МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
БРИЧ ОКСАНА ІВАНІВНА
УДК 616.9.579.843.94 – 02
Етіологічна роль haemophilus influenzae в захворюваннях осіб різного
віку
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб імені
Л.В. Громашевського АМН України.
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор
Сельнікова Ольга Петрівна
Інститут епідеміології та інфекційних
хвороб
імені Л.В. Громашевського АМН
України, директор.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України
Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології та вірусології
імені Д.К.Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник
відділу фізіології промислових мікроорганізмів;
доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський
державний медичний університет, завідувач кафедри клінічної імунології,
алергології та ендокринології.
Провідна установа:
Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика,
кафедра мікробіології та епідеміології, МОЗ України, м.Київ.
Захист відбудеться “20” квітня 2006 року о 13 30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 у Національному
медичному університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 03057,
м.Київ-57, пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №
2.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м.Київ-57,
вул.Зоологічна,1.
Автореферат розісланий “17” березня 2006 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
Войцеховський В.Г.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В останні два десятиріччя в багатьох країнах світу
на фоні зниження гострозаразних інфекцій зростає кількість захворювань,
що викликаються умовно патогенними мікроорганізмами. Серед числа
останніх бактерії Haemophilus influenzae особливо небезпечні для дітей
молодшого віку. Поглиблені популяційні дослідження, проведені в країнах
Європи, Північної Америки, Азії, Африки та Австралії свідчать про
загрозливе поширення гемофільних інфекцій.
Захворювання, етіологічним чинником яких є Haemophilus influenzae
капсульного серотипу b (так звані Hib-інфекції), найбільш притаманні
дітям віком від 3 місяців до 5 років і характеризуються тяжкими
генералізованими формами з летальністю від 2-6 % до 40-50 %, численними
ускладненнями та стійкою інвалідізацією в 10-20 % випадків. За оцінками
ВООЗ, Hib-інфекції обумовлюють до 3 млн. важких захворювань на рік, з
яких біля 700 тис. закінчуються летально. У зв’язку з постійною появою
антибіотикорезистентних штамів бактерій навіть найсучасніші антибіотики
не забезпечують 100 %-вого виліковування хворих. Встановлено, що
H.influenzae є причиною розвитку менінгітів, пневмоній, бронхітів,
епіглотитів, отитів, артритів, целюлитів, остеомієлітів та септицемій у
дітей дошкільного віку. Крім того, H.influenzae є одним з провідних
збудників захворювань органів дихання у людей похилого віку. Значна
частка Hib-інфекції виявляється у складі гострих респіраторних
захворювань.
До введення вакцинації проти Hib-інфекції частота захворювань цієї
етіології у дітей до 5 років в різних країнах була різною і досягала
таких показників (на 100 000 дітей): в Англії – 36, Фінляндії – 52,
Франції – 21, Німеччині – 40, Швейцарії – 60, в Австралії – 460 серед
аборигенів, в Південній Африці – 104, в Південній Америці – 20-43, в
країнах Азії – 3-163, в країнах Середнього Сходу – 26-58, в США у
загальному вона була – 60 – 100, а серед корінного населення Аляски – до
2960 дітей першого року життя.
Враховуючи крапельний механізм поширення інфекції та проблеми в
етіотропній терапії, пов’язані з резистентністю Hib-бактерій до широкого
спектру антибіотиків, єдиним надійним засобом боротьби з цією інфекцією
і захисту дітей від неї є вакцинопрофілактика. Включення вакцин проти
Hib-інфекції в календар щеплень ряду розвинених країн (Фінляндія,
Франція, Німеччина, Великобританія) призвело до різкого зниження і
навіть ліквідації захворюваності, викликаної цими бактеріями.
Згідно результатів проведеної експрес-оцінки тяжкості хвороб, що
викликаються H.influenzae типу b, яка була проведена в Україні місією
ВООЗ у 2003 році, показник захворюваності на Hib-обумовлений менінгіт
складає від 3,7 до 17,7 на 100 000 дітей у віці молодше 5 років (80-240
випадків захворювань на рік). Із цього випливає, що щороку не
діагностується від 2 до 10 % випадків цього захворювання. До цього часу
дослідження гемофільних інфекцій в Україні мали тільки епізодичний
характер, реєстрація випадків захворювань, зумовлених гемофільною
паличкою та вивчення біологічних особливостей регіональних штамів не
проводились, що створює відчуття хибного благополуччя стосовно
поширеності Hib-інфекції в нашій країні.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота є фрагментом планових наукових досліджень, які проводяться у
науково-дослідній лабораторії загальної мікробіології Інституту
епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В.Громашевського АМН України
на тему: “Вивчення актуальних штамів збудників інфекційних хвороб для
поповнення національного Музею патогенних для людини мікроорганізмів” (№
державної реєстрації 0101V002332) та “Вивчення біологічних властивостей
музейних та актуальних штамів домінуючих збудників опортуністичних
інфекцій. Оцінка ефективності пробіотичних продуктів
лікувально-профілактичного призначення для корекції кишкової мікрофлори
у новонароджених та дорослих” (№ державної реєстрації 0104U000214).
Автор дисертації був і залишається виконавцем фрагментів комплексних
науково-дослідних тем.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи: на основі застосування
комплексу сучасних методів лабораторної діагностики встановити
етіологічну роль Haemophilus influenzae в захворюваннях осіб різного
віку та обгрунтувати необхідність проведення відповідних
лікувально-профілактичних заходів.
Завдання досліджень:
Виготовити діагностичні сироватки до різних серотипів H.influenzae та
діагностичний препарат для проведення серологічних реакцій.
На основі бактеріологічних та серологічних методів дослідження визначити
питому вагу H.influenzae в етіологічній структурі гнійних менінгітів,
пневмоній у дітей раннього віку.
