: проблеми
і рішення” (м. Харків, 2005 р.); І Всеросійській конференції „Озон и
другие экологически чистые окислители. Наука и технологии”
(м. Москва, Росія, 2005 р.); IV Українській науково-практичній
конференції з міжнародною участю “Современные аспекты применения озона в
медицине и экологии”
(м. Євпаторія, 2005 р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт: 2 у фахових
виданнях, 8 тез доповідей, 2 деклараційні патенти на винахід.
Обсяг та структура дисертації. Матеріали дисертації викладено на 146
стор., які включають 112 стор. основного змісту, 26 рисунків, 19
таблиць, список використаних джерел літератури у кількості 231 на 22
стор. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів
і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення,
аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження
Озон для досліджень отримували методом електросинтезу з кисню або з
повітря за допомогою установки, розробленої в ІПКіК НАН України разом з
Інститутом плазмової електроніки і нових методів прискорення
національного наукового центру „Харківський фізико-технічний інститут”.
Концентрацію озону у газовій фазі і водних розчинах вимірювали
спектрофотометричним методом, визначаючи екстинкцію на смузі Хартлі
(довжина хвилі 255 нм) за допомогою спектрофотометра Specord UV VIS.
У дослідженнях застосовували комерційні стандартні препарати: 1) бичий
сироватковий альбумін (БСА) фірми “SERVA”, Fraction V, мм 6700; 2)
ацетилхолінестеразу сироватки крові коня (ХЕ), КФ 3.1.1.8, VI клас
чистоти, стандартної активності 25 АО/мг, виготовлену Пермським НДІ
вакцин і сироватки. Концентрація білка і ферменту в розчинах складала
0,2 – 2 мг/мл.
Озон вводили у розчини БСА і ХЕ шляхом барботування розчинів
озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону від 6 до 8 мг/л.
Активність ферменту визначали за стандартною методикою
фотоколориметричним методом із субстратом бутирилтіохоліна йодидом
[Блажеєвський М.Є., 2002]. Фотоколориметричні вимірювання проводили на
довжині хвилі 400 нм.
Реєстрацію спектрів власної флуоресценції БСА і ХЕ проводили при довжині
лінії збудження 280 нм. Спектри поглинання біополімерів реєстрували в
діапазоні довжин хвиль 260 – 300 нм.
Спектральні дослідження проводили у термостатованих кюветах при
температурі (22+10С).
Дослідження біополімерів проводили оптичними методами за допомогою
спектрофотометрів Specord UV VIS (Німеччина) і Pye Unicam SP – 8000
(Англія), а також методами спектрофлуориметрії на приладах F – 4010
(фірма “Hitachi”, Японія) і Cary Eclipse (фірма Varian, США).
В дослідженнях використовували донорську кров людини, отриману із
Харківської обласної станції переливання крові. Еритроцити відділяли від
плазми шляхом центрифугування крові протягом 5 – 10 хвилин при 1500 –
2000 об/хв., далі клітини суспендували у фізіологічному розчині.
Чутливість еритроцитів до гіпертонічного шоку визначали
спектрофотометричним методом шляхом вимірювання виходу гемоглобіну в
позаклітинне середовище і виражали у відсотках по відношенню до
загальної кількості гемоглобіну у вихідній суспензії клітин.
Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ – 4А при довжині хвилі 543
нм. Для визначення 100 % гемолізу еритроцити руйнували тритоном Х – 100
(0,1 %).
Кріоконсервування еритроцитів здійснювали за методикою Воротіліна А.М. з
кріопротектором “Пропандіосахароль” [Воротилин А.М., 1987].
Заморожування еритроцитів проводили шляхом занурення зразків у рідкий
азот у спеціальних чохлах [Воротилин А.М., 1987]. Відігрівали зразки у
два етапи: перший етап – повільне відігрівання від –1960C до –1000C
зі швидкістю 50С/хв.; другий етап – відігрівання у водяній бані при 42
– 450C .
Для досліджень використовували культури бактерій Escherichia coli, штам
B (із Російської колекції промислових мікроорганізмів ДНДІ генетики,
Москва) і Staphylococcus aureus, штам 209 (із колекції Харківського
інституту імунології, вакцин і сироваток АМН України), Bacillus subtilis
АТСС 6633 і дріжджоподібні гриби Candida albicans АТСС 835-653 (2
останніх штами отримані із колекції АОЗТ “Здоров’я”, Харків).
