.

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження) (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
136 2951
Скачать документ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

КОПАЧ ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 612.014.42:612.31:591.431.2

Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції внутрішньоклітинної
Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної
залози

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федірко Наталія Вікторівна,

Львівський національний університет імені Івана Франка

Міністерства освіти і науки України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач лабораторії мембранології

Київського національного університету імені

Тараса Шевченка

доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

провідний науковий співробітник відділу імунології та

цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа: Науково-дослідний інститут фармакології та
токсикології

АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 26 ” грудня 2005 року о 1500 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському
національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м.
Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 321.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського
національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м.
Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 13 ” листопада 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради К 35.051.14,

кандидат біологічних наук, доцент
_____________________________ Манько В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основною функцією слинних залоз є синтез та секреція
слини – секрету, який забезпечує підтримання фізіологічного стану
органів ротової порожнини, нормальний перебіг процесу травлення, містить
біологічно-активні речовини, а відтак відіграє важливу роль у
життєдіяльності організму людини і тварин. Зменшення слиновиділення та
патологічні зміни складу слини підвищують ризик патологій слизової
оболонки ротової порожнини та органів травлення, захворювань зубів,
порушення мовлення та ін. Внутрішньоклітинні механізми, які
опосередковують процеси пов’язані із слиновиділенням, залишаються
остаточно не з’ясованими, тому дослідження шляхів регуляції функцій
слинних залоз має важливе значення для сучасної фізіології та медицини.

Функціонування слинних залоз перебуває під контролем симпатичної та
парасимпатичної іннервації, а секреція білкового та рідинного
компонентів слини реалізуються різними сигнальними механізмами:
цАМФ-генеруючим та Са2+-мобілізуючим (Ambudkar et al., 2000; Melvin et
al., 2005). Зокрема, секреція рідкого компоненту слини ацинарними
клітинами підщелепної слинної залози знаходиться виключно під
холінергічним контролем, який опосередковується шляхом підвищення
концентрації іонізованого кальцію у цитоплазмі ([Са2+]i) клітин (Putney,
1986; Baum et al., 1993; Cook et al., 1999; Skryma, 2000). В екзокринних
клітинах основним механізмом підвищення [Са2+]i є його вивільнення із
внутрішньоклітинних депо, зокрема, ендоплазматичного ретикулуму (ЕР),
та, як наслідок, активації надходження Са2+ ззовні (Park et al., 1999;
Williams, 2001; Федірко Н.В. та співавт., 2001; Petersen, 2002). Таким
чином, оскільки первинною ланкою в ініціації [Са2+]i-сигналів, які
запускають секрецію, є вивільнення Са2+ з ЕР, актуальною проблемою
сучасної фізіології є детальне дослідження механізмів активації та
регуляції цього процесу.

Необхідною умовою вивільнення Са2+ з ЕР, що відіграє ключову роль у
[Са2+]i-сигналізації, є підтримання високої концентрації Са2+ в ЕР
([Са2+]EР). Відомо, що зменшення [Са2+]EР призводить до розвитку
„ЕР-стресу”, що проявляється порушенням [Са2+]i-сигналізації,
накопиченням секреторних білків внаслідок припинення їх виведення з ЕР
та пригніченням синтезу і процессінгу білків, що може бути причиною
загибелі клітини (Skryma, 2000; Siman et al., 2001; Waris et al., 2002).
Однак, на сьогодні остаточно не з’ясованими є не лише механізми
виникнення „ЕР-стресу”, але і особливості перебігу Са2+-сигналізації в
ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози за фізіологічних умов.
Для виявлення ролі ЕР у [Са2+]i-сигналізації важливим є проведення
комплексного дослідження механізмів її перебігу в ЕР на
пермеабілізованих клітинах та вкладу депонованого Са2+ у
[Са2+]i-сигналізацію в інтактних клітинах підщелепної слинної залози.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у рамках науково-дослідної держбюджетної теми БЛ-114Ф
“Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних
клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872 та за сприяння
Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні
функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са2+ в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та з’ясуванню особливостей
їх регуляції.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

Провести аналіз кальцій-залежних змін функціонування ацинарних клітин
підщелепної слинної залози при активації холінорецепторів in vivo та in
vitro.

Розробити методичний підхід для реєстрації [Са2+]EР в ацинарних клітинах
та довести його адекватність для дослідження механізмів
Са2+-сигналізації в ЕР.

Вивчити властивості, шляхи регулювання та провести кінетичний аналіз
вивільнення Са2+ з інозитолтрифосфат-чутливого депо ЕР ацинарних клітин.