Встановити рівень носійства H.influenzae серед здорових дітей
дошкільного віку та вивчити біологічні властивості виділених штамів.
Визначити біологічні особливості (біохімічні властивості, жирнокислотний
склад клітин, антибіотикостійкість) виділених штамів H.influenzae у
дорослих осіб з бронхолегеневими захворюваннями.
Розробити методи для довготривалого зберігання штамів H.influenzae з
метою поповнення державних колекцій патогенних культур мікроорганізмів
та подальшого поглибленого дослідження властивостей бактерій.
Об’єкт дослідження: поширеність інфекцій, спричинених H.influenzae у
людей різного віку та частота носійства даного збудника у дітей
дошкільного віку.
Предмет дослідження: мікрофлора носоглотки у дітей віком до 6 років;
клінічний матеріал (ліквор, сироватка крові, сеча), взятий від дітей з
гнійно-запальними захворюваннями головного мозку та бронхолегеневої
системи; біологічні властивості штамів гемофільних бактерій, виділених
від носіїв та осіб різних вікових груп, хворих на гострі та хронічні
бронхолегеневі захворювання.
Методи дослідження: при виконанні роботи здійснювалося комплексне
використання бактеріологічних, серологічних, експериментальних,
статистичних методів, а також методу газо-рідинної хроматографії.
Наукова новизна одержаних результатів. Науково обгрунтовано доцільність
комплексного застосування бактеріологічних та ряду серологічних методів
діагностики для виявлення гемофільних інфекцій.
Встановлені значний рівень поширення інфекцій, зумовлених бактеріями
H.influenzae типу b, серед дітей раннього віку та високий ступінь
колонізації цими бактеріями носоглотки здорових дітей дошкільного віку,
що є науковим обгрунтуванням необхідності проведення вакцинопрофілактики
інфекцій, обумовлених гемофільними бактеріями.
Досліджено біологічні властивості штамів H.influenzae, виділених у
здорових дітей дошкільного віку, та у дорослих осіб із захворюваннями
органів дихання. Визначено переважні біовари досліджуваних культур
H.influenzae.
Встановлено переважання серед штамів роду Haemophilus, виділених у
дорослих осіб з бронхолегеневими захворюваннями, бактерій виду
H.influenzae, меншу питому вагу становили штами H.parainfluenzae.
Показано доцільність дослідження жирнокислотного складу клітин як
важливої хемотаксономічної ознаки для підтвердження належності бактерій
до роду Haemophilus.
Практичне значення одержаних результатів. Встановлено високу
діагностичну цінність виготовлених лабораторних серій типових сироваток
до різних серотипів H.influenzae. Доведено високу чутливість та
специфічність отриманого в лабораторних умовах діагностичного препарату
для реакції коаглютинації як основи для розробки комерційного
вітчизняного діагностикуму для діагностики гемофільних інфекцій.
Отримано дані антибіотикочутливості гемофільних бактерій, які можуть
бути корисними для визначення переліку препаратів при лікуванні гострих
і хронічних захворювань бронхолегеневої системи, зумовлених цими
збудниками.
Досліджено вплив 4-х стабілізуючих середовищ на життєздатність
ліофілізованих штамів різних видів гемофілів та підібрано оптимальний
метод для довготривалого зберігання збудників гемофільних інфекцій.
Колекція Музею патогенних для людини мікроорганізмів поповнена
ліофілізованими клінічними штамами гемофільних бактерій.
За матеріалами дисертації видано методичні рекомендації “Виділення,
ідентифікація, визначення антибіотикочутливості та умови довгострокового
зберігання Haemophilus influenzae”, які впроваджено у роботу
бактеріологічної лабораторії науково-дослідного протичумного Інституту
ім. І.І.Мечнікова МОЗ України (м.Одеса), лабораторії нових та
маловивчених інфекційних захворювань ІМІ ім. І.І.Мечнікова АМН України
(м.Харків); у навчальний процес кафедри мікробіології та вірусології
Луганського національного аграрного університету. Отримані в процесі
роботи результати були враховані при розробці нового проекту
Національного календаря щеплень.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено запланований
комплекс мікробіологічних, серологічних та експериментальних досліджень,
проведено статистичну обробку одержаних результатів досліджень, написані
всі розділи дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки
дисертації доповідались та обговорювались на з’їзді мікробіологів
(Чернігів, 2000); VII Міжнародному медичному конгресі студентів і
молодих учених (Тернопіль, 2003); V Українській конференції молодих
вчених, присвяченій пам’яті академіка В.В.Фролькіса (Київ, 2004); Х
з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004);
науково-практичній конференції “Досягнення молодих вчених – майбутнє
медицини” (Харків, 2004), Міжнародній науковій конференції “Актуальные
вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной
медицине, посвященной 160-летию И.И.Мечникова” (Харків, 2005), ІІ нараді
східно-європейської групи експертів в галузі вакцинації (1-2 жовтня,
Москва, 2005).
Публікації. Матеріали дисертаційної роботи викладені в 11 публікаціях,
із них 4 статті, опубліковані у наукових фахових виданнях, що
відповідають вимогам Вищої атестаційної комісії України до публікацій
основних результатів дисертацій.
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 138 сторінках,
складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи
досліджень”, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення
результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел.
Бібліографія складається з 238 джерел, з них 155 іноземних. Матеріали
дисертації ілюстровані 24 таблицями та 11 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Нами досліджено різні види клінічного
матеріалу від 737 здорових та хворих осіб різних вікових груп (табл.1).
З метою отримання капсульних гіперімунних сироваток до чотирьох
серотипів a, b, d, f H.influenzae проводили імунізацію 12 кролів
протягом місяця дробними, наростаючими дозами живих культур H.influenzae
вказаних серотипів (Храмова Н.І., 1973).