Культури бактерій Escherichia coli і Staphylococcus aureus вирощували
на м’ясопептонному агарі (МПА) при температурі 370C протягом 20 – 22
годин, дріжджоподібні гриби Candida albicans – на скошеному агарі
протягом 40 годин при температурі 300C [Лабинская В.С., 1978].
Аспорогенну форму бактерій Bacillus subtilis вирощували на скошеному
МПА при температурі 370C протягом 20 – 22 годин. Спорову форму бактерій
Bacillus subtilis отримували при культивуванні на “голодному агарі”
[Лабинская В.С., 1978] протягом 48 годин при температурі 370C.
Життєздатність мікроорганізмів оцінювали “чашковим методом Коха” за
кількістю макроколоній, які сформувалися на агаризованих середовищах
[Лабинская В.С., 1978]. Серійні розведення проводили у фізіологічному
розчині (0,9 % NaCl).
Культуру Escherichia coli вирощували на агаризованому середовищі МПА,
змивали і переносили у сольове середовище М9 з додаванням глюкози. Склад
середовища М9: на 1 л дистильованої води: Na2HPO4 – 6 г, KH2PO4 – 3 г,
NH4Cl – 1 г. Після автоклавування додавали: 10 мл 0,01М розчину CaCl2, 1
мл 1М розчину MgSO4, 5 мл 40% розчину глюкози; рН = 7,0 [Миллер Дж.,
1976]. Паралельно озонували середовище М9 шляхом барботування
озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л. Концентрація
розчиненого озону в середовищі складала 0,0013; 0,013; 0,062; 0,12;
0,35; 0,57 мг/л. В отримані розчини вносили суспензію бактерій із
розрахунку 107 клітин на 50 мл озонованого розчину. Бактерії
культивували в термостатованій качалці при температурі 370C, при
обертанні платформи зі швидкістю 100 об/хв. Час культивування після
внесення інокуляту становив 6 – 8 годин до початку стаціонарної фази
росту культури. В процесі культивування відбирали проби і будували
логарифмічні криві росту періодичних культур бактерій на підставі
вимірювання оптичної густини. Оптичну густину вимірювали на
фотоелектроколориметрі ФЭК – 56, використовуючи кювету об’ємом 1 мл і
зелений світлофільтр.
Кінцева концентрація озону в зразках Escherichia coli i Candida albicans
складала 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80 г/мл. Програмне заморожування
зразків мікроорганізмів Escherichia coli i Candida albicans проводили за
двома режимами: 20С/хв. від +180С до –700С з наступним зануренням у
зріджений азот на програмному заморожувачі “Cryoson SV” (Німеччина).
Після заморожування зразки діставали з азоту і відігрівали на водяній
бані при температурі 370C. Далі проводили висів бактерій на чашки Петрі.
Результати власних досліджень та їх обговорення
В роботі досліджено кінетику загибелі бактерій Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, спорової форми Bacillus subtilis, дріжджоподібних
грибів Candida albicans під дією озону в газовій фазі, в різноманітних
суспензійних середовищах і на поверхні міліпорових фільтрів у
зневодненому вигляді. В таблиці 1 подані результати дослідження у
вигляді залежності числа колонієутворюючих одиниць в 1 мл (КУО/мл) від
тривалого їх інкубування в озоно-повітряній суміші з концентрацією озону
6,8 мг/л при температурі 200C.
Як видно з наведених даних інактивація мікроорганізмів настає через 6
годин інкубації в газовому озоно-повітряному середовищі з концентрацією
озону 6,8 мг/л.
Аналогічні дослідження проводили з мікроорганізмами, що були висіяні в
рідинні середовища: дистильовану воду, фізіологічний розчин,
м’ясопептонний бульйон (МПБ) і бульйон Сабуро (для дріжджоподібних
грибів). На відміну від дії газоподібної озоно-повітряної суміші, повна
загибель мікроорганізмів в рідинних середовищах наставала протягом більш
короткого часу – приблизно через 60 хв. при барботуванні середовищ
озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л. На живильних
середовищах повної загибелі мікроорганізмів протягом цього часу не
відбувалось, можливо, внаслідок того, що ефективна концентрація озону
зменшується в результаті реакції з органічними сполуками середовища.
