АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ
БЕРЕЖНА Лідія Григорівна
УДК 615.9: 615.281
Роль індукції цитохрому Р-450 2е1 в патогенезі гепатотоксичності
ізоніазиду
14.03.06 – токсикологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в
Інституті фармакології та токсикології АМН України
Науковий керівник доктор біологічних наук, професор КОВАЛЕНКО Валентина
Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач
відділом загальної токсикології
Офіційні опоненти доктор медичних наук ЛІТВІНОВА Надія Володимирівна,
Інституті фармакології та токсикології АМН України, головний науковий
співробітник відділу біохімічної фармакології
доктор біологічних наук ЛЕОНЕНКО Ольга Броніславівна, Інститут медицини
праці АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії
медико-біологічних критеріїв виробничих впливів
Провідна установа Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя
МОЗ України
Захист дисертації відбудеться 11.10.2006 р. о 15 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та
токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).
Автореферат розісланий 09.09.2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
Д 26.550.01
кандидат біологічних наук
І.В. Данова
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження останніх десятиріч показали, що система
цитохромів Р-450 печінки відіграє провідну роль у біотрансформації
великої кількості хімічних речовин як ендогенного, так і екзогенного
походження. В результаті реакцій за участі монооксигеназної системи
досить часто утворюються високореактивні токсичні інтермедіати, які не
знешкоджуються в реакціях кон’югації у другій фазі метаболізму. Це є
причиною пошкодження печінки за дії значної кількості ксенобіотиків, що
піддаються біотрансформації із залученням цитохрому Р-450 [D.P.
Josephy, P.F. Guengerich, J.O. Miners, 2005].
З огляду на високу індуцибельність, важлива роль в механізмах токсичної
дії речовин на печінку належить етаноліндукованій ізоформі цитохромів –
цитохрому Р-450 2Е1 (CYP 2E1) [G. Ekstrom, M. Ingelman-Sundberg,
1999]. За його участі відбувається біотрансформація ряду
низькомолекулярних речовин, що належать до класів спиртів, альдегідів,
кетонів, багатьох ароматичних сполук, включаючи фармакологічні засоби –
парацетамол, хлорзоксазон, теофілін та ін. При цьому утворюються,
здебільшого, реакційноздатні метаболіти, які взаємодіють з
макромолекулами гепатоцитів, викликаючи різноманітні порушення їх
структури та функціонування [S. Zhou et al., 2005]. Крім того відомо,
що активація CYP 2E1 супроводжується утворенням активних форм кисню,
здатних призводити до модифікації структури макромолекул та стимулювати
перекисне окиснення ліпідів [S. Tafazoli, D.D. Spehar, P.J.
O’Brien, 2005].
Існує припущення, що до індукторів CYP 2E1 належить ізоніазид – гідразид
ізонікотинової кислоти – фармакологічний засіб, який широко
застосовується для профілактики та лікування туберкульозу
[T.V. Brody, J. Larner, K.P. Minnevan, 1998]. Встановлено, що у 10-20 %
пацієнтів, які приймають ізоніазид протягом тривалого часу, мають місце
ушкодження печінки, а у 20 із 1000 осіб формується блискавичний гепатит,
який може призводити до фатальних наслідків [M.F. Stewart, A.J.
Freemont, T. Richardson, 1995]. Вважають, що молекулярною основою
ушкодження клітин печінки може служити утворення реактивних
інтермедіатів одного з метаболітів ізоніазиду, ацетилгідразину, в
результаті його активації за участю системи CYP 2E1 [J.A. Timbrel,
1991]. Однак, є дані протилежного характеру, за якими ізоніазид виступає
інгібітором ряду ізоформ цитохрому Р-450, включаючи CYP 2E1
[Y. Nishimura et al., 2001].
Враховуючи суперечливість даних літератури, а також відсутність
досліджень, що доводять наявність залежності між активацією CYP 2E1 та
механізмами токсичного впливу ізоніазиду на печінку, цілком доцільним є
проведення цілеспрямованих досліджень для встановлення можливого зв’язку
між гепатотоксичністю ізоніазиду та його метаболізмом за участю CYP 2E1.