Таблиця 1
Відомості про предмети досліджень
Контингент Кіль-
кість
осіб Вік Матеріал
дослідження Джерело
одержання
Діти 427 2 міс-
5 років Слиз носоглотки 7 дитячих дошкільних
закладів (5 – м.Києва,
2 – Київської області)
Діти 20 1 міс –
15 років ліквор Київські міські дитячі клінічні лікарні № 1 та № 12
Діти 65 6 міс –
6 років Парні проби сироваток крові та сечі Київська міська дитяча
клінічна лікарня № 1
Дорослі
хворі 225 50 – 70 років мокрота Інститут фтизіатрії та пульмонології
ім.Ф.Г.Яновського, Київська міська СЕС,
Київські МКЛ № 4 та №17
Культивування, біохімічну ідентифікацію мікроорганізмів роду
Haemophilus проводили загальноприйнятими методами, дотримуючись
класифікації Бергі (1997). Одночасно з рутинними методами ідентифікації
дослідження біохімічних властивостей штамів гемофілів проводили з
використанням комерційних тест-систем для ідентифікації бактерій роду
Haemophilus API NH (виробництва bioMerieux, Франція).
Дослідження жирнокислотного складу ідентифікованих клінічних штамів
H.influenzae здійснювали згідно з розробленою в попередні роки методикою
(Синяк К.М.,1977; Васюренко З.П., 1992). Метилові ефіри
жирних кислот аналізували на газовому хроматографі “Цвєт -110”.
Серологічну ідентифікацію капсульних штамів H.influenzae і серологічне
дослідження різних видів клінічного матеріалу (ліквору, сечі) проводили
в реакції латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням комерційних
тест-систем Directigen Meningitis Individual Tests (виробництва Becton
Dickinson, США) і Slidex meningite – Kit 5 (виробництва bioMerieux,
Франція), а також в реакції коаглютинації (КОА) за допомогою
стафілококових реагентів з використанням чотирьох специфічних
неадсорбованих сироваток до типів a, b, d, f H.influenzae, отриманих в
лабораторних умовах за методикою Н.І.Храмової (1973). Серологічне
дослідження сироватки крові проводили в титрованій реакції аглютинації
пробірковим методом.
Чутливість бактерій роду Haemophilus до антибіотиків вивчали на
шоколадному агарі на основі агару Мюллер-Хінтон та, частково, на
шоколадному агарі, приготовленому на основі агару АГВ дискодифузійним
методом за Бауер-Кірбі з використанням комерційних дисків (1987). Згідно
рекомендацій National Committee of Clinical Laboratory Standart (NCCLS)
для визначення чутливості гемофільних бактерій до антибіотиків
використовували комерційні диски виробництва НІЦФ (Росія), а також диски
виробництва фірми Remel (США). Для постановки тесту
антибіотикочутливості гемофілів використовували диски з ампіциліном,
амоксицилін/клавулановою кислотою, тетрацикліном, хлорамфеніколом,
цефотаксимом, цефтриаксоном, ципрофлоксацином, азитроміцином і
триметоприм-сульфаметоксазолом. В залежності від діаметрів зон затримки
росту мікроорганізмів навколо дисків з антибіотиками штами відносили до
чутливих, помірно стійких або стійких (резистентних). При оцінці
активності антибіотиків користувалися критеріями виробника дисків, а
також стандартами NCCLS (2000).
Контроль якості дисків з антибіотиками та шоколадного агару на основі
Мюллер-Хінтон проводили 1 раз на 10 днів за діаметрами зон затримки
росту еталонних штамів H.influenzae ATCC 49247, E.coli ATCC 35218 та
H.influenzae ATCC 10211.
Контроль якості середовищ проводили 1 раз на 10 днів шляхом встановлення
наявності типового росту контрольного штаму H.influenzae NCTC 11931.
Частину гемофільних штамів досліджували з використанням комерційних
наборів для визначення антибіотикочутливості ATB NH (виробництва
bioMerieux, Франція).
З метою підбору умов для довготривалого зберігання гемофілів були
використані стабілізуючі середовища для ліофілізації: молочно-лактозне
(МЛ); молочно-сахарозне (МС); сахарозо-желатинове (СЖ);
сахарозо-желатинове агаризоване (СЖА). Вказані середовища були залучені
в процесі дослідження для змиву після підрощування на шоколадному агарі
біомаси еталонних штамів H.influenzae чотирьох серотипів a, b, d, f та
клінічних ізолятів різних видів гемофілів (H.influenzae,
H.parainfluenzae, H.parasuis, H.gallinarum). Перевірку життєздатності
ліофілізованих культур здійснювали через 1, 3 місяці та через рік.
Отримані кількісні результати досліджень оброблені загальноприйнятими
методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень
середньої арифметичної (М), середньої похибки середньої арифметичної
(m), квадратичного відхилення ((), достовірності результатів досліджень
(t), достовірності різниць результатів двох серій досліджень (p).
Застосовували ПК типу ІВМ (PENTIUM-III) з використанням пакету програм
фірми Microsoft.
Результати досліджень та їх обговорення.
Чутливість та специфічність реакції коаглютинації для діагностики
гемофільних інфекцій. В результаті проведених нами 3-кратних досліджень
чутливості методу коаглютинації з використанням в роботі еталонних
музейних штамів H.influenzae чотирьох серотипів встановлено, що штами
H.influenzae типів a і b (жива та вбита прогріванням культури) давали
позитивну реакцію КОА при концентрації клітин 106мк/мл і слабопозитивну
– при концентрації 105 мк/мл. Штами H.influenzae типів d та f давали
позитивну реакцію КОА при концентрації клітин 105 мк/мл і слабопозитивну
– при концентрації 104мк/мл, що свідчить про більш високу чутливість
отриманих антисироваток до H.influenzae вказаних серотипів.