Таблиця 1
Життєздатність мікроорганізмів, нанесених на міліпорові фільтри після
інкубування їх протягом різного часу в озоно-повітряній суміші з
концентрацією озону 6,8 мг/л при 200С
Мікроорганізми Умови експерименту Час інкубації,
год Число
КУО / мл,
р
Escherichia
coli
контроль 1 (4,5±0,3)?108 –
дослід
(1,2±0,3)?108 >0,05
контроль 3 (1,2±0,2)?108 –
дослід
(7,6±0,3)?104 0,05
контроль 3 (2,1±0,4)?107 –
дослід
(4,6±0,3)?104 $ P ” I ? ? ? ? ? " $ N P > f!?”¶$ue'”.yyy/yyiiiiiiiiiiieTHTHTHTHTHTHTH
&
F
}iiiiiiissOeiiEEE1/4Oe°°°
$
`„?
AE
$
dha$
$
I
$
I
$
I
$
I
$
?????e**,?kd®
I
$
I
$
I
I
I
$
ріод характеризується часом накопичення озону та його поглинання
мікроорганізмами. Далі починається фаза швидкої загибелі за принципом
„доза-ефект”. При цьому нахил кінетичної кривої змінюється з часом.
Швидкість загибелі мікроорганізмів залежить від виду суспензійного
середовища. Найбільшу швидкість інактивації мікроорганізмів протягом
усього експерименту спостерігали при використанні для суспендування
клітин фізіологічного розчину.
Отримані результати доводять можливість використання озону як
стерилізуючого агенту для обробки кріобіологічного обладнання. Час
повної інактивації мікроорганізмів газоподібною озоно-повітряною сумішшю
становить 6 годин. Цей час збігається з часом холодної стерилізації
медичного інструментарію на існуючому промисловому обладнанні, де в
якості стерилізуючого газу використовується фосген або оксид етилену.
Перевага озону як робочого газу для стерилізації полягає в тому, що він
є екологічно чистим агентом.
Наступна група експериментів була присвячена дослідженню стимулюючої дії
малих доз озону (які на кілька порядків нижче за ті, що викликають
загибель мікроорганізмів) на ріст мікроорганізмів у нормальних
фізіологічних умовах.
На рис. 2 представлені кінетичні криві росту Escherichia coli при
додаванні різних доз озону в ростове середовище.
Рис. 2. Кінетичні криві росту періодичної культури бактерій Escherichia
coli при додаванні в ростове середовище різних доз озону (мг/л): 1 –
контроль (без озону); 2 – 0,0013; 0,013; 0,062; 3 – 0,35; 4 – 0,12; 5 –
0,57.
Примітка: різниця оптичної густини у порівнянні з кривою 1 (контроль)
і кривими 3, 4, 5 достовірна, між кривою 1 і кривою 2 недостовірна.
При малих дозах (0,062 мг/л та менше) кінетичні криві росту бактерій в
рамках похибки експерименту не відрізняються від кінетичної кривої для
мікроорганізмів у середовищі без озону. Ефект стимуляції росту бактерій
спостерігається при дозах озону від 0,12 до 0,35 мг/л. Дози озону 0,57
мг/л і вище викликають пригнічення росту бактерій.
Результати дослідження дії малих доз озону на відновлення
мікроорганізмів після заморожування до –1960С та подальшого відтавання
представлені в таблиці 2.
Таблиця 2
Життєздатність дріжджоподібних грибів Candida albicans після
заморожування в розчинах, які містять озон (озон додавали в ростове
середовище перед заморожуванням)
Режим заморо-жування % життєздатних клітин після заморожування в
середовищі з добавками різних доз озону
Контроль,
середови-ще без озону Доза озону, мг/л:
0,16
0,32
0,48
0,64
0,8
Одно-
ступеневий
47,8 ± 2,9
61,7 ± 2,9
*
66,9 ± 4,2
*
65,5 ± 4,7
*
61,2 ± 3,1
*
42,5 ± 5,7
**
Двох-
ступеневий 35,3 ± 3,1
56,7 ± 3,4
* 50,2 ± 5,0
* 33,9 ± 3,5
** 15,1 ± 1,2
* 3,4 ± 1,8
*
– середньоквадратичне відхилення;
* – різниця статистично достовірна (р0,05) у порівнянні з
контролем.