Це може послужити підґрунтям для розробки засобів профілактики та
терапії гепатотоксичної дії ізоніазиду та інших речовин, включаючи
лікарські засоби, біотрансформація яких здійснюється із залученням CYP
2E1.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну
роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт
Інституту фармакології та токсикології АМН України в межах теми
“Вивчення механізмів біотрансформації фармакологічних речовин з ряду
ароматичних сполук, які метаболізують за допомогою цитохрому Р-450 2E1
та обґрунтування напрямків зниження їх токсичності шляхом корекції
обміну в печінці” (№ державної реєстрації 0100U000297).
Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити участь
CYP 2E1 в патогенезі гепатотоксичної дії ізоніазиду та обґрунтувати
шляхи її корекції.
Завдання дослідження:
Дослідити стан монооксигеназної системи печінки щурів за умов уведення
ізоніазиду окремо та сумісно з індукторами CYP 2E1 (рифампіцин та
етиловий спирт).
Встановити вплив специфічного інгібітора CYP 2E1, дисульфіраму, на
монооксигеназну систему, процеси перекисного окиснення в печінці щурів,
біохімічні та морфологічні показники гепатотоксичності за дії
ізоніазиду.
Дослідити наявність кореляційної залежності між індукцією CYP 2E1 та
критеріальними показниками ушкодження печінки.
Вивчити стан монооксигеназної, антиоксидантної систем печінки та
гепатопротекторні властивості експериментальної полівітамінної
композиції “МВ” за умов застосування у щурів ізоніазиду окремо, сумісно
з рифампіцином або на тлі індукції CYP 2E1 етиловим спиртом.
Об’єкт дослідження. Лікарські засоби, що проявляють гепатотоксичну дію.
Предмет дослідження. Індукція CYP 2E1 ізоніазидом та її місце в
патогенезі його гепатотоксичної дії.
Методи дослідження. В роботі використано токсикологічні, біохімічні,
фармакологічні, морфологічні та статистичні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше експериментально
встановлено наявність прямої кореляційної залежності між збільшенням
активності фермента-маркера CYP 2E1 – n-нітрофенолгідроксилази та
критеріальними показниками гепатотоксичності за дії ізоніазиду. На
прикладі дисульфіраму показано здатність інгібіторів CYP 2E1 попереджати
розвиток ушкоджень печінки щурів. Встановлено властивість полівітамінної
композиції метаболічної дії “МВ” знижувати ступінь індукції CYP 2E1,
проявляючи при цьому гепатопротекторні властивості за умов ушкодження
печінки ізоніазидом в експерименті.
Практичне значення роботи. Експериментально обґрунтовано доцільність
використання інгібіторів CYP 2E1 для зменшення гепатотоксичних
властивостей ізоніазиду.
Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес на
кафедрах фармакології Національного медичного університету
ім. О.О. Богомольця, Вінницького національного медичного
університету ім. М.І. Пирогова, Луганського державного медичного
університету, Тернопільського державного медичного університету ім.
І.Я. Горбачевського, на кафедрі військової токсикології, радіології та
медичного захисту військово-медичного інституту Української
військово-медичної академії.
Особистий внесок здобувача. Робота з першоджерелами, планування етапів
експерименту, проведення експериментальних досліджень, статистична
обробка та аналіз отриманих даних виконані здобувачем самостійно.
Морфологічні дослідження виконані за консультативної допомоги кандидата
медичних наук О.В. Сергієнко та кандидата медичних наук А.В. Матвієнко
(Інститут фармакології та токсикології АМН України).
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідались на міжнародній науково-практичній конференції молодих
вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2005р.); II науково-практичній
конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми
фармакології та токсикології” (Київ, 2005р.); міжнародній конференції
“16th European Students Conference” (Берлін, 2005р.); міжнародній
конференції “42nd Congress of the European Societies of Toxicology
Eurotox” (Краків, 2005р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з
них 5 статей у фахових журналах та 4 тези доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд
літератури, опис матеріалів та методів досліджень, 4 розділи власних
досліджень, аналіз отриманих даних, висновки, список використаних
джерел. Дисертаційна робота викладена на 130 сторінках машинопису.
