Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна
Леонова Ірина Сергіївна
УДК 597.222: 547.2
Механізми накопичення ергостерину в клітинах дріжджів saccharomyces
cerevisiae в залежності від умов культивування
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в НДІ біології Харківського національного університету
імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Божков Анатолій Іванович,
Харківський національний
університет імені В.Н.Каразіна
Міністерства освіти і науки
України,
директор НДІ біології
Офіційні опоненти:
доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник
Іонов Ігор Анатолійович, Харківський національний педагогічний
університет імені Г.С. Сковороди Міністерства освіти і науки України,
декан природничого факультету, м. Харків
доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач
відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків
Провідна установа:
Львівський національний університет імені Івана Франка (кафедра генетики
і біотехнології) Міністерства освіти і науки України, м. Львів
Захист відбудеться “8” червня 2005 р. о 16 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за
адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд.
ІІІ-15.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства
освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий “5” травня 2005 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради
Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Однією з центральних проблем сучасної біохімії є
дослідження молекулярних механізмів адаптації, які спрямовані на
перебудову системи метаболізму відповідно до вимог факторів середовища.
Актуальність дослідження відповідних реакцій на дію екзо- і ендогенних
факторів зумовлена, тим що без знань цих механізмів неможливо зрозуміти
такі фундаментальні явища, як онтогенез, розвиток патологий та інші.
Зазначенні питання є темою досліджень фахівців різних наукових
напрямків. Основна частина робіт присвячена вивченню первинного обміну –
реакцій, подібних у всіх живих організмів, і пов’язаних із синтезом
нуклеїнових кислот та білків. Однак поряд з цим існує величезна
кількість метаболічних шляхів, які приводять до утворення і накопичення
сполук, властивих лише деяким біологічним видам чи одній хімічній расі –
вторинних сполук [Лукнер М., 1979; Zinser E., 1993]. Сучасні дослідження
показують, що продукти вторинного обміну можуть як опосередковано, так і
безпосередньо впливати на первинний обмін і, таким чином, на
структурно-функціональні характеристики клітини: інтенсивність
проліферації, швидкість старіння [F. Ness, 1998].
У зв’язку з цим вивчення впливу різних факторів на накопичення продуктів
вторинного обміну і його можливий взаємозв’язок зі
структурно-функціональним станом клітини становить інтерес для розуміння
регуляції метаболізму в процесі адаптації.
Вторинний метаболізм добре виражений у такого різнобічно вивченого
об’єкта, як дріжджі-сахароміцети [Pereira R. 1998; Meunier J.R. et al.,
1999], на яких проведений ряд біохімічних, молекулярно-генетичних і
геронтологичних досліджень [Matsuyama S., 1999; Nose H, 2002].
Основним вторинним метаболітом дріжджів є стерини, зокрема, ергостерин,
на частку якого припадає 60-90% усіх стеринів клітини [Синицкая Н.А.,
1993]. Ергостерин є попередником сполук, які мають Д-вітамінну та
гормональну активність, тому ергостерин дріжджів становить інтерес для
вирішення проблеми авітамінозів групи Д у дітей і молодняку тварин, що є
гострм питанням у багатьох країнах світу, у тому числі й в Україні.
Використання клітин дріжджів як харчових і кормових добавок ускладнено
через особливості будови їх клітинної стінки [Kapteyn J.C., et al.,
1999], на яку припадає до 30% сухої маси клітини [Smith A.E., et al.,
2000]. У зв’язку з цим розробка нових способів руйнування або видалення
клітинної стінки дріжджів, що дозволить одночасно підвищити вихід
цільового продукту, є досить актуальною.
Незважаючи на те, що процес стериноутворення досліджується протягом
багатьох років [Yang H., 1996; Yu C., 1996; Dimster-Denk D. et
al.,1999], усе ще недостатньо вивченими є питання впливу складу
середовища, умов росту клітин дріжджів та віку культури на активність
вторинного метаболізму, зокрема, на накопичення ергостерину і
взаємозв’язок між первинним і вторинним метаболізмом.