Виявити наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів в
ацинарних клітинах, вивчити їх властивості, шляхи регулювання та вклад у
[Са2+]і-сигналізацію.

Кількісно оцінити пасивний витік Са2+ з ЕР та депо-керований вхід Са2+ в
ацинарні клітини та дослідити їх механізми.

Вивчити роль мітохондрій у регуляції [Са2+]і-сигналізації в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози.

Об’єкт досліджень – [Са2+]і-сигналізація в екзокринних секреторних
клітинах.

Предмет досліджень – функціонування та регуляція Са2+-транспортних
систем внутрішньоклітинних депо Са2+ ацинарних клітин підщелепної
слинної залози щурів.

Методи досліджень – для досягнення поставленої мети використовували
біофізичні, біохімічні, статистичні методи досліджень, а також метод
електронної мікроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження механізмів функціонування Са2+-каналів мембрани ЕР ацинарних
клітин підщелепної слинної залози щурів та їх взаємодії з іншими
Са2+-транспортними системами. Розроблено експериментальні моделі для
проведення прямої реєстрації концентрації Са2+ всередині
внутрішньоклітинних органел пермеабілізованих ацинарних клітин і
доведено адекватність їх використання для дослідження механізмів
функціонування Са2+-транспортних систем. Вперше проведено реєстрацію
зміни [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози при
активації InsP3-чутливих рецепторів та досліджено механізми модуляції їх
активності. Зареєстровано зменшення [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах при
активації ріанодин-чутливих рецепторів та вперше доведено їх вклад у
[Ca2+]i-сигналізацію у досліджуваних клітинах. Виявлено наявність
процесу швидкого захоплення Са2+, який вивільняється при активації
ріанодинових рецепторів, за участю мітохондрій (МХ). На основі змін
[Ca2+]i та [Са2+]ЕР, а також даних електронної мікроскопії постулюється
важлива фізіологічна роль колокалізації МХ, Са2+-АТФаз та ріанодинових
рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів
[Ca2+]i-сигналізації. Встановлено, що в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози транслоконовий комплекс є основним шляхом пасивного
витоку Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ в ацинарні
клітини підщелепної слинної залози і вперше виявлено роль МХ у його
регуляції. Показано локалізацію МХ безпосередньо під плазматичною
мембраною (ПМ) у базальному полюсі ацинарних клітин, що визначає їх
важливу роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють
уявлення щодо механізмів функціонування Са2+-транспортних систем
внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин слинних залоз. Вони можуть
бути теоретичною основою для подальших досліджень механізмів
Са2+-сигналізації у секреторних клітинах, причин і розвитку патологій
травних залоз та розробки методів їх фармакологічної корекції, тому
мають значення для медицини і ветеринарії. Отримані дані
використовуються при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і
тварин”, „Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні
механізми регуляції обміну речовин” у Львівському національному
університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу
експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі,
статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних
літератури, а також, за участю наукового керівника, у плануванні
напрямків досліджень, розробці методик пермеабілізації ПМ ацинарних
клітин, вимірювання концентрацій іонізованого кальцію у цитоплазмі та
ЕР, аналізі одержаних результатів, формулюванні висновків.

У роботі використано обладнання, надане старшим науковим співробітником
Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України д.б.н. Войтенко
Н.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із
співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України
к.б.н. Півневою Т.А.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні
положення, включені до дисертації, були представлені на: VII
міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль,
2003 р.), I з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004 р.), науково-практичній конференції “Сечєнов та Одеська школа
фізіологів” (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO
“Receptors, Channels, Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській
науковій конференції “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики” (Xapків,
2004 р.), Міжнародній конференції “Клітинні та субклітинні механізми
функціонування травної системи” (Львів, 2004 р.), регіональному
біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), XXXV Міжнародному
Конгресі фізіологічних наук (Сан-Дієго, США, 2005 р.), III Конференції
товариства нейронаук (Донецьк, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному
конгресі (Монтпельєр, Франція, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології
людини і тварин (2002-2005 рр.), щорічних звітних конференціях
біологічного факультету Львівського національного університету імені
Івана Франка (2002-2005 рр.) та на міжкафедральному семінарі
біологічного факультету у липні 2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових
наукових журналах та 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та
українських наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200
сторінках і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів
досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновки та список
використаної літератури з 313 джерел. Робота ілюстрована 81 рисунком і 7
таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів.
Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 1,5 міс.
Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для
привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком
експерименту тварину наркотизували ін’єкцією кетаміну та лістенону.
Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали
канюлею, якy впритул підводили до проток підщелепної слинної залози.
Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, ?-амілолітичною
активністю слини, вмісту у ній загального білка та концентрації Са2+.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком
гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку
декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали
шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у
базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 270
од/мг), протягом 25-30 хв (35 оС). Базовий зовнішньоклітинний розчин
містив (у ммоль/л): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0;
гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза –
10 ммоль/л; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту Са2+ у клітинах та секреції ними білка.
Сумарний вміст Са2+ в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з
використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу
полягає у тому, що Са2+ утворює з арсеназо III комплекс синього кольору,
інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+ у пробі.
Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який
визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального
білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту
білка у гомогенаті та супернатанті.