При заморожуванні дріжджоподібних грибів наявність озону в дозах 0,16 –
0,64 мг/л забезпечувала більш високу їх життєздатність після швидкого
заморожування. У зразках, заморожених за двохступеневим режимом, більш
високу життєздатність спостерігали при дозі озону 0,16 – 0,32 мг/л. При
дозах озону, більших, ніж 0,48 мг/л, життєздатність мікроорганізмів була
достовірно нижчою, ніж у контрольних зразках. Ефект підвищення
життєздатності дріжджоподібних грибів Сandida аlbicans після
заморожування-відтавання спостерігався при малих дозах озону. При цьому
величина дози, що викликає підвищення життєздатності клітин Сandida
аlbicans, є близькою до тої, яка викликає ефект стимуляції росту
бактерій Escherichia coli у нормальних фізіологічних умовах.
Вказаний стимулюючий ефект може мати практичне застосування у
кріобіології при розробці протоколів кріоконсервування біологічних
об’єктів для репарації ушкоджень, викликаних заморожуванням-відтаванням
біологічного об’єкту.
В роботі досліджено вплив малих доз озону на стійкість еритроцитів до
гіпертонічного лізису в умовах, які моделюють виникнення
гіперконцентрованих розчинів при заморожуванні. За руйнуванням клітин
спостерігали на підставі вимірювання гемолізу еритроцитів. На рис. 3
показані залежності ступеню гемолізу еритроцитів людини в розчинах з
різною концентрацією NaCl від часу інкубації клітин у цих середовищах
протягом 6 діб.
Рис. 3. Залежність гемолізу еритроцитів від часу інкубації при 40C в
середовищах з різною концентрацією хлористого натрію: А – 0,15 М NaCl; Б
– 0,85 М NaCl; В – 1 М NaCl; Г – 2 М NaCl у присутності різних доз
озону.
Примітки:
Дози введенного озону в мг/л: ???контроль (без озону); ?Д? 0,16 мг/л;
??? 0,32 мг/л; ?Ч? 0,48 мг/л.
Видно, присутність озону в дозі 0,16 мг/л уповільнює гемоліз еритроцитів
порівняно з цим показником для контрольного зразка клітин у середовищі
без озону.
Досліджено також вплив малих доз озону на гемоліз еритроцитів після
кріоконсервування з кріопротектором на основі 1,2-пропандіолу. Після
відтавання еритроцитів спостерігалось уповільнення гемолізу в
присутності озону, що, можливо, пов’язано зі зростанням еластичності
мембран еритроцитів при дії малих доз озону на клітини.
Як об’єкти для дослідження механізмів дії озону на біополімери були
використані білки ферментної і неферментної природи – ХЕ і БСА. На рис.
4. показані спектри власної флуоресценції БСА після барботування
розчинів БСА озоно-кисневою сумішшю протягом різного часу.
Рис. 4. Спектри власної флуоресценції БСА при барботуванні розчинів
БСА озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 7,0 мг/л протягом
різного часу. Час барботування у хвилинах: 1 – контроль; (без обробки
озоном); 2 – 0,5; 3 – 1; 4 – 2; 5 – 4; 6 – 6 хвилин. Довжина хвилі
збудження 280 нм.
Як можна бачити, після барботування розчину озоно-кисневою сумішшю
протягом 6 хвилин власна флуоресценція БСА не реєструється, що свідчить
про те, що під дією високої дози озону відбувається глибока деструкція
молекул цього білка. Згідно з описаними в літературі механізмами
взаємодії озону з органічними речовинами
[Разумовский С.Д., с соавт., 1974, 2000], деструкція біополімера
пов’язана з руйнуванням ароматичного кільця і подвійних С=С зв’язків.
Аналогічною була дія високих доз озону і на ХЕ. Така дія високих доз
озону на біополімери може бути одним із механізмів інактивуючого впливу
озону на мікроорганізми.