Роботу ілюстровано 19 рисунками та 17 таблицями. Бібліографія включає
197 джерел, з них 153 іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Експерименти проведено на 214
статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар з масою тіла 160-200 г,
вирощених у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України.
Тварини утримувались на стандартному раціоні віварію з вільним доступом
до їжі та води.
В роботі використано: субстанцію ізоніазиду виробництва ЗАТ
Фармацевтична фірма “Дарниця” (Україна), рифампіцин виробництва
фармацевтичного заводу “POLFA”А.О. (Польща), дисульфірам фірми Sigma
(Німеччина), піридоксину гідрохлорид, метіонін та композицію “МВ” надано
АТ “Київський вітамінний завод”.
Експериментальні моделі ураження печінки, використані в дослідженні,
представлено в табл. 1. Для моделювання експериментального
медикаментозного гепатиту щурам внутрішньоочеревинно вводили ізоніазид у
дозі 100 мг/кг маси тіла [С.М. Дроговоз, Ю.І. Губський, 2001] або
ізоніазид у дозі 50 мг/кг та рифампіцин у дозі 86 мг/кг маси тіла щурам
– внутрішньошлунково, виходячи з дозових рівнів при їх застосуванні в
клініці [В.М. Петренко, 2002]. Дисульфірам, інгібітор CYP 2E1, вводили у
дозі 30 мг/кг, виходячи з дози його застосування в клініці при
алкоголізмі [C. Dollery, 1999]. Композицію “МВ” вводили щурам
внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг маси тіла. У якості препаратів
порівняння використовували антидот ізоніазиду піридоксин [M. Sievers,
L. Chin, 1992] та метіонін, що є одним з основних складників композиції
“МВ”. Піридоксину гідрохлорид і метіонін щурам вводили
внутрішньошлунково у дозах 5 мг/кг та 60 мг/кг маси тіла, відповідно.
Дози препаратів порівняння та компонентів експериментальної композиції
“МВ” (метіонін, б-токоферол, піридоксин, нікотинамід, фолієва кислота,
тіамін, цианкобаламін, цинку сульфат) розраховували, виходячи з добових
доз, що застосовуються в медичній практиці [Ф.П. Тринус, 1994]. Всі
вищезазначені дози досліджуваних засобів було обчислено з урахуванням
коефіцієнту видової чутливості [Ю.Р. Рыболовлев, Р.С. Рыболовлев, 1979].
Експериментальний алкоголізм моделювали згідно Ю.В. Бурова та
Н.Н. Вередникова [1985]. Щурам контрольної групи вводили 0,9 %
розчин NaCl, шлях введення – відповідно до експериментальної моделі.
Через 24 год. після останнього введення досліджуваних засобів у тварин
під легким наркозом діетиловим ефіром відбирали кров зі стегнової вени
та піддавали евтаназії шляхом цервікальної дислокації. Печінку відмивали
через воротну вену 0,15 М розчином КСl, виділяли мікросомну фракцію
печінки за методом S.A. Kamath та F.A. Kummerow [1971].
Постмітохондріальну фракцію печінки щурів отримували за методом І.І.
Карузіної та А.І. Арчакова [1977]. Усі процедури виконували з
дотриманням холодового режиму ( +4 0С).
Стан монооксигеназної системи печінки оцінювали за вмістом цитохромів
Р-450 та b5 [T. Omura, R. Sato, 1964], n-нітрофенолгідроксилазною [D.R.
Koop, 1990] та анілін-N-гідроксилазною [И.И. Карузина, А.И. Арчаков,
1977] активністю в мікросомній або постмітохондріальній фракціях
печінки.
В мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки досліджували
швидкість НАДФН- та аскорбат-залежного утворення продуктів реакції з
тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977]. В
гомогенаті печінки визначали вміст білкових та небілкових (глутатіон)
SH-груп [J. Sedlak, R. Lindsay, 1968].
У гомогенаті, постмітохондріальній фракції та фракції мікросом печінки
визначали вміст білку [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough et al., 1951].
Активність аланін- (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), лужної
фосфатази (ЛФ), вміст загального білірубіну в сироватці крові визначали
за допомогою біотестів виробництва НПП “Филисит-Диагностика” (Україна)
та фірми PLIVA – Lachema a.s. (Чехія).
Обчислювали відносну масу печінки. Для гістологічного вивчення зрізи
печінки забарвлювали гематоксиліном і еозином за методикою М.Г. Шубича
[1965]. Аналіз препаратів здійснювали за допомогою мікроскопа Leica,
(Німеччина).
Таблиця 1
Експериментальні моделі індукції та інгібування цитохрому Р-450 2Е1 у
щурів
Експериментальні моделі
Досліджуваний засіб
Референтні засоби
Дисульфірам, 30 мг/кг, внутрішньошлунково + ізоніазид, 100 мг/кг,
внутрішньоочеревинно, через 3 години після
введення дисульфіраму, 14 днів.
–
–
Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньочеревинно, раз на добу, 28 днів.
композиція “МВ”
50 мг/кг, 28 днів
піридоксину гідрохлорид
5 мг/кг, 28 днів
Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньошлунково + рифампіцин, 86 мг/кг,
внутрішньошлунково, 28 днів.
композиція “МВ”
50 мг/кг, 28 днів
піридоксину гідрохлорид,
5 мг/кг, 28 днів
метіонін, 60 мг/кг,
28 днів
Водний 15%-вий розчин етанолу без обмежень, 4 місяці + ізоніазид,
50 мг/кг, внутрішньошлунково, раз на добу, останні 28 днів.
композиція “МВ”
50 мг/кг, 28 днів
піридоксину гідрохлорид,
5 мг/кг, 28 днів
метіонін, 60 мг/кг, 28 днів
Розраховували коефіцієнт кореляції (r). Результати піддавали
статистичній обробці та представляли у вигляді середнього арифметичного
(М) і стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної
вибірки (n). Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних
показників оцінювали за t- критерієм Ст’юдента. Зміни вважали
статистично вірогідними при р?O
2
6
\
h
j
j
l
&
F
&
&
&
`„7
9
:
9
:
9
:
9
:
9
:
”y!
”y!
$a$
???”y
”y
„7]„thy`„7a$
ву роль в системі антиоксидантного захисту клітин [S.C. Lu, 1998].
б-Токоферол, реагуючи з пероксид-радикалами ліпідів, взаємодіючи
безпосередньо з синглетним молекулярним киснем, діє як антиоксидант [Е.
HYPERLINK
"http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/search/r?./temp/~Uk981W:@and+@au+
@term+Herrera+E" Herrera, С. HYPERLINK
"http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/search/r?./temp/~Uk981W:@and+@au+
@term+Barbas+C" Barbas, 2001] та як мембранопротектор, взаємодіючи з
компонентами мембран, що забезпечує їх стабілізацію [П.Дж. Квинн, 2004].
Нікотинамід, безпосередньо взаємодіючи з цитохромом Р-450 та з
гідроперекисами ліпідів з утворенням N-оксиду нікотинаміду, знижує,
таким чином, рівень процесів ПОЛ в мікросомах [A.B. Weitberg, 1999]. Не
менш важливу роль нікотинамід відіграє у складі НАД·Н та НАДФ·Н, що є
універсальними донорами електронів в реакціях енергообміну в
мітохондріях, окиснення-відновлення в мікросомах тощо. Піридоксин,
цианкобаламін, фолієва кислота та нікотинамід – необхідні коферменти в
процесі синтезу глутатіону з метіоніну та обміну цієї амінокислоти [H.