Відомо, що в лікворі, сироватці крові та сечі хворих на гнійний
менінгіт, гострі та хронічні запальні захворювання бронхолегеневої
системи можуть бути присутні антигени інших видів етіологічно значущих
бактерій, таких як: Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae,
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Haemophilus parainfluenzae.
Вказані види бактерій використані нами в роботі для дослідження
специфічності стафілококового реагенту.
При постановці реакції КОА із приготовленими в лабораторних умовах
сенсибілізованими стафілококовими реагентами виявлено перехресні реакції
в бактеріальних суспензіях високої густини (108 ( 109 мк/мл), які
містили антигени мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae, що зумовлено
наявністю спільних компонентів в структурі їх ліпополісахаридних
комплексів. Встановлення перехресних реакцій в усіх видах матеріалу, що
містили високу концентрацію (109 мк/мл) антигенів представника роду
Haemophilus – H.parainfluenzae, зумовлено наявністю спільних
родоспецифічних антигенів, що необхідно враховувати при проведенні
реакції коаглютинації.
Отримані дані свідчать про високу діагностичну цінність виготовлених
антисироваток, реагентів для реакції КОА. Встановлена нами висока
чутливість і специфічність реакції коаглютинації дає змогу рекомендувати
даний метод в якості експрес-методу діагностики гемофільних інфекцій для
індикації антигенів H.influenzae в різних біологічних субстратах. При
дослідженні клінічного матеріалу на предмет визначення антигенів
H.influenzae з використанням комерційних тест-систем (в реакції ЛА) та
реагентів, отриманих в лабораторних умовах для реакції КОА, перевага
надається методу КОА як більш доступному в економічному відношенні для
практичних лабораторій. Проведені дослідження можуть стати основою для
розробки в подальшому вітчизняного комерційного діагностичного препарату
для постановки реакції коаглютинації.
Серологічна діагностика Hib-інфекцій у дітей. За даними серологічних
досліджень лікворів 20 хворих на менінгіт дітей дошкільного віку в
реакціях латекс-аглютинації та коаглютинації у 2 випадках, з яких 1
бактеріологічно підтверджений, виявлено антиген H.influenzae типу b, у 5
випадках виявлено антигени Streptococcus pneumoniae. Останні були
виявлені також в сечі цих дітей, в яких гостра пневмонія була супутнім
захворюванням, а основним – гнійний менінгіт, бактеріологічно не
розшифрований. Отже, загальна етіологічна розшифровка гнійних
бактеріальних менінгітів за допомогою проведених нами серологічних
досліджень становила 35 %, з яких на долю Hib припадає 10,0 %, а на долю
S.pneumoniae – 25,0 %.
Застосування серологічних методів (реакцій ЛА та КОА) при дослідженні
клінічного матеріалу (сечі) у 65 дітей дошкільного віку дало змогу
виявити у 22 дітей антиген Hib. З цих 22 дітей у 16 спостерігалось
наростання титру антитіл до Hib в парних сироватках крові, а у 3 –
спадання титру при постановці титрованої реакції аглютинації. В
результаті проведених серологічних досліджень діагноз Hib-інфекції
дихальних шляхів підтвердився серологічно у 22 дітей, що становить 33,9
% питомої ваги. Серед госпіталізованих дітей з гострою патологією
органів дихання питома вага Hib-пневмонії складала близько 26,2 %, а
Hib-бронхіту – 7,7 % (рис. 1).
Рис. 1. Структура гострих Hib-інфекцій бронхолегеневої системи у дітей
молодшого віку за даними серологічних досліджень сироватки крові та
сечі.
При дослідженні матеріалу дітей (сечі) на предмет виявлення антигену Hib
з використанням комерційних тест-систем (в реакції ЛА) та реагентів,
виготовлених в лабораторних умовах для реакції КОА, не встановлено
переваги якогось з цих методів стосовно чутливості і специфічності.
Таким чином, визначення антигену Hib у сечі дітей за допомогою двох
видів реакцій аглютинації (ЛА та КОА) не тільки доповнюють дані
серологічного дослідження, а також при відсутності класичного наростання
титру антитіл в парних сироватках може бути самостійним критерієм для
уточнення етіології пневмонії.
o
a
o
?
?
h-h h”h$h&h(hThVhpioooooooooooeooeaeaeaeaeaeeaeU
`„?
? дітей дошкільного віку. Носійство бактерій Haemophilus influenzae у
здорових людей – досить розповсюджене явище, особливо в дитячому віці,
що співпадає з найбільшою сприйнятливістю маленьких дітей (до 5 років)
до гемофільних інфекцій.
При обстеженні 427 дітей на носійство Hib було виділено 73 штами
H.іnfluenzae. Більшість штамів H.іnfluenzae (56,2 %) були виділені в
асоціаціях з (-гемолітичним стрептококом. Проведене біохімічне типування
дозволило поділити досліджувані культури на 8 біотипів. Більшість
виділених культур (74,0 %) належали до перших трьох біотипів.
Визначення серотипу виділених штамів у реакції латекс-аглютинації
показало, що 50 штамів H.influenzae належали до серотипу b. Це дозволяє
визначити носоглоткове носійство саме збудника Hib-інфекції серед
обстежених нами дітей на рівні 11,7 %, що у порівнянні з результатами
досліджень, проведених у нашому регіоні і в той же сезонний період майже
20 років тому (Заргарян О.П., 1983), свідчить про зростання даного
показника майже у чотири рази (рис. 2).
Рис. 2. Носійство H.influenzae типу b у здорових дітей дошкільного віку
(n=427).