Вивченню цих питань і присвячена дана робота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження
проводилися в науково-дослідному інституті біології Харківського
національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках теми
“Дослідження екстрацелюлярних ферментів фітопатогенів і їх ролі у
формуванні рослинного імунітету” (НДР: 0103U004281).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення механізмів
накопичення ергостерину в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae у
процесі старіння культури і за різних умов культивування, а також
розробка методів гідролітичного руйнування клітинних стінок дріжджів.
Відповідно до цього були поставлені такі задачі:
Вивчення впливу популяційного віку культури на накопичення ергостерину
клітинами дріжджів і їх стійкість до осмотичного і температурного шоку.
Дослідження впливу джерела вуглецю (різні концентрації пивного сусла й
етилового спирту) та етапу росту культури, на якому вносили добавку, на
вміст ергостерину в клітинах дріжджів.
Дослідження комплексного впливу іонів кальцію, етилового спирту і різних
температурних режимів культивування на накопичення ергостерину клітинами
дріжджів.
Вивчення можливості індукції стериноутворення ферментними комплексами
міцеліальних грибів, що руйнують клітинні стінки дріжджів.
Об’єкт дослідження – механізми накопичення ергостерину клітинами дикого
штаму пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.
Предмет дослідження – показники вмісту ергостерину й інтенсивності
дихання культури дріжджів, динаміка росту культури дріжджів, вміст
продуктів перекисного окислення ліпідів, вміст білку і нуклеїнових
кислот у біомасі дріжджів.
Методи дослідження – спектрофотометричні (кількість клітин дріжджів у
культурі, вміст ергостерина, рівень перекисного окислення ліпідів,
вміст нуклеїнових кислот), мікроскопічні (кількість клітин дріжджів,
діаметр клітин) метод тонкошарової хроматографії ліпідів,
полярографичний метод визначення інтенсивності дихання клітин дріжджів,
статистичні методи обробки даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено, що інтенсивність
накопичення ергостерину визначалася як індуктором, так і станом
метаболізму клітини на момент впливу. Зміна вмісту ергостерину в
клітинах дріжджів залежала не тільки від концентрації етилового спирту у
середовищі культивування, але і від етапу росту культури, на якому він
був внесений. Сумісне внесення іонів кальцію та етилового спирту у
середовище культивування дріжджів спричиняло адитивний ефект при
накопиченні ергостерину, що може свідчити про їх регуляторну дію на
різних етапах синтезу ергостерину в клітинах дріжджів.
Вперше показано, що комплекс екзогенних гідролітичних ферментів
міцеліального гриба Chaetomium globossum Kunze може забезпечити
руйнування клітинних стінок дріжджів. Уперше виявлена можливість
індукції стериноутворення в клітинах культури дріжджів при їх інкубації
з екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze. У випадку пролонгованої
дії ферментного комплексу виявлявся ефект накопичення ергостерину, що
може свідчити про адаптивну роль ергостерину у клітині. Виявлено, що
накопичення ергостерину в клітинах дріжджів, до якого призводив вплив
комплексу екзогенних ферментів, у ряді випадків може розглядатися як
адаптивна реакція клітини на дію екстремальних факторів.
Виявлено, що збільшення популяційного віку культури дріжджів призводило
до зниження вмісту ергостерину в клітинах, зменшення розміру клітин,
збільшення кількості мертвих клітин у культурі, а також до зниження їх
стійкості до теплового й осмотичного шоку.
Практична значимість роботи. Отримані результати свідчать про зміну
вихідних характеристик культури клітин дріжджів при тривалому й
інтенсивному пасируванні, що необхідно враховувати при використанні
культур клітин дріжджів у науковій і практичній діяльності. Застосування
комплексу гідролітичних екзоферментів міцеліального гриба Chaetomium
globossum Kunze, здатного модифікувати або цілком руйнувати клітинну
стінку дріжджів, дозволить:
одержувати харчові добавки, що мають високу харчову цінність.