Refsum еt al., 1998]. Тіамін – за умов його нестачі зростає рівень
індукції CYP 2E1 [J.S. Yoo et al., 1990]. За даними Y.J. Kang, Z. Zhou
[2005] цинк пригнічує активацію CYP 2E1 в печінці і, як відомо, входить
до активного центру ряду важливих ферментів, зокрема,
супероксиддисмутази, яка забезпечує утилізацію радикалів кисню [Hassan
H.M., 1998].
На основі вищезазначених сполук було розроблено експериментальну
полівітамінну композицію “МВ”, яка, на наш погляд, здатна проявляти
гепатопротекторні властивості шляхом корегуючого впливу на відповідні
ланки патогенезу ушкодження печінки індукторами CYP 2E1.
Внутрішньошлункове введення щурам композиції “МВ” у дозі 50 мг/кг маси
тіла на тлі ксенобіотиків сприяло зниженню активності
n-нітрофенолгідроксилази в мікросомах печінки на 30 - 50 %, залежно від
експериментальної моделі (рис. 3 А), що свідчить про здатність
композиції значною мірою попереджати індукцію етанолзалежної ізоформи
CYP 2E1.
Композиція “МВ”, уведена внутрішньошлунково щурам в дозі 50 мг/кг маси
тіла за аналогічних експериментальних умов, сприяла нормалізації
загального вмісту цитохрому Р-450 та проявила антиоксидантні
властивості, знижуючи швидкість індукованого ПОЛ в мікросомах печінки
щурів в середньому на 30 % (рис. 3 Б).
Крім того, введення композиції “МВ” на тлі ізоніазиду запобігало
зниженню вмісту SH-груп білків в гомогенаті печінки, що може свідчити
про здатність компонентів композиції захищати сульфгідрильні групи від
окисної модифікації та ушкодження інтермедіатами ізоніазиду.
Рис. 3 Вплив композиції “МВ” та референтних препаратів - піридоксину
гідрохлориду і метіоніну на n-нітрофенолгідроксилазну активність (А) і
швидкість індукованого утворення ТБК-реактантів (Б) мікросом печінки
щурів за умов уведення ізоніазиду в дозі 50 мг/кг окремо протягом 28
днів, сумісно з рифампіцином (86 мг/кг) або на тлі експериментального
алкоголізму, нмоль/хв ( мг білка (n = 6)
Примітки:
1. 1 – ізоніазид; 2– ізоніазид + піридоксину гідрохлорид; 3 -
ізоніазид + композиція “МВ”; 4 - ізоніазид + рифампіцин; 5 – ізоніазид
+ рифампіцин + піридоксину гідрохлорид; 6 – ізоніазид + рифампіцин +
метіонін; 7 – ізоніазид + рифампіцин + композиція “МВ”; 8 – ізоніазид +
етанол; 9 – ізоніазид + етанол + піридоксину гідрохлорид; 10 – ізоніазид
+ етанол + метіонін; 11 – ізоніазид + етанол + композиція “МВ”;
2. * - рТаблиця 5
Вплив композиції “МВ” та референтних засобів на вміст загального
білірубіну (ммоль/л) сироватки крові щурів за умов індукції CYP 2E1 (M
+ m; n ( 6)
Експериментальні групи
Контроль
Індукція
CYP 2E1 Індукція
CYP 2E1 + піридоксину гідрохлорид
Індукція
CYP 2E1+ метіонін Індукція
CYP 2E1+ композиція “МВ”
Ізоніазид, внутрішньоочеревинно у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів
2,50 ( 0,36
7,75(0,52*
6,80(0,70
-
4,30(0,41**, х
Ізоніазид + рифампіцин, внутрішньошлунково у дозах 50 мг/кг та 86 мг/кг,
відповідно, протягом 28 днів
2,00 ( 0,73
14,87(1,21*
13,40(1,02
12,7(1,27
8,75(0,96**, х, хх
Ізоніазид, внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на тлі
експериментального алкоголізму
2,00 ( 0,45
9,00(1,20*
8,50(1,36
7,33(1,02**
3,80(0,90**, х, хх
Примітки:
1. * - р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