Відзначалась значна розбіжність в рівнях носійства в обстежених
колективах. Так, в дитячих дошкільних закладах, що знаходились в межах
м.Києва, рівні носійства становили 11,6 %, 14,3 %, 15,6%, 19,1 % та 21,7
%, тоді як в колективах дитячих закладів Київської області рівні
носійства Hib сягали 1,9 та 6,7 %, що свідчить про неоднакову
інтенсивність циркуляції зазначеного мікроорганізму в різних дитячих
колективах і необхідність вивчення тих факторів, які на неї впливають.
За допомогою реакції коаглютинації з використанням реагентів,
виготовлених в лабораторних умовах, встановлено, що носійство
H.influenzae типу d серед дітей дошкільного віку складало 1,6 %,
серотипи a та f знаходили з однаковою частотою – 0,7 %. У 13,7 %
випадках не вдалося встановити належність виділених культур H.influenzae
до певного серотипу.
Аналіз даних досліджень антибіотикочутливості 45 капсульних штамів
гемофільних бактерій показав, що більшість штамів характеризувались
високою чутливістю до амоксициліну (95,5 %), цефотаксиму (86,7 %),
цефтриаксону (91,0 %), азитроміцину (97,8%). Всі штами виявились
чутливими до ципрофлоксацину. Майже половина досліджених штамів (46,7 %)
були стійкими до триметоприму-сульфаметоксазолу, та більше половини
характеризувались резистентністю до тетрацикліну (84,4 %),
хлорамфеніколу (75,5 %) та ампіциліну (55,5 %) (табл. 2).
Таблиця 2
Чутливість до антибіотиків штамів H.influenzae (n=45)
Антибіотик Розподіл за чутливістю до антибіотиків, %
Стійкі Помірно
стійкі Чутливі
Ампіцилін 31,1 ( 6,9 24,4 ( 6,4 44,5 ( 7,4
Амоксицилін 0 4,4 ( 3,1 95,5 ( 3,1
Тетрациклін 66,6 ( 7,0 17,8 ( 5,7 15,6 ( 5,4
Хлорамфенікол 66,7 ( 7,0 8,8 ( 4,2 24,5 ( 6,4
Цефотаксим 8,8 ( 4,2 4,5 ( 3,1 86,7 ( 5,1
Цефтриаксон 4,5 ( 3,1 4,5 ( 3,1 91,0 ( 4,3
Ципрофлоксацин 0 0 100
Азитроміцин 2,2 ( 2,2 0 97,8 ( 2,2
Триметоприм/
сульфаметоксазол 33,4 ( 7,0 13,3 ( 5,1 53,3 ( 7,4
Характеристика штамів бактерій роду Haemophilus, виділених від дорослих
осіб. З огляду на низьку діагностичну спроможність бактеріологічних
лабораторій встановлювати етіологію бронхолегеневих захворювань у
дорослих осіб, дослідження біологічних особливостей гемофільних бактерій
як вагомих чинників цих захворювань, відіграє важливу роль з метою
визначення підходів до лікування та профілактики гемофільних інфекцій як
у дорослих, так і у дітей.
Досліджені морфологічні, культуральні, біохімічні властивості 52
клінічних штамів гемофільних бактерій, виділених з мокроти дорослих осіб
старшого та похилого віку, хворих на гострі та хронічні бронхолегеневі
захворювання (пневмонія, бронхіт). За даними біохімічних тестів 82,7 %
штамів були віднесені до H.influenzae. Решта штамів була ідентифікована
як H.parainfluenzae. Встановлено, що результати проведення рутинної
ідентифікації гемофілів співпадають з результатами паралельного
застосування в роботі комерційної системи для ідентифікації Haemophilus
API NH, яка зарекомендувала себе високочутливим, простим і зручним
експрес-методом ідентифікації.
Визначено, що 73,0 % з досліджених 52 штамів H.influenzae та
H.parainfluenzae належали до перших трьох біотипів, що співпадає з
даними літератури. Найбільшу питому вагу склав ІІ біотип – 36,6 %
штамів, І біотип – 28,8 %, ІІІ і V біотипи – по 7,6 % штамів, VІІІ
біотип – 13,5 % штамів. Поодинокі культури належали до ІV і VІІ біотипів
(1,9 % та 3,8 % штамів відповідно). Серед досліджуваних штамів не
виявлено представників VІ біотипу.
Проведений аналіз жирнокислотного складу клітин виділених від дорослих
штамів дозволив віднести їх до роду Haemophilus. Бактерії різних видів
даного роду мають ідентичний склад клітинних жирних кислот, що не
дозволяє диференціювати гемофіли на рівні виду за цією ознакою. Але
використання даного тесту дозволило ідентифікувати біохімічно інертні
штами на рівні роду.
Аналіз даних досліджень антибіотикочутливості 49 штамів гемофілів
показав, що більшість штамів були стійкими до ампіциліну,
хлорамфеніколу, тетрацикліну, цефалоспоринів ІІІ покоління (цефотаксиму,
цефтриаксону). Найбільш ефективними препаратами були ципрофлоксацин,
азитроміцин, амоксицилін (табл. 3).
Таблиця 3
Чутливість до антибіотиків штамів гемофілів (n=49)
Антибіотик Розподіл за чутливістю до антибіотиків, %
Стійкі Помірно
стійкі Чутливі
Ампіцилін 49,0 ( 7,1 14,3 ( 5,0 36,7 ( 6,9
Амоксицилін 30,7 ( 6,6 8,1 ( 3,9 61,2 ( 7,0
Тетрациклін 24,5 ( 6,1 28,6 ( 6,5 46,9 ( 7,1
Хлорамфенікол 73,5 ( 6,3 12,2 ( 4,7 14,3 ( 5,0
Цефотаксим 73,5 ( 6,3 6,1 ( 3,4 20,4 ( 5,8
Цефтриаксон 71,4 ( 6,5 4,1 ( 2,8 24,5 ( 6,1
Ципрофлоксацин 16,3 ( 5,3 2,1 ( 2,05 81,6 ( 5,5
Азитроміцин 16,3 ( 5,3 18,4 ( 5,5 65,3 ( 6,8
Триметоприм/
сульфаметоксазол 42,9 ( 7,1 0 57,1 ( 7,1
Визначення чутливості гемофільної палички до антимікробних препаратів є
важливим і, водночас, складним завданням для лікарів-бактеріологів.
