.

Тактика лікування жінок з аденоміозом у поєднанні з запальними процесами геніталій (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
174 3203
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

Козубенко Наталія Василівна

УДК 612.82-884 + 577.112

Зміна рівня нервовоспецифічних білків під впливом експериментального
соматогенного болю та фармакокорекції

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацію є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті
Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Ушакова Галина Олександрівна,

Дніпропетровський національний університет,

доцент кафедри біофізики та біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

головний науковий співробітник

відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України;

доктор біологічних наук, професор

Шевцова Алла Іванівна

професор кафедри біохімії та загальної хімії

Дніпропетровської державної медичної академії

МОЗ України.

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н.
Каразіна

Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії.

Захист відбудеться 4 квітня 2005 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України

(01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім.
О.В. Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат дисертації розіслано 3 березня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Феномен болю цікавив людство ще з античних часів.

На сьогоднішній день особливої актуальності набувають дослідження саме
центральних механізмів болю.

Патофізіологія соматогенного болю це ряд послідовних подій, результатом
яких є посилення ноцицептивного сигналу з периферії та сенситизація
центральних аферентів (Лиманский Ю.П., 1990). На хімічному рівні
провідна роль у передачі ноцицептивного сигналу відводиться рецепторам
збуджуючих амінокислот, особливо глутаматним, а також Са2+ (Костюк О.П.
та ін., 2001). Структура та особливості функціонування глутаматних
рецепторів добре описані у роботах Grumet T.I., 1994 та багатьох інших
дослідників. Оскільки рецептори є мембранними структурами, а робота
синапсу залежить не тільки від активності каналів та рецепторів, а й,
насамперед, від мікрооточення синаптичного бутону та стану мембран, що
його утворюють, то важливо було прослідити участь білків, що входять до
складу цих структур, у процесах ноцицепції.

Молекула адгезії нервових клітин NCAM відіграє важливу роль у
синаптичній пластичності не тільки ембріонального, але і дорослого мозку
(Beresin V., Bock Е., 2000). Доведена участь цього білку у таких
важливих процесах як міграція, диференціація нервових клітин та
відростання нейритів. Завдяки своїм адгезивним властивостям NCAM здатний
регулювати розмір синаптичної щілини, що, в свою чергу, є одним з
чинників, який визначає ефективність передачі нервового імпульсу
(Kiselyov V.V. et al., 2003). Останнім часом також приділяється велика
увага здатності NCAM (зокрема його розчинних форм) впливати на процеси
пластичності через запуск каскадів внутрішньоклітинних подій (Soroka V.
et al., 2003).

У роботах останніх років астрогліальний Са2+-зв’язуючий білок S-100?
визначається як модулятор нейрональної пластичності та сили сигналу
(Nishiyama H., 2003). Завдяки здатності S-100? регулювати енергетичний
гомеостаз нервових клітини він втягнений у процеси модуляції
збудливості, мембранного потенціалу та синаптичної трансмісії, які мають
особливе значення у ході набуття ноцицептивної сенситизації (Melani R.
et al., 1999).

Морфологія синаптичного бутону у значній мірі залежить від морфології
астроцитів, що його охоплюють. Однією з молекул, що мають вагомий внесок
у структурну організацію астрогліальних клітин, є ГФКБ (гліальний
фібрилярний кислий білок). Хоча структура та функції цього білку
досліджені не достатньо, доведена його участь у формуванні цитоскелету
астроцитів (Menet V. et al., 2003).

Важливе значення для формування синаптичного контакту та його пластичних
змін у ході функціонування має міжклітинний матрикс і, зокрема, його
глікозаміноглікан-зв’язуючі компоненти. Сьогодні велика увага
приділяється не тільки здатності цих агентів регулювати міжклітинні
взаємодії, а також їх впливу на структурну організацію самої клітини.
Завдяки взаємодії зі специфічними рецепторами на клітинній поверхні
протеоглікани міжклітинного матриксу впливають на організацію
цитоскелету клітини та її поведінку (Schachner M., 2003).

Незважаючи на досить докладну дослідженість згаданих вище компонентів
нервової тканини, залишається невідомою їх роль у процесах передачі та
аналізу ноцицептивного сигналу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася в рамках договору про спільну діяльність із Міжнародним
центром молекулярної фізіології НАН України (№ 1167, 2001-2003 рр.) за
темою “Дослідження механізмів формування неоднорідних розподілів
мембранних макромолекул та їх ролі у морфо- та електрогенезі нейронів”
та договору про науково-технічне співробітництво між ДНУ та
Дніпропетровською державною медакадемією (№ 1194, 2002-2004 рр.) за
темою “Дослідження центральних механізмів болю та впливу на них
різноманітних типів анальгетиків та анестетиків”.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідження зміни рівня
окремих нервовоспецифічних білків та загальної
глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності білків міжклітинного матриксу у
мозку щурів під впливом експериментального соматогенного
післяопераційного болю та фармакокорекції. Для досягнення поставленої
мети необхідно було вирішити такі задачі:

викликати стан експериментального соматогенного післяопераційного болю;