Навпаки, невеликі дози озону можуть призводити до активації ферменту. В
таблиці 3 представлені результати дослідження активності ХЕ в
присутності різних доз озону.
Таблиця 3
Залежність активності холінестерази від часу барботування водного
розчину холінестерази озоно-кисневою сумішшю. Концентрація озону – 7
мг/л, концентрація холінестерази – 8 мг/л
Час обробки, хв. Доза
озону, мг/л Активність, АО/мг,
До озонування (контроль) 0 23,0 ± 0,31
Після озонування:
0,5 хв. 0,20 29,0 ± 0,47
1 хв. 0,39 28,5 ± 0,01
2 хв. 0,60 19,6 ± 0,22
4 хв. 3,75 0
Примітка: ( ч – середнє арифметичне;
– середньоквадратичне відхилення
Видно, що під дією озону у малих дозах (час барботування 0,5 і
1 хв.) спостерігається активація ферменту. На нашу думку, це пов’язано з
конформаційними перебудовами макромолекули і зміною доступності
активного центру для субстратів ферментативної реакції. Цей ефект може
лежати в основі одного з механізмів стимуляції фізіологічної активності
біологічних систем малими дозами озону та активації репараційних
процесів в них після кріоушкодження.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі представлене теоретичне і експериментальне
узагальнення наукової проблеми, що відноситься до вдосконалення
технологічного циклу кріоконсервування біологічних об’єктів шляхом
інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду та зниження ризику
контамінації мікроорганізмами біологічних об’єктів з використанням
озону.
Показано, що озон при певних малих дозах виявляє здатність до активації
проліферативних процесів у мікроорганізмах у нормальних фізіологічних
умовах, а також до інтенсифікації репараційних процесів після
заморожування-відтавання. Підвищення дози озону призводить до
пригнічення росту мікроорганізмів впритул до повної інактивації.
Уперше експериментально показано, що озон у малих дозах спричиняє
стимулюючу дію на проліферативну активність мікроорганізмів Escherichia
coli в нормальних фізіологічних умовах та виявлено кількісні значення
цих доз.
Виявлено, що під дією малих доз озону в клітинах Сandida аlbicans
активізуються репараційні процеси ушкоджень, які виникли в процесі
заморожування-відтавання. Експериментально встановлені дози озону, при
яких активізується репарація кріоушкоджень. В той же час при збільшенні
доз озону в середовищі кріоконсервування при заморожуванні відбувається
додаткова загибель клітин дріжджоподібних грибів.
Виявлено, що у присутності малих доз озону збільшується стійкість
еритроцитів до гемолізу в гіпертонічних умовах, які виникають у процесі
кріоконсервування. Показано також, що при введені озону в
експериментально встановлених дозах у суспензію кріоконсервованих клітин
після їх відтавання гемоліз деконсервованих еритроцитів уповільнюється.
На прикладі бичого сироваткового альбуміну показано, що під дією озону у
високих дозах проходить глибока деструкція молекули БСА.
Експериментально доведено, що ферментативна активність
ацетилхолінестерази зростає в присутності озону в малих дозах і
знижується майже до повної інактивації ферменту при перевищенні певного
значення дози.
На підставі дослідження кінетики інактивації озоном мікроорганізмів
(бактерій у вегетативній і в споровій формах та дріжджоподібних грибів)
установлено час, який необхідний для їх повної інактивації за допомогою
газоподібної озоно-повітряної і озоно-кисневої суміші на сухих поверхнях
і в рідинних середовищах.
Експериментально встановлені умови обробки озоно-повітряною сумішшю
кріобіологічного обладнання (час обробки та концентрація озону), за яких
озоно-повітряна суміш у газовому стані може використовуватись як
ефективний стерилізуючий агент.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Бєлих І., Ковальчук І., Сахаров Г., Каднікова Н. Екологічні та
біохімічні аспекти знезаражування води озоном // Вісник Львівського
Університету, серія хімічна. – вип. 42, ч. 2. – 2002. – С. 259–261.
Белых И.А., Дюбко Т.С., Зинченко В.Д. Изучение влияния озона на
сывороточный альбумин и холинэстеразу методами оптической спектроскопии
// Вісник ХНУ “Біофізичний вісник”, 2 (13), Харків, 2003.– С.104 – 110.