Вимірювання [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах
реєстрували з використанням мембранно-проникної форми флуоресцентного
Са2+-барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин
інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкмоль/л фура-2/АМ,
протягом 30-40 хв при 35?С, після чого відмивали базовим розчином і
додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника.
Для точного визначення [Ca2+]i використовували формулу Грінкевича
(Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9,
Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нмоль/л (Grynkiewicz et al.,
1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Ацинарні клітини
пермеабілізували дигітоніном та ?-есцином. Робочу концентрацію
детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально.
Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до
внутрішньоклітинного середовища (НДВ), який містив (у ммоль/л): KCl –
120; NaCl – 20; MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75;
рН 7,2. Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою
програми “WinMAXC v2.10”, у такому НДВ-розчині становила ~250 нмоль/л.
Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв
у всіх експериментах, за виключенням окремо згадуваних, з ?-есцином (40
мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з
використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом, а у
випадку маг-фура 2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням
флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Визначення [Ca2+]ЕР у секреторних клітинах. Для моніторингу концентрації
Са2+ в ЕР, ацинарні клітини завантажували мембранно-проникною формою
низько-афінного флуоресцентного Са2+-барвника маг-фура 2/АМ. Фарбування
клітин проводили протягом 45-60 хв при 37?С, що забезпечує
компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer &
Machen, 1993). Зміни [Ca2+]ЕР виражали не як абсолютне значення, а як
співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ на
довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F360/F390) і
оцінювали як прямо пропорційні до змін співвідношення F360/F390 (Hofer &
Machen, 1994).

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували
протягом 12 год при 20?С у суміші розчинів глютаральдегіду (2 %) та
параформальдегіду (2 %), приготовлених на 0,1 моль/л фосфатному буфері
(рН 7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1 % розчині OsO4 у фосфатному
буфері протягом 1 год при кімнатній температурі. Зразки зневоднювали у
зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит)
при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи
отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і
контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження
проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із
збільшенням 5000 – 40000.

Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР опрацьовували за допомогою
програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичну обробку результатів
здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення
F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін
встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин підщелепної
слинної залози щурів при активації холінорецепторів

Для з’ясування кальцієвої залежності функціональних відповідей
секреторних клітин слинних залоз ми досліджували ефекти активації
холінорецепторів in vivo та in vitro. Встановлено (табл.1) виражене
зростання швидкості слиновиділення та білково-ферментного вмісту слини
після внутрішньочеревного введення тваринам М-холіноміметиків –
карбахолу (2 мкг/кг) та пілокарпіну (2 мг/кг). Агоніст
Н-холінорецепторів цитизин (2 мг/кг) спричиняв підвищення лише
амілолітичної активності слини на 88 ± 9 % (n=10; р`„a ? u $ O O $ O O & ( * , . 0 J z | ? O O O O O O O O O O O 2+]i, ми припускаємо, що група МХ в області між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ. 6. Базальний витік Са2+ з ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози У стані спокою [Ca2+]ЕР підтримується шляхом активного захоплення кальцію Са2+-АТФазою ЕР на фоні його стаціонарного пасивного витоку (Hofer et al.,1999). Витік Са2+ є характерною особливістю ЕР, однак у клітинах слинних залоз залишається невивченим. Для візуалізації та дослідження механізмів пасивного витоку Са2+ ми провели: i) перфузію ацинарних клітин безкальцієвим НДВ-розчином (1 ммоль/л EГTA) для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму роботи Са2+-АТФази ЕР; ii) блокування обох режимів роботи Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном. Сумарний вміст кальцію у пермеабілізованих клітинах зменшувався після тривалого (20 хв) інкубування їх у безкальцієвому НДВ-розчині на 30 ? 4 %, з тапсигаргіном ([Ca2+]і=100нмоль/л) – на 29 ? 4 %, з тапсигаргіном у безкальцієвому НДВ-розчині – на 36 ? 6,5 % (p1 ммоль/л).