підтвердити наявність післяопераційної гіпералгезії та відсутність
інфекційного запалення;

в умовах післяопераційного болю в мозку та сироватці крові щурів
визначити:

активність глікозидаз;

рівень розчинної та мембранної форм N-CAM;

вміст S-100? та ГФКБ;

загальну гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючу активність білків
мозку;

дослідити вплив агоністів та антагоністів N-метил-D-аспартат (НМДА)
рецепторів на вміст вказаних білків у післяопераційний термін;

визначити вплив нестероїдного протизапального препарату на вміст
нервовоспецифічних білків в умовах гіпералгезії;

провести кореляційний аналіз та аналіз відсоткового вмісту різних форм
вказаних білків, специфічних для нейронів та астроглії й
глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків міжклітинного матриксу в
умовах післяопераційного болю

та впливу визначених препаратів.

Об’єкт дослідження. Біохімічні механізми передачі та аналізу
ноцицептивної інформації.

Предмет дослідження. Вміст білків N-CAM, S-100?, ГФКБ та
глюкозаміноглікан-зв’язуюча здатність компонентів міжклітинного матриксу
мозку щурів.

Методи дослідження. У роботі використовували фракціонування тканини
мозку методом ультрацентрифугування, методи вуглевод-ферментного та
імуноферментного кількісного твердофазного аналізу, електрофорез у ПААГ
з ДСН, імуноблотинг, визначення активності глікозидаз, тестування
фізіологічної активності у відкритому полі.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше наводяться дані про вплив
соматогенного післяопераційного болю, а також агоністів та антагоністів
глутаматних рецепторів на рівень нейрональної молекули клітинної
адгезії, білків S-100?, ГФКБ, а також загальної
гепарансульфат-зв’язуючої та загальної гіалуронат-зв’язуючої активності
білків таламусу/гіпоталамусу та довгастого мозку щурів. Встановлено, що
під впливом післяопераційної гіпералгезії протягом першої доби
відбувається вірогідне (від 43 до 119%) підвищення рівня адгезивних та
астрогліальних білків та незначні

(10-27%) різноспрямовані зміни глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності
білків мозку щурів. Для відносно раннього післяопераційного періоду
характерне підвищення рівня розчинних форм білків S-100? та N-CAM у
сироватці крові щурів. Показано, що на сьому добу післяопераційного
терміну рівень досліджуваних білків наближається до показників норми.

Отримані в роботі дані істотно доповнюють сучасні уявлення про
центральні механізми ноцицепції. Встановлені закономірності змін рівню
адгезивних, астрогліальних білків та глікозаміноглікан-зв’язуючих
компонентів міжклітинного матриксу протягом післяопераційного періоду
мають загальнотеоретичне значення для оцінки ролі даних компонентів
нервової тканини у процесах ноцицепції. Аналіз вказаного відсоткового
вмісту дозволяє зробити припущення про участь кожного з компонентів у
відповіді довгастого мозку та таламусу/гіпоталамусу на соматогенні
больові стимули.

Практичне значення отриманих резултатів. Дані про вплив нестероїдного
протизапального препарату Кетанов на рівень досліджуваних білків у мозку
щурів

в умовах післяопераційної гіпералгезії доповнюють його фармакодинамічні
характеристики та мають значення для вибору схеми застосування препарату
у лікарській практиці. Уперше показано, що застосування нестероїдного
протизапального препарату Кетанов запобігає змінам вмісту білку S-100?,
при одночасному підвищенні рівня гіалуронат-зв’язуючої здатності у
білків (на 76-128%) та незначному підвищенні вмісту інших досліджуваних
компонентів (N-CAM – на 37-41% та ГФКБ – на 74%) у мозку оперованих
щурів. Мікрометод визначення активності глікозидаз у сироватці крові
можна застосувати для контролю післяопераційного стану.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз
даних літератури, проведені експериментальні дослідження та статистична
обробка отриманих результатів. Розробка методології та обговорення
результатів проведені сумісно з науковим керівником. Консультативна
допомога у проведенні експерименту (оперативне втручання) надана
Кобеляцьким Ю.Ю.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були апробовані
на щорічних наукових підсумкових конференціях Дніпропетровського
національного університету (Дніпропетровськ, 2000-2003), Міжнародній
науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми
експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), 29th Meeting
of FEBS (Варшава, Польща, 2004), FENS/IBRO European Pain School 2003
“Chronic Pain a Disease: Novel Scientific Concepts” (Сьена, Італія,
2003), VII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), 10th World
Congress on Pain (Сан-Дієго, Каліфорнія, США, 2002), International
summer workshop “Pharmacology of the synaptic transmission in the
nervous system” (Київ, 2002), FEBS Advanced Course “Glycoconjugate:
Versatile structures – intriguing functions” (Дубровник, Хорватія,
2001), ISN/ASN Joint Meeting (Буенос Айрес, Аргентина, 2001),
Міжнародній науковій конференції студентів і молодих вчених
(Дніпропетровськ, 2001), ІІ конференції Українського товариства
нейронаук, присвяченій 70-річчю кафедри фізіології ДонДМУ ім. М.Горького
(Донецьк, 2001).