Проведені нами трикратні порівняльні дослідження по визначенню
чутливості еталонних штамів H.influenzae серотипів a, b, d, f до 9
антибіотиків дискодифузійним методом на шоколадному агарі (ША),
приготовленому на основі агару Мюллер-Хінтон та на основі АГВ, показали,
що показники діаметрів зон затримки росту еталонних штамів H.influenzae,
отримані на ША, приготовленому на основі АГВ, достовірно не відрізнялися
від показників діаметрів зон росту цих штамів, отриманих на ША,
приготовленому на основі Мюллер-Хінтон. Отримані результати дозволяють
рекомендувати вказані середовища в якості основи для приготування
шоколадного агару при дослідженні чутливості гемофільних бактерій в
регіональних бактеріологічних лабораторіях.
Життєздатність ліофілізованих штамів H.influenzae. З огляду на вкрай
низьку життєздатність виділених штамів H.influenzae постає проблема їх
довготривалого зберігання в науково–дослідних центрах з метою подальшого
дослідження морфологічних, біохімічних, генетичних особливостей
мікроорганізмів.
Нами показано, що оптимальним стабілізуючим середовищем для
заморожування та ліофілізації є агаризоване сахарозо-желатинове
середовище (СЖА). Встановлено, що проростання клітин збудника після
стану анабіозу відбувається у пролонгованому режимі – кількість колоній
на поверхні шоколадного агару зростає в залежності від періоду інкубації
розчинених в м’ясо-пептонному бульйоні сухих препаратів в інтервалі 24 –
72 год на 25 – 200 %. Подальша інкубація бульйонних культур не
призводила до зростання кількості колоній. Завдяки вказаному середовищу
(СЖА) проростання культур зі стану анабіозу було максимально ефективним
майже для всіх використаних препаратів (табл.4).
Таблиця 4
Вплив стабілізуючих середовищ на життєздатність різних видів гемофілів
Вид та номер штаму гемофіла Життєздатність (КУО) в різні строки
зберігання на середовищах
Сахарозо-
желатинове Сахарозо-
желатинове
агаризоване Молочно-
лактозне Молочно-
сахарозне
3
міс. 1
рік 3
міс. 1
рік 3
міс. 1
рік 3
міс. 1
рік
H.influenzae 0395 15 7 25 12 9 5 – –
H.influenzae VIU 15 7 25 12 30 16 – –
H.gallinarum 7 4 18 9 5 3 2 0
H.parasuis 32129 7 4 20 11 9 4 3 1
H.parainfluenzae 0441 5 3 30 14 – – – –
H.parainfluenzae 1193 40 22 70 36 30 16 10 5
Примітка: КУО – кількість колонієутворюючих одиниць в 4-му секторі
шоколадного агару.
Розроблені схеми довготривалого зберігання збудників гемофільної
інфекції мають важливе значення для поглиблених наукових досліджень
актуальних штамів бактерій роду Haemophilus.
ВИСНОВКИ
В роботі наведено вирішення актуального наукового завдання – за
допомогою комплексної лабораторної діагностики, що включає
бактеріологічні та серологічні методи досліджень, встановлено значний
рівень поширення інфекцій, спричинених бактеріями H.influenzae типу b
серед різних вікових груп населення, високий рівень колонізації цим
збудником носоглотки здорових дітей дошкільного віку, а також вивчено
біологічні особливості виділених штамів. Одержані дані обгрунтовують
необхідність проведення відповідних лікувально-профілактичних заходів,
серед яких найбільш важливим є вакцинопрофілактика дітей дошкільного
віку.
1. Розроблені та одержані високоефективні лабораторні серії сироваток до
різних серотипів H.influenzae, на основі яких створений антитільний
діагностикум для реакції коаглютинації. Доведено високу чутливість та
специфічність діагностикуму для розробки комерційного вітчизняного
препарату.
2. Встановлено, що питома вага H.influenzae типу b в етіологічній
структурі бактеріологічно не розшифрованих гнійних бактеріальних
менінгітів за даними серологічних досліджень ліквору 20 дітей, складала
10,0 %, а на долю Streptococcus pneumoniae припадало 25,0 %.
3. Встановлено, що питома вага Hib-інфекції дихальних шляхів за даними
серологічних досліджень сироватки крові і сечі 65 дітей дошкільного
віку, госпіталізованих з підозрою на пневмонію, становила 33,9 %, – з
них на долю Hib-пневмоній припадало 26,2 %, а на долю Hib-бронхітів –
7,7 %.
4. При бактеріологічному дослідженні слизу носоглотки 427 дітей
дошкільного віку в 11,7 % виявлено носійство H.influenzae серотипу b I –
VIIІ біотипів. Його рівень значно коливався у дітей різних дошкільних
закладів (від 21,7 % до 1,9 %). Більшість штамів H.influenzae (56,2 %)
виділялися в асоціації з (-гемолітичним стрептококом, і були стійкими до
ампіциліну, хлорамфеніколу і тетрацикліну.