В ацинарних клітинах підщелепної слинної залози доведено наявність
функціонально-активних ріанодинових рецепторів (ЕС50 за кофеїном
становить 7,3 ± 1,1 ммоль/л), які є нечутливими до гепарину, блокуються
ріанодином та дозо-залежно регулюються іонізованим кальцієм з максимумом
при [Ca2+]i = 400 нмоль/л. Виявлено фізіологічну роль мітохондрій у
захопленні Са2+, що вивільняється з ЕР при активації ріанодинових
рецепторів.

Основним шляхом пасивного витоку кальцію з ЕР, який компенсується
роботою Са2+-АТФази мембрани ЕР, є транслоконова пора.

Активація депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини відбувається
незалежно від способу спустошення кальцієм депо ЕР (ІnsР3-чутливого чи
тапсигаргін-індукованого). Рівень та швидкість депо-керованого входу
Са2+ зменшуються при блокуванні мітохондрій, що свідчить про їх ключову
фізіологічну роль у регуляції входу Са2+ в ацинарні клітини підщелепної
слинної залози.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури ацинарних клітин
підщелепної слинної залози виявило розташування мітохондрій у
безпосередній близькості до ЕР та їх локалізацію під ПМ у базальному
полюсі клітини, що підтверджує важливу фізіологічну роль колокалізації
Са2+-транспортних систем у процесах перебігу внутрішньоклітинної
Са2+-сигналізації та регуляції слиновиділення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Fedirko N., Kopach O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Imaging of
intrareticular calcium concentration in permeabilized cells //
Neurophysiology. – 2003. – Т. 35, № 3/4. – С. 345-346 (Здобувач провела
дослідження по вивченню зміни сумарного вмісту кальцію в ацинарних
клітинах, брала участь в аналізі даних та їх обговоренні).

Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федірко Н.В.
Пермеабілізовані клітини слинних залоз, як модель для вивчення
кальцій-транспортних систем мембрани ендоплазматичного ретикулуму //
Фізіол. журнал. – 2003. – Т. 49, № 5. – С. 31-42 (Здобувач провела
дослідження зміни сумарного вмісту кальцію, брала участь в обговоренні
даних та їх узагальненні, написанні та оформленні статті).

Копач О.В., Федірко Н.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г.
Зміни функціонування підщелепної слинної залози щурів за умов
експериментально-індукованого діабету // Клінічна та експериментальна
медицина. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 462-463 (Здобувач провела всі
дослідження та статистичну обробку даних).

Копач О., Федірко Н. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних
клітин слинних залоз при дії агоністів холінергічної природи // Вісник
Львів. ун-ту, Серія біологічна. – 2004. – Вип. 37. – С. 205-212
(Здобувач провела всі дослідження та опрацювання даних, проаналізувала
літературні джерела, взяла участь у написанні статті).

Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Федірко Н.В.
Тапсигаргінчутливе та нечутливе внутрішньоклітинне кальцієве депо в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. –
2005. – Т. 51, № 1. – С. 62-70 (Здобувач провела всі дослідження та
опрацювання результатів, взяла участь у написанні статті).

Kопач O., Федірко Н. Пермеабілізовані ацинарні секреторні клітини
слинних залоз як модель вивчення Са2+-транспортних систем мембрани
внутрішньоклітинних структур // Збірник тез доповідей VII міжнародного
медичного конгресу студентів та молодих учених, 21-23 травня 2003 р., м.
Тернопіль. – Тернопіль. – 2003. – С. 202 (Здобувач провела дослідження,
взяла участь в опрацюванні даних та написанні тез, представила доповідь
на конференції).

Копач О., Федірко Н., Кругліков І., Войтенко Н., Костюк П. Пуринергічна
внутрішньоклітинна Са2+-сигналізація у ацинарних клітинах слинних залоз
щурів // Установчий з’їзд українського товариства клітинної біології,
25-28 квітня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 35 (Здобувач взяла
участь у проведенні досліджень, аналізі даних, написанні тез,
представила стендову доповідь на конференції).