одержувати протопласти дріжджів, необхідні для сучасних біотехнологій і
молекулярно-генетичних досліджень.
Підбір умов культивування зможе забезпечити стабільне і більш інтенсивне
(в 1,5 – 2 рази у порівнянні з контролем) накопичення ергостерину
клітинами дріжджів, дозволить одержати харчову і кормову добавку,
збагачену попередником вітаміну Д, що необхідно для профілактики рахіту
у дітей і молодняку тварин.
Результати цієї роботи були використані у навчальному процесі
біологічного факультету Харківського національного університету імені
В.Н. Каразіна і кафедри біотехнології Харківського національного
політехнічного університету “Харківський політехничний інститут”, а
також при утилізації залишкових пивних дріжджів на ОАТ“Пивзавод
“Рогань”.
Особистий внесок здобувача. Самостійно була підібрана і проаналізована
література за темою дисертації, здійснена постановка експериментів,
вибір досліджуваних показників і статистична обробка отриманих
результатів. Усі експерименти проведені самостійно, крім експериментів з
руйнування клітинних стінок дріжджів екзометаболітами Chaetomium
globossum Kunze, які були виконані разом з В.І. Облак. Аналіз і
інтерпретація отриманих результатів проведені разом з науковим
керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи
доповідалися на конференції “Научные исследования в наукоградах
Московской области: От современной фундаментальной биологии к новым
наукоемким технологиям” (Пущино, 2002), конференції “Актуальные проблемы
биологии, медицины и экологии” (Томськ, 2004), VII Міжнародній
науково-практичній конференції “Наука і освіта`2004” (Дніпропетровськ,
2004), VI Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння”
(Харків, 2004) і наукових семінарах у НДІ біології Харківського
національного університету імені В. Н. Каразіна.
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковані 3 статті і
4 тез доповідей.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу
і розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати
власних досліджень та їх обговорення (5 розділів), узагальнення
отриманих результатів і висновків, а також списку цитованої літератури
(260 літературних джерел, з яких 122 іноземних авторів). Робота
викладена на 153 сторінках друкованого тексту і містить 15 таблиць і 18
малюнків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Огляд складається з 4-х підрозділів, у яких наведено
аналіз наукової літератури щодо метаболізму ергостерину: механізмів
синтезу і його регуляції, ролі ергостерину в клітинах дріжджів, а також
залежності накопичення ергостерину в клітинах дріжджів середовища
культивування. Розібрані питання будови клітинної стінки дріжджів і
методи її руйнування. В огляді обґрунтовано вибір напрямків досліджень і
наведені способи вирішення задач, що поставлені у роботі.
Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на дикому штамі
пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.
клітин [Сокурова Е.Н., 1973]. Вміст білка досліджували за методом Лоурі
в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Як стресорні чинники були
обрані температурний і осмотичний шок. Тепловому шоку культуру дріжджів
піддавали у водяному термостаті з температурою 45 ?С. Експозиція
становила 15, 30 і 60 хвилин [Рихванов Е.Г. и др., 2001]. Для вивчення
стійкості клітин дріжджів до осмотичного шоку в культуру дріжджів
вносили NaCl до кінцевої концентрації 1,3 М [Albertyn J. et al., 1994].
Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин. Стійкість культур дріжджів
оцінювали за кількістю мертвих клітин, пофарбованих барвником трипановим
синім. Продуцентами ферментного комплексу були міцеліальні гриби
Chaetomium globossum Kunze:Fr., Trichoderma viride Pers.et Harz.,
Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sp. Статистичну
обробку нормально розподілених даних проводили за допомогою методу
Стьюдента-Фішера [Лакин Г.Ф., 1990]. Рангову кореляцію обчислювали за
Спірманом.