5. Серед 52 штамів гемофільних бактерій, ізольованих від дорослих з
гострими та хронічними захворюваннями дихальних шляхів, переважали
бактерії H.influenzae – 83,0 %, а штами H.parainfluenzae складали 17,0
%. Належність біохімічно інертних штамів (20 ізолятів) до виду
H.influenzae доведена складом клітинних жирних кислот – важливої
хемотаксономічної ознаки.
6. Гемофільні бактерії, ізольовані від дорослих, хворих на
бронхолегеневі захворювання, резистентні до ампіциліну, хлорамфеніколу,
тетрацикліну, цефотаксиму, цефтриаксону. Ці дані мають наукову і
практичну значущість для моніторингу антибіотикорезистентності
регіональних штамів, а також при визначенні переліку препаратів для
лікування гострих і хронічних захворювань бронхолегеневої системи,
обумовлених гемофільними бактеріями.
7. Відсутність істотних розходжень в значеннях діаметрів зон затримки
росту еталонних штамів H.influenzae на середовищах Мюллера-Хінтона та
АГВ дає можливість рекомендувати обидва середовища для визначення
антибіотикочутливості гемофільних бактерій.
8. Для довготривалого зберігання збудників гемофільної інфекції в
музейних колекціях мікроорганізмів доцільно використовувати агаризоване
сахарозо-желатинове середовище.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Статті у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України:
Поліщук О.І., Брич О.І., Погорельчук Л.М. Циркуляція Haemophilus
influenzae серед дітей дошкільного віку // Дитячі інфекції. –
Укр.міжвідомча збірка. – К.:Знання. – 2002. – С. 238-242. (Здобувачем
особисто проведено бактеріологічні та серологічні дослідження матеріалу
від дітей, аналіз результатів).
Чернишова Л.І., Винник Н.П., Брич О.І. Клінічні особливості пневмоній у
дітей, зумовлених Haemophilus influenzae типу b // Зб. наук. праць
співробітників КМАПО ім.П.Л.Шупика. – Вип. 12. – Книга 2. – К., 2003. –
С. 670-674. (Здобувачем особисто проведено серологічні дослідження
клінічного матеріалу від дітей, обробка та аналіз результатів).
Брич О.І., Рубан Н.М., Головня О.М. Біологічні властивості клінічних
штамів бактерій роду Haemophilus, виділених при захворюваннях органів
дихання // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім.П.Л.Шупика. – Вип.
13. – К., 2004. – С. 397-402. (Здобувачем особисто досліджені біологічні
властивості клінічних штамів гемофільних бактерій).
Поліщук О.І., Брич О.І. Гемофільна інфекція та шляхи її попередження //
Современная педиатрия. – К., 2004. – № 4(5). – С.157-160. (Здобувачем
зібрано відомості про етіологічну роль Haemophilus influenzae в
захворюваннях дітей, світові дані щодо захворюваності Hib-інфекціями).
Методичні рекомендації:
1. Виділення, ідентифікація, визначення антибіотикочутливості та умови
довгострокового зберігання Haemophilus influenzae // Сельнікова О.П.,
Поліщук О.І., Колтукова Н.В., Брич О.І. – Київ: Товариство “Знання”
України, 2004. – 29 с. (Здобувачем зібрано, проаналізовано та описано
матеріал стосовно методик виділення, ідентифікації, визначення
антибіотикочутливості бактерій роду Haemophilus).
Статті та тези в інших наукових виданнях:
Поліщук О.І., Брич О.І., Рубан Н.М., Колтукова Н.В., Брич Л.М.
Біологічні властивості та спосіб довгострокового зберігання клінічних
штамів Haemophilus influenzae // Зб. праць співробіт. Музею патогенних
для людини мікроорганізмів “Методи одержання чистих культур
мікроорганізмів та їх довгострокового зберігання в колекціях”. – К.:Тов.
“Знання” України. – 2004. – С. 17-25. (Здобувачем особисто проведені
дослідження життєздатності клінічних штамів гемофілів та дослідження з
підбору середовищ для довготривалого зберігання різних видів гемофільних
бактерій).
Сельнікова О.П., Брич О.І. Проблема гемофільної інфекції в патології
дітей раннього віку та перспективи її вивчення в Україні // Бюл.
Інституту сільськогосподарської мікробіології. – Чернігів. – 2000. – №
7. – С.69.
Брич О.І. Антибіотикорезистентність клінічних ізолятів Haemophilus
influenzaе // Матеріали VII Міжнарод.мед. конгресу студентів і молодих
учених. – Тернопіль. – 2003. – С.289.
Поліщук О.І., Брич О.І. Перспективи використання експрес-методів
діагностики інфекцій, викликаних Haemophilus influenzae типу b //
Матеріали робочої наради-семінару з актуальних проблем епідеміології,
діагностики та профілактики інфекційних хвороб. – Тернопіль. – 2000. –
С.34.
Поліщук О.І., Брич О.І., Винник Н.П. Лабораторна діагностика пневмоній,
викликаних Haemophilus influenzae типу b, у дітей раннього віку //
Матеріали Х з’їзду Товариства мікробіологів України. – Одеса. – 2004. –
С.162.
Брич О.І., Головня О.М. Чутливість до антибіотиків клінічних штамів
гемофільних бактерій // Матеріали науково-практичної конференції
“Досягнення молодих вчених – майбутнє медицини”. – Харків. – 2004. –
С.13.
АНОТАЦІЯ
Брич О.І. Етіологічна роль Haemophilus influenzae в захворюваннях осіб
різного віку. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидита медичних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Національний медичний
університет імені О.О.Богомольця, Київ, 2006.