Белых И.А., Зинченко В.Д., Высеканцев И.П. Стимулирующее действие малых
доз озона на рост микроорганизмов // Проблемы криобиологии. – № 4. –
2004. – С. 41 – 45.
Белых И.А. Влияние озонированных сред инкубирования и культивирования
на кинетику роста и отмирания периодической культуры Escherichia coli
// Актуальные проблемы медицины и биологии. – № 1. – 2004. – С. 397 –
402.
Зинченко В.Д., Белых И.А., Мусина И.А. Озоновые методы в криобиологии //
Проблемы криобиологии. – Т. 15, № 3. – 2005. – С. 286 – 289.
Пат. № 67671, Україна МПК7 F24F3/16. Заявл. 05.11.2003; Опубл.
15.06.2004; Бюл. № 6 / Пристрій для санітарно-гігієнічної обробки
повітря. Зінченко В.Д., Гузій Ю.І., Голота В.І., Сухомлин Є.О.,
Ковальчук І.М., Бєлих І.А. – 3с.
Пат. № 8660, Україна МПК7 С12N1/38 Заявл.: 02.02.2005,
№ 200500928; опубл. 15.08.2005. Бюл. № 8 / Спосіб підвищення
проліферативної активності мікроорганізмів. Грищенко В.І., Висеканцев
І.П., Зінченко В.Д., Бєлих І.А., Мусіна І.А. – 2 с.
Бєлих І.А., Зінченко В.Д., Зінченко О.В., Сахаров Г.В. Взаємодія
сироваткового альбуміну людини з озоном // Український біохімічний
журнал, т. 74, спец. випуск. Матеріали VIII Українського біохімічного
з’їзду, Чернівці, Україна, 2002. – С. 21.
Belyh I.A., Zinchenko V.D. and Dyubko T.S. Ozone influence on
cholinesterase study by optical spectroscopy methods // Book of
Abstracts International Scientific and Practical conference
“Spectroscopy in special Applications”, Kyiv, Ukraina, 2003. –
Р. 54.
Белых И.А., Высеканцев И.П., Зинченко В.Д., Казанжан С.В. Влияние
озонированной питательной среды на кинетику роста и отмирания культуры
Escherichia coli // Збірник наукових робіт ІІІ Української
науково-практичної конференції з міжнародною участю „Місцеве та
парентеральне використання озонотерапії в медицині”, Харків, Україна,
2003. – С. 42.
Зинченко А.В., Зинченко В.Д., Высеканцев И.П., Белых И.А. Действие малых
доз озона на биологические системы // Сучасні проблеми науки та освіти,
матеріали конференції, 2004, Алушта, Україна. – С. 78.
Белых И.А. Влияние озона на каталитическую активность холинэстеразы //
Матеріали ІІІ Міжнародної науково-практичної конференції “Динаміка
наукових досліджень, 2004”, т. 32, Біологічні науки. – Дніпропетровськ:
Наука і освіта, 2004. – С. 69 – 71.
Белых И.А., Дюбко Т.С., Зинченко В.Д. Исследование действия различных
доз озона на бычий сывороточный альбумин и холинэстеразу оптическими
методами // І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і
медичної фізики”, тези доповідей, ХНУ ХДМУ, Харків, Україна. – 2004. –
С. 68.
Зинченко В.Д., Грищенко В.И., Высеканцев И.П., Белых И.А. О применении
озона в технологическом цикле криоконсервирования биологических объектов
// Материалы первой всероссийской конференции „Озон и другие,
экологически чистые окислители. Наука и технологии”, посвященная
250-летию МГУ им. М.В. Ломоносова, Изд-во: Книжный дом Университета,
Москва, Россия, 2005.– С. 217.
Зинченко В.Д., Мусина И.П., Высеканцев И.П., Зинченко А.В., Белых И.А. О
влиянии озона на репарационные процессы в биологических объектах после
действия холода // Сборник научных работ IV Украинской
научно-практической конференции с международным участием, Евпатория,
Украина, 2005. – С. 33 – 34.
Анотація
Бєлих І.А. „Дія озону на біополімери та озонові методи в
кріобіології”. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.19. – кріобілогія. – Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, Харків, 2006.