Kopach O.V., Kruglikov I.A., Kostyuk P.G., Fedirko N.V., Voitenko N.V..
Caffeine- induced changes of intrareticular Ca2+ homeostasis in rat
submandibular salivary cells // IBRO-advanced school of neuroscience
“Receptors, Channels, Messengers”, September 16-28 2004, Yalta
(Ukraine). – Р. 17 (Здобувач провела дослідження та опрацювання даних,
взяла участь у написанні та перекладі тез, представила доповідь на
конференції).

Копач О.В., Федірко Н.В. Тапсигаргін-індуковані зміни Са2+-гомеостазу у
секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська
наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”, 20-22
вересня 2004 р., м. Харків. – Xapків. – 2004. – С. 143 (Здобувач провела
всі дослідження, взяла участь в аналізі даних, написанні тез).

Копач О.В., Федірко Н.В., Войтенко Н.В. Функціонування кофеїн-чутливого
Са2+ депо ендоплазматичного ретикулуму у секреторних клітинах
підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції
“Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”, 7-9
жовтня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 37 (Здобувач самостійно
провела дослідження та статистичну обробку даних, взяла участь в
написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

Fedirko N., Kruglikov I., Kopach O., Vats J., Voitenko N.. Changes in
functioning of rat submandibular salivary gland under
streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of Ca2+
signaling and Ca2+ transporting pumps // XXXV IUPS Congress, 31 March-1
April 2005, San Diego, USA. (Здобувач провела частину досліджень та
статистичну обробку результатів).

Kopach O., Kruglikov I., Voitenko N., Fedirko N. Caffeine-induced
changes of Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells //
Regional Biophysics Meeting, 16-20 March 2005, Zrece, Slovenija. – P. 42
(Здобувач самостійно провела дослідження та статистичну обробку даних,
взяла участь в їх аналізі, написанні та перекладі тез).

Копач О.В., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Депо-керований вхід кальцію у
секреторні клітин щурів // III конференція Українського товариства
нейронаук, 22-25 травня 2005, м. Донецьк. – Нейронауки: теорет. і клін.
аспекти. – Т.1, № 1. – 2005. – С. 54. (Здобувач провел всі дослідження,
взяла участь у написанні тез).

Fedirko N.V., Kopach O.V., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Store-operated
Ca2+ entry is regulated by mitochondria in acinar cells of rat
submandibular salivary gland // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International
Biophysics Congress, August 27-Sept. 1 2005, Montpellier, France. –
Europ. Biophys. J. – Vol. 34, № 6. – Р. 544. (Здобувач провела
дослідження та опрацювання даних, взяла участь в аналізі та
інтерпретації результатів).

Kopach O.V., Voitenko N.V., Fedirko N.V. Basal Ca2+ leak from
endoplasmic reticulum of sub-mandibular acinar cells // 15-th IUPAB &
5-th EBSA International Biophysics Congress, August, 27- Semp. 1 2005,
Montpellier, France. – Europ. Biophys. J. – Vol. 34, № 6. – Р. 803.
(Здобувач самостійно провела дослідження та опрацювання даних, взяла
участь в написанні тез, представила стендову доповідь на конференції).

АНОТАЦІЇ

Копач О.В. Роль ендоплазматичного ретикулуму у регуляції
внутрішньоклітинної Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин
підщелепної слинної залози. – Рукопис.

Дисертація присвячена комплексному дослідженню механізмів вивільнення
Са2+ із внутрішньоклітинних депо ацинарних клітин підщелепної слинної
залози щурів.

В умовах досліду in vivo та in vitro показано кальцієву залежність
секреторних відповідей ацинарних клітин підщелепної слинної залози при
активації М-холінорецепторів. Розроблено експериментальні моделі для
реєстрації [Са2+]ЕР у пермеабілізованих ацинарних клітинах та доведено
їх адекватність для дослідження гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних
депо та Са2+-залежного екзоцитозу. Шляхом реєстрації зміни [Са2+]ЕР
досліджено властивості та регуляцію InsP3-чутливих та ріанодинових
рецепторів ЕР. Доведено участь ріанодинових рецепторів у
[Ca2+]i-сигналізації в ацинарних клітинах. Показано, що в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози основним шляхом пасивного витоку
Са2+ з ЕР є транслоконовий комплекс. Кількісно оцінено депо-керований
вхід Са2+ в ацинарні клітини та виявлено важливу фізіологічну роль
мітохондрій у його регуляції. Проведено ультраструктурний аналіз
ацинарних клітин підщелепної слинної залози та виявлено локалізацію
мітохондрій у безпосередній близькості до ЕР та у базальному полюсі
клітини. Постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації
мітохондрій, Са2+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні
просторово-часових параметрів [Ca2+]i-сигналізації.