На основі комплексної лабораторної діагностики встановлено значний
рівень поширеності інфекцій, спричинених бактеріями H.influenzae типу b,
серед різних вікових груп населення та високий рівень носійства цього
збудника серед здорових дітей дошкільного віку. Обгрунтовано
необхідність проведення відповідних лікувально-профілактичних заходів,
серед яких найбільш важливим є вакцинопрофілактика дітей дошкільного
віку. Досліджено біологічні особливості виділених штамів. Доведено
високу чутливість та специфічність препарату для реакції коаглютинації
як основи для розробки комерційного вітчизняного діагностикуму.
Ключові слова: бактерії роду Haemophilus, Hib-інфекції, носійство,
лабораторна діагностика, вакцинопрофілактика, діагностикум..
АННОТАЦИЯ
Брич О.И. Этиологическая роль Haemophilus influenzae в заболеваниях лиц
разного возраста. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Национальный медицинский
университет имени А.А. Богомольца, Киев, 2006.
В диссертации на основе комплексной лабораторной диагностики, которая
включает бактериологические и серологические методы исследований,
установлено значительный уровень распространенности инфекций, вызванных
бактериями H.influenzae типа b, среди разных возрастных групп населения
и высокий уровень колонизации этим возбудителем носоглотки здоровых
детей дошкольного возраста, а также изучено биологические особенности
выделенных штаммов. Обоснована необходимость проведения соответствующих
лечебно-профилактических мероприятий, среди которых наиболее важным
является вакцинопрофилактика детей дошкольного возраста.
Установлена высокая диагностическая ценность полученных лабораторных
серий сывороток к разным серотипам H.influenzae для применения реакции
коагглютинации и других серологических реакций. Доказана высокая
чувствительность и специфичность препарата для реакции коагглютинации
как основы для разработки коммерческого отечественного диагностикума.
Показана целесообразность приготовления реагентов для реакции
коагглютинации в лабораторных условиях с целью експресс-диагностики
гемофильных инфекций.
Данные серологических исследований показали, что удельный вес
H.influenzae типа b в этиологической структуре бактериологически не
расшифрованных гнойных бактериальных менингитов, составлял 10,0 %, а на
долю Streptococcus pneumoniae приходилось 25,0 %.
На основании серологических исследований сыворотки крови и мочи 65 детей
дошкольного возраста, госпитализированных с подозрением на пневмонию
установлено, что удельный вес Hib-инфекции дыхательных путей составил
33,9 %, из них на долю Hib-пневмоний приходилось 26,2 %, а на долю
Hib-бронхитов – 7,7 %.
При бактериологическом исследовании слизи носоглотки 427 детей
дошкольного возраста у 11,7 % выявлено носительство H.influenzae
серотипа b I – VIIІ биотипов. Уровень носительства Hib значительно
колебался у детей разных дошкольных учреждений – от 21,7 % до 1,9 %.
Большинство штаммов H.influenzae (56,2 %) выделено в ассоциации с
(-гемолитическим стрептококком. Ввиду того, что носители Hib могут быть
источником инфекции с развитием манифестных форм тяжелых заболеваний у
детей младшего возраста, полученные результаты являются одним из
показателей распространенности Hib-инфекции в Украине.
Определено, что среди 52 штаммов гемофилов, изолированных от взрослых с
острыми и хроническими заболеваниями дыхательных путей, преобладали
бактерии H.influenzae – 83,0 %, штаммы H.parainfluenzae составляли 17,0
%. При этом из 52 исследованных штаммов гемофильных бактерий 73,0 %
принадлежали к первым трем биотипам. Принадлежность биохимически
инертных 20 изолятов к роду Haemophilus подтверждена исследованием
состава клеточных жирных кислот – важного хемотаксономического признака.
На основании проведенных исследований коллекция Музея патогенных для
человека микроорганизмов пополнена 6 штаммами H.influenzae. Полученные
данные антибиотикочувствительности гемофильных бактерий, изолированных
от взрослых с бронхолегочными заболеваниями свидетельствуют о наличии
штаммов, резистентных к ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину,
цефотаксиму, цефтриаксону. Эти данные значимы для мониторинга
антибиотикорезистентности региональных штаммов гемофилов, а также при
определении перечня препаратов для эмпирического лечения острых и
хронических заболеваний бронхолегочной системы, обусловленных
гемофильными бактериями.
Исследована антибиотикочувствительность эталонных штаммов H.influenzae с
использованием в работе сред, приготовленных на основе агара
Мюллера-Хинтона и АГВ. Не обнаружено достоверной разницы в значениях
диаметров зон задержки роста гемофильных бактерий на указанных средах,
что дает возможность рекомендовать их для проведения соответствующих
тестов.
Проведено сравнительное исследование влияния 4-х стабилизирующих сред
на жизнеспособность лиофилизированных клинических штаммов H.influenzae.
Обосновано использование агаризованной сахарозо-желатиновой среды для
длительного сохранения возбудителей гемофильной инфекции в музейных
коллекциях микроорганизмов. Ключевые слова: бактерии рода Haemophilus,
Hib-инфекции, носительство, лабораторная диагностика,
вакцинопрофилактика, диагностикум.
SUMMARY
Brich O.I. The etiological role of Haemophilus influenzae in persons
various age diseases. – Manuscript.
Dissertation for candidate of medical sciences degree on speciality
03.00.07 – microbiology. – National Medical University named by O.O.
Bogomolets, Kyiv, 2006.
The considerable level of Haemophilus influenzae type b diseases in
persons various age and new data about high level of nasopharyngeal
Hib-carrying among healthy preschool children on the basis of complex
laboratory diagnostic were determined. The necessity of conduction the
prophylactic measures, mainly by vaccine among preschool children, was
based. The biological properties of isolates are studied. The high
sensibility and specifity of reagent for reaction coagglutination as the
basis to elaboration of commercial home preparation were proved.
Key words: Haemophilus spp., Hib-infections, carrying, laboratory
diagnostic, prophylactic by vaccine, preparation.
PAGE 18
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