Основні результати та їх обговорення
Зміна деяких морфофункціональних характеристик у процесі тривалого
культивування дріжджів. Старіння клітинних культур внаслідок численних
пересаджень, яке веде за собою зміну вихідних характеристик – це
загальнобіологічна проблема, що стосується як культур мікроорганізмів,
так і рослинних та тваринних клітин. Разом з тим, у наукових
дослідженнях і на виробництві часто застосовується тривале й інтенсивне
пасирування культур, що може вести до морфофункціональних зрушень у
клітинах, обумовлених накопичуванням різних генетичних модифікацій
[Божков А.И. и др., 2000; Голтвянский А.В., 2004], внаслідок чого
культура клітин втрачає свої вихідні характеристики. Дослідження
інтенсивності вторинного метаболізму, про яке судили за вмістом
ергостерину в культурі дріжджів, при тривалому інтенсивному пасируванні
раніше не проводилися.
Метою даного етапу досліджень було визначення вмісту ергостерину в
процесі тривалого культивування дріжджів Saccharomyces cerevisiae (10–15
пасажів – популяційно-“молода” культура і 70-75 пасажів –
популяційно-“стара” культура) і деяких морфофункціональних характеристик
клітин дріжджів. Пересадження культури проводили кожні 14–16 днів, тобто
вік популяційно-“молодої” культури становив 5–6 місяців, а
популяційно-“старої” культури – 3-3,5 роки. Виходячи з цього терміни
популяційно-“молода” і популяційно-“стара” культура у даному випадку
відбивають саме популяційний вік культури дріжджів.
До 14-ї доби росту вміст ергостерину був порівняно невисоким в обох
культурах і істотних розходжень виявлено не було. На 21 добу вміст
ергостерину в популяційно-“молодій” культурі був на 23% вище, ніж у
“старій” (табл. 1).
Таблиця 1
Вміст ергостерину в клітинах популяційно-“молодої” і
популяційно-“старої” культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae у
контролі та при внесенні у середовище 0,3 % етилового спирту в першу
добу культивування (n=20) (середовище росту: 1% глюкоза, 0,5% сусло,
0,5% дріжджовий екстракт)
Кількість
пасажів Тривалість
клітин
контроль
0,3% етиловий спирт
10 – 15 14
12,6 ± 0,7
14,6 ± 0,9
21
16,1 ± 0,7
21,9 ± 0,7
70 – 75 14
11,5 ± 0,9
13,4 ± 0,8
21
12,3 ± 0,6*
14,8 ± 0,9*
* – Р 4p ? &-& &:&o&0'8(T(V(^(‚*l+ +ue+ue/nen/aUan/e/uen/ue/ue/ue/ue/ue/ue/nOnOnOnuenue IueIue/ueEA?EueAEuen?n?n?n?n?n?n?nueEue ???h$ ¤ O ?"?????? ??????????? $ до концентрації 0,1 мг/мл не приводило до достовірних змін досліджуваних показників: вміст ергостерину, кількість мертвих клітин, інтенсивність дихання культури і вміст у ній продуктів перекисного окислення ліпідів були на рівні контролю (табл. 3). Таблиця 3 у першу добу росту (n=5) Концентрація , мг/мл Кількість мертвих клітин, % Вміст ергостерину, клітин Вміст МДА, нмоль на мг білка Інтенсивність дихання, клітин Контроль 1,00 ? 0,05 14,40 ? 0,35 0,072? 0,005 15,6 ? 1,4 0,1 1,00 ??0,03 15,27 ? 0,35 0,074? 0,009 16,1 ? 2,5 0,5 0,90 ??0,02 18,15 ? 0,77* 0,079? 0,009 17,5 ? 2,0 1,0 1,90 ??0,05* 12,70 ? 0,45* 0,084? 0,010 9,6 ? 1,5 * * - Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