Дисертаційну роботу присвячено вивченню впливу різних доз озону на
біологічні об’єкти.
В роботі експериментально досліджено два аспекти застосування озону в
кріобіології: як стерилізуючого агенту для кріобіологічного обладнання і
з метою стимуляції репарації нелетальних кріоушкоджень.
Культивування бактерій Escherichia coli в озонованому середовищі М9 при
дозах озону 0,12 – 0,35 мг/л призводить до росту швидкості поділу
бактерій у другій половині логарифмічної фази і до виходу в стаціонарну
фазу росту при більш високій концентрації бактерій при порівнянні з
контролем. Дози озону 0,16 – 0,64 мг/л сприяють репарації
проліферативних процесів дріжджоподібних грибів Candida albicans після
заморожування-відтавання.
Виявлено, що у присутності озону в дозах 0,16 – 0,48 мг/л збільшується
стійкість еритроцитів до гемолізу в гіпертонічних умовах і при
кріоконсервуванні еритроцитів.
На прикладі біополімерів ферментної та не ферментної природи
(холінестерази і бичого сироваткового альбуміну) показано, що озон в
високих дозах (більше 0,3 г озону на 1 г біополімеру) призводить до
деструкції біополімеру, що може бути поясненням одного з можливих
механізмів знешкодження мікроорганізмів озоном. Уся сукупність отриманих
результатів може бути використана в кріобіології при розробці нових
протоколів консервування біологічних об’єктів.
Ключові слова: озон, кріоконсервування, флуоресценція,
ацетилхолінестераза, бичий сироватковий альбумін, конформаційні
змінення, мікроорганізми, гемоліз.
Аннотация
Белых И.А. „Влияние озона на биополимеры и озоновые методы в
криобиологии”. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.19. – криобиология. – Институт проблем криобиологии
и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2006.
Диссертационная работа посвящена изучению влияния различных доз озона на
биологические объекты.
В работе экспериментально исследовано два аспекта применения озона в
криобиологии. Способность озона в высоких дозах проявлять инактивирующее
действие на микроорганизмы представляет интерес с точки зрения
применения озона в качестве стерилизующего агента для криобиологического
оборудования, которое тяжело стерилизовать другими способами, причем,
время стерилизации озоном сопоставимо со временем стерилизации при
помощи других известных газовых методов (6–7 часов). На питательных
средах полного отмирания микроорганизмов в течение этого же времени не
происходило, что скорее всего, связано с уменьшением эффективной
концентрации озона вследствие его реакции с органическими веществами
сред.
Исследовали влияние озонированных инкубационных сред на жизнеспособность
бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus, споровой формы
бактерий Bacillus subtilis, дрожжеподобных грибов Candida albicans.
Инкубирование в озонированных физиологическом растворе, дистиллированной
воде и мясопептонном бульоне (МПБ) при концентрации озона 6,8 мг/л
приводило к гибели клеток, причем скорость гибели зависела как от
времени инкубирования, так и от состава инкубационной среды. В отличие
от обработки микроорганизмов газообразной озоно-воздушной смесью полная
гибель микроорганизмов в жидких средах происходила в течение более
короткого времени – за 60 мин при барботировании сред озоно-кислородной
смесью с концентрацией озона 6,8 мг/л. Наиболее быстрая гибель
микроорганизмов наступала в физиологическом растворе.
Другой аспект использования озона в криобиологии связан со стимулирующим
действием малых доз озона на функцию биологических систем
(микроорганизмов, эритроцитов, ферментов) в нормальных физиологических
условиях, а также после замораживания–оттаивания с целью репарации
нелетальных повреждений. Культивирование бактерий Escherichia coli в
озонированной среде М9 при дозе озона 0,12 – 0,35 мг/л приводит к росту
скорости деления бактерий во второй половине логарифмической фазы и к
выходу в стационарную фазу роста при более высокой концентрации бактерий
по сравнению с контролем. Дозы озона 0,16 – 0,64 мг/л способствуют
репарации пролиферативных процессов дрожжеподобных грибов Candida
albicans после замораживания-оттаивания.