Публікації. Результати досліджень подані у 5 статтях та 9 тезах, які
опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах та
матеріалах з’їздів й конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 146
сторінках друкованого тексту і складається із вступу, основної частини,
що містить огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати
досліджень, обговорення отриманих результатів та висновки. Робота
ілюстрована 8 таблицями та 43 рисунками. Перелік використаної літератури
включає 194 найменування цитованої літератури.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлені сучасні уявлення про механізми
проведення та аналізу ноцицептивного сигналу. Представлені дані щодо
властивостей та функцій окремих нервовоспецифічних білків, а також їх
участі у процесах синаптичної пластичності.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експериментальну частину роботи було проведено на щурах лінії Wistar

4 місячного віку (98 самців). Тварини знаходилися в стандартних умовах
із циклічністю доби: світло – 12 год., ніч – 12 год. Для досліджень
використовували мозок та сироватку крові щурів. Декапітацію тварин
проводили під швидким ефірним наркозом.

Дослідження були проведені з використанням хімічно чистих реагентів фірм
Sigma (США), Serva (США), Fluka (Швейцарія), ANAWA (Німеччина), Ranbaxy
(Індія), Medix Biochemica (Фінляндія), Реагент (Дніпропетровськ,
Україна).

Кількісне визначення нервовоспецифічних білків у фракціях тканини мозку

та сироватці крові проводили згідно з стандартними методиками
конкурентного

та неконкурентного непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (Нго
Т.Т., Ленхофф Г., 1988), з використанням моноспецифічних поліклональних
антитіл

до N-CAM, S-100? та ГФКБ, відповідно, стандартних білків та антитіл до
IgG кролів, мічених пероксидазою хрону.

Для визначення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої
активності білків був використаний твердофазний вуглевод-ферментний
аналіз (Dolzhenko M.I.

et al., 1994). Цей метод є модифікацією твердофазного імуноферментного
аналізу.

Його особливість полягає у використанні кон’югату, що складається з
гепарину (гіалуронової кислоти), що кон’югований з пероксидазою хрону.
Кількісна оцінка глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків у пробі
визначалась, як відношення кількості гепарану (гіалуронової кислоти), що
зв’язався із сорбованими білками проби, до кількості загального білку у
даній пробі (нг зв’яз. ГП (ГК)/мг ЗБ).

Фракції білків були отримані за допомогою послідовної екстракції з
тканини головного мозку в буфері А (трис-НCl – 25 мМ; рН 7,4; ЕДТО – 1
мМ; ?-меркаптоетанол – 2 мМ; ФМСФ – 0,2 мМ; мертіолят – 0,01 %) –
фракція розчинних білків; у буфері А, що містив 2% тритон Х-100 –
фракція мембранних білків; у буфері А, що містив 4 М сечовини – фракція
цитоскелетних/екстацелюлярних білків. Кількість загального білку
визначали за методом Бредфорд (Bradford M., 1985).

Електрофорез у поліакриламідному гелі з ДСН проводили відповідно до
методики, яка була запропонована Леммлі (Lemmli U.K., 1970). По
завершенні електрофорезу гель фарбували іонами срібла за методикою
Мерріл (Merril C.R., 1986).

Імуноблотинг проводився згідно методики Стотт (Stott D.I., 1989).

Активності глікозидаз визначали з використанням відповідних субстратів:
2 мМ розчинів 2-нітрофеніл-N-ацетил-?-глюкозамініду,
2-нітрофеніл-?-D-галактопіранозиду та 2-нітрофеніл-?-глюкопіранозиду
(Sigma) на 50 мМ ацетатному буфері рН 5,4.

Дослідження фізіологічної активності щурів проводили за допомогою
тестування у відкритому полі (Буреш Я. та ін., 1991).

Модель експериментального соматогенного післяопераційного болю була
створена за модифікацією моделі Бреннана та співавторів (Brennan T.J. et
al., 1996).

Для статистичної обробки результатів використовували критерій
вірогідності Ст’юдента (t) та Манн-Уітні (U). Вірогідними вважали
результати, якщо рJ†* N – E a J†TH( * – I b2bTbBdDd„dUeUeUeUe?Ue––vv––v O O $ O O $ O O $ O O $ O O $ O O O ????th?????тивного сигналу (Кришталь А.П., 2000). Дія МК-801 протягом 24 год. викликала зміни вмісту S-100? лише у довгастому мозку. У не оперованих тварин вміст даного білку був вищим від контрольного рівня на 48%, у оперованих – на 65%. Отримані дані не дають відповіді на питання, чому блокування іонних каналів, які є частиною НМДА рецепторів не запобігає підвищенню вмісту S-100? у довгастому мозку. Можна лише припустити, що рівень внутрішньоклітинного Са2+ (який є причиною підвищення вмісту S-100?), змінюється завдяки роботі інших механізмів, наприклад, за участю металопротеаз або NK рецепторів. Рис. 4. Вміст розчинної форми S-100? у довгастому мозку (А) та таламусі/гіпоталамусі (Б) щурів через 24 год. після операції. Позначки груп ті самі. n = 7-8. * - p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020