Ключові слова: [Са2+]і-сигналізація, ендоплазматичний ретикулум,
ІnsР3-чутливі рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії,
депо-керований вхід Са2+, ацинарні клітини, підщелепна слинна залоза.

Копач О.В. Роль эндоплазматического ретикулума в регуляции
внутриклеточной Са2+-сигнализации и функционирования ацинарных клеток
подчелюстной слюнной железы. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Львовский
национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2005.

Дисертация посвящена исследованию механизмов высвобождения Са2+ из
внутриклеточных депо ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы крыс.

В експериментах in vivo и in vitro показано Са2+-зависимость секреции
ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы при активации
М-холинорецепторов. Разработано экспериментальные модели для прямой
регистрации [Са2+]ЭР в пермеабилизированных ацинарных клетках и доказано
их адекватность для исследования механизмов Са2+-гомеостаза и
Са2+-зависимого экзоцитоза. Проведено измерение [Са2+]ЭР при активации
InsP3- и рианодиновых рецепторов ЭР, исследовано их свойства и механизмы
регуляции. Доказано участие рианодиновых рецепторов в
[Ca2+]i-сигнализации в ацинарных клетках. Показано, что пассивная утечка
Са2+ из ЭР ацинарных клеток подчелюстной слюнной железы осуществляется
через пору транслоконного комплекса мембраны ЭР. Проведено
количественную оценку депо-управляемого входа Са2+ в ацинарные клетки и
установлено важную роль митохондрий в его регуляции.
Электронно-микроскопический анализ ацинарных клеток подчелюстной слюнной
железы показал локализацию митохондрий вблизи ЭР и в базальном полюсе
ацинарных клеток. Предполагается важная физиологическая роль
колокализации митохондрий, Са2+-АТФаз и рианодиновых рецепторов в
определении пространственно-временных параметров внутриклеточной
[Ca2+]i-сигнализации.

Ключевые слова: [Са2+]і-сигнализация, эндоплазматичний ретикулум,
ІnsР3-чувствительные рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии,
депо-управляемый вход Са2+, ацинарные клетки, подчелюстная слюнная
железа.

Kopach O.V. Role of endoplasmic reticulum for the regulation of
intracellular Са2+ signaling in acinar cells of rat submandibular
salivary gland – Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on the specialty 03.00.13 – Human and Animals
Physiology. – Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2005.

Dissertation is devoted to a complex study of Ca2+ release from the
intracellular Ca2+ stores in acinar cells of rat submandibular salivary
gland.

In vivo and in vitro experiments showed that activation of
m-cholinoreceptors leaded to the complex of Ca2+-dependent changes in
the functioning of rat submandibular gland. Cholinergic stimulation in
vivo leaded to rise of salivation rate, saliva amylase activity, protein
content as well as secretion of Ca2+. In vitro administration to
m-cholinoreceptors agonists caused increase of total calcium content and
[Ca2+]i in isolated acinar cells.

Since activation of cholinoreceptors leads to release of Ca2+ from the
endoplasmic reticulum (ER) we have elaborated methods for direct
measurements of Ca2+ inside the ER. We have found that
digitonin-permeabilized cells posses Са2+-dependent protein secretion
and ATP-dependent Са2+ transport suggesting their acceptability for
studying Са2+-dependent exocytosis and functioning of Ca2+ stores.
Besides we have shown that ?-escin permeabilized cells posses Ca2+
release from ER upon the activation of m-cholinoreceptors.

We have elucidated heterogeneity of intracellular Ca2+ stores in the
acinar cells. Inhibition of Ca2+ ATPase of the ER with thapsigargin (Tg)
resulted in the release ~ 30 % of total ER Ca2+ but subsequent
application of Ach further release Ca2+ from Tg-discharged stores in
permeabilized cells. Thus, the acinar cells posses the ІnsP3-dependent
Tg-sensitive and -insensitive Ca2+ stores. Exogenous ІnsP3 decreased
[Ca2+]ER with EC50 1,3 ? 0,21 ?M. Such a release was amplified by Са2+
(100-400 nM), decreased by caffeine (2 mM). ATP ( Підписано до друку 5.11. 2005 р. Формат 60*90/16. Друк на різографі. Папір офсетний. Умовних друк. арк. 1,0. Тираж 100 прим. Замовл. № 27 ПП „Арк-Сервіс” м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, к.3

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020