Обнаружено, что в присутствии озона в дозах 0,16 – 0,48 мг/л повышается
устойчивость эритроцитов к гемолизу в гипертонических условиях, которые
моделируют гиперконцентрированные среды, возникающие в процессе
криоконсервирования. При введении озона в суспензию клеток после их
оттаивания гемолиз деконсервированных эритроцитов замедлялся.
На примере биополимеров ферментной и неферментной природы (холинэстеразы
и бычьего сывороточного альбумина) показано, что озон в высоких дозах
(больше 0,3 г на 1 г биополимера) вызывает деструкцию биополимера, что
может служить объяснением одного из возможных механизмов обезвреживания
микроорганизмов озоном. Вся совокупность полученных результатов может
быть использована в криобиологии при разработке новых и оптимизации
существующих протоколов криоконсервирования биологических объектов.
Экспериментально показано, что ферментативная активность холинэстеразы
возрастает в присутствии озона в малых дозах (0,1 мг/л) и снижается
вплоть до полной инактивации фермента при превышении оптимального
значения дозы. Показано, что один из возможных механизмов повышения
активности фермента состоит в том, что под действием озона происходят
конформационные изменения макромолекулы холинэстеразы и облегчается
доступность ее активного центра для субстрата.
В основу методов применения малых доз озона в криобиологии может быть
положено использование свойства озона способствовать стимуляции
репаративных процессов в биологических объектах после криовоздействий.
Метод применения высоких доз озона в криобиологии может быть реализован
при стерилизации низкотемпературных хранилищ большого объема и со
сложной поверхностью газообразным озоном в сочетании с увлажненной
озоно-воздушной смесью.
Ключевые слова: озон, криоконсервирование, флуоресценция,
ацетилхолинэстераза, бычий сывороточный альбумин, конформационные
изменения, микроорганизмы, гемолиз.
Annotation
Belyh I.A. “The influence of ozone on biopolymers and ozone methods in a
cryobiology”. –
A manuscript.
Dissertation for the candidate of biological sciences in specialty
03.00.19. – Cryobiology. – Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine of the National Academy of sciences of Ukraine, Kharkov,
2006.
The dissertation is dedicated to analysis of the influence of different
doses of ozone on biological objects.
In the activity two aspects of an application of ozone in a cryobiology
are investigated experimentally. The capacity of ozone in high doses for
showing of an inactivating operation on microorganisms is an interest
for the application of ozone as the sterilizing agent for cryobiological
equipment, which one is high-gravity for sterilization by other ways.
The other aspect of usage of ozone in a cryobiology is connected with a
stimulant effect of small doses of ozone on a function of biological
systems after freezing-thawing with the purpose of a reparation of not
lethal damages.
The cultivation of bacterias Escherichia coli in ozonized medium М9 at
a dose of ozone of 0,12 – 0,35 mg/l results in growth of a velocity of
division of bacterias in the second half of logarithmic phase and
entrance in to a fixed phase at higher concentration of bacterias in
comparison with control. The doses of ozone of 0,16 – 0,64 mg/l promote
a reparation of proliferative processes of yeast-like funguses Candida
albicans after freezing –thawing.
It is revealed, that at the presence of ozone in doses of 0,16 – 0,48
mg/l is improved stability of erythrocytes to a haemolysis in hypertonic
conditions, and also in real conditions of a cryopreservation of
erythrocytes.
The ozone in high doses (ore than 0,3 g on 1 g of a biopolymer) provokes
a destruction of a biopolymer, that can serve explanation one of
possible gears of a decontamination of microorganisms by ozone. We can
see that on an example of biopolymers of the ferment and not ferment
nature (cholinesterase and bovine serum albumin). The whole complex of
the obtained outcomes can be utilized in a cryobiology at a composition
of the new modes of the cryopreservation biological objects.
Key words: ozone, cryopreservation, fluorescence, acetylcholinesterase,
bovine serum albumin, conformations changes, microorganisms, haemolysis.
Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук
Підписано до друку 24.01.2006 р. Формат 60Ч84 1/16. Папір офсетний.
Друк на різографі. Умов. Друк. Арк. 0,9. Наклад 100 прим.
ЧП Ходикін
Проспект 50 років ВЛКСМ, 49/8, м. Харків
тел. 8-0572-62-60-59
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
