.

Особливості функціонального стану нирок у підлітків із первинною артеріальною гіпертензією (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
133 3150
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ

І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ЛОМНИЦЬКА МАРТА ІГОРІВНА

УДК 618.11-006.6:616.13-073.756.4:616.155.3-097.37:577.2-037

Ангіогенез в раку яєчника: цитокінна регуляція та прогностичне значення

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті ім.
Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник – кандидат медичних наук, доцент

Володько Наталія Антонівна,

Львівський національний медичний університет

ім. Данила Галицького, старший науковий

співробітник кафедри онкології та медичної радіології.

Офіційні опоненти: – доктор медичних наук

Поліщук Людмила Захарівна,

Інститут експериментальної патології, онкології

і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів протипухлинної терапії; м. Київ.

– кандидат медичних наук

Ціп Наталія Павлівна,

Інститут онкології АМН України,

старший науковий співробітник

науково-дослідного відділення онкогінекології; м. Київ.

Провідна установа – Національний медичний університет ім.

О.О.Богомольця МОЗ України, кафедра онкології,

м. Київ.

Захист відбудеться „ 14 ”грудня 2005 р. об 1100 на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України
(03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий „_12_”листопада 2005р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.БОРОДАЙЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Рак яєчника (РЯ) є найчастішою причиною смерті
пацієнток із онкогінекологічними захворюваннями (Abdollahi T., 2004).
Висока летальність обумовлена безсимптомністю перебігу захворювання,
внаслідок чого у 75% випадків РЯ виявляють на III-IV стадії пухлинного
процесу, що погіршує прогноз та результати лікування (Воробйова Л.І.,
2003). Захворюваність на РЯ в Україні у 2004р. за даними Національного
Канцер-Реєстру складала 15,2 на 100 тис. населення. Високими є показники
смертності від РЯ, у тому числі протягом першого року після встановлення
діагнозу (станом на 2004 рік – 35,6% хворих) (Бюлетень Нац.
Канцер-Реєстру України, 2005). П’ятирічна виживаність хворих на РЯ
становить 15-25% і протягом останніх 30 років майже не змінилась
(Кулаков В.И., 1999). Щороку від РЯ помирає більше жінок, ніж від раку
шийки матки та ендометрію разом узятих (Гилятудзинова З.Ш. та співавт.,
2000).

Таким чином, актуальним є визначення додаткових параметрів, які б
характеризували ріст та агресивність РЯ, сприяли індивідуалізації та
підвищенню ефективності лікування хворих. Одним із таких напрямків є
вивчення ангіогенезу РЯ і механізмів його регуляції, а також
асоційованих з ангіогенезом діагностичних та прогностичних параметрів,
терапевтичних мішеней (Brown M.R. et al., 2000; Bamberger E.S. et al.,
2002; Paley P.J. et al., 2002).

За даними літератури ріст та метастазування злоякісних пухлин прямо
залежать від їх кровопостачання (Paley P.J., 2002; Carmeliet P., 2003).
Від активності ангіогенезу залежить ріст РЯ, розвиток асциту та
метастазування РЯ (Bamberger E.S. et al., 2002). Однак, немає
одностайної думки щодо прогностичної цінності ступеня
мікроваскуляризації РЯ, адже одними авторами підтверджується його
прогностичне значення щодо загальної (Wang Z. et al., 2000) та
безрецидивної (Raspollini M.R. et al., 2004) виживаності хворих, а
іншими – спростовується (Obermair A. et al., 1999; Nakayama K. et al.,
2001).

До активаторів ангіогенезу злоякісних пухлин належать регуляторні
молекули цитокіни, що синтезуються пухлинними клітинами,
ендотеліоцитами, інфільтруючими пухлину макрофагами: фактор росту
ендотеліоцитів судин (ФРЕС) (Ferrara N., 2000; Новак О.Є., 2002),
основний фактор росту фібробластів (оФРФ) (Poole T.J. et al., 2001)
тощо. Підвищена експресія ФРЕС у РЯ є несприятливою прогностичною
ознакою (Kassim S.K. et al., 2004). Роль таких цитокінів як фактор
некрозу пухлин-? (ФНП-?) та трансформуючий фактор росту-? (TФР-?) в
регуляції ангіогенезу РЯ, дотепер залишається нез’ясованою. У системах
in vitro та in vivo ФНП-? та TФР-? здатні як пригнічувати, так і
стимулювати ангіогенез, що обумовлено активністю компонентів
внутрішньоклітинних сигнальних шляхів ФНП-? та TФР-? (Souchelnytskyi S.,
2002; Lamouille S. et al., 2002; Lдtti S. et al., 2003). Одним із
сучасних підходів до визначення представників сигнальних шляхів
цитокінів та їх функціональної активності є ідентифікація
цитокін-регульованих білків за допомогою аналізу протеому клітин (Figeys
D., 2003; Ping P., 2003; Blagoev B. et al., 2003).

При розвитку РЯ часто зустрічається дисфункція генів-супресорів
пухлинного росту BRCA1, p53, р57 та кодованих ними білків (Schuijer M.
et al., 2003). Дисфункції BRCA1 належить одне із провідних місць у
розвитку як успадкованого, так і спорадичного РЯ (Zheng W. et al., 2000;
Hilton J.L. et al., 2002). Встановлено, що білок BRCA1 взаємодіє із ФРЕС
(Kawai H. et al., 2002), однак роль першого у регуляції ангіогенезу РЯ
не вивчалась. Для РЯ характерними є мутаційні та немутаційні пошкодження
гену р53 (Cadwell C. et al., 2001; Halperin R. et al., 2001), а з
пошкодженням гену р57 пов’язаний розвиток раку грудної залози, сечового
міхура, легень, нирки, яєчок (Lee M.H. et al., 2001), але зв’язок цих
змін із особливостями ангіогенезу остаточно не визначений, на що вказує
низка робіт (Lee J.S. et al., 2003; Lim J.J. et al., 2003).

Одним із напрямків досліджень в онкології протягом останніх років є
розробка антиангіогенної терапії злоякісних пухлин специфічними та
неспецифічними інгібіторами ангіогенезу (Folkman J., 1999; Mross K.,
2000; Kerbel R. et al., 2002), цитостатиками (Hanahan D. et al., 2000,
Kerbel R. et al., 2004). Антиангіогенна дія інтерферону-?2b (ІФН-?2b) та
цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду, паклітакселу) у низьких дозах
і доцільність їх застосування у хворих на РЯ не з’ясовані.

Таким чином, незважаючи на значну кількість досліджень, присвячених
різним аспектам РЯ, ангіогенез РЯ, його цитокінна регуляція,
прогностичне та клінічне значення для хворих залишаються остаточно
невивченою актуальною проблемою онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота
виконана у відповідності з планами науково-дослідних робіт кафедри
онкології та медичної радіології Львівського національного медичного
університету ім. Данила Галицького за темою: „Індивідуалізація
комплексного лікування раку грудної залози, жіночих статевих органів,
травного тракту та гемобластозів на основі об’єктивних факторів прогнозу
і перебігу захворювання” (№ Держреєстрації 0102U00722; роки виконання:
2002-2006).

Мета дослідження – визначити роль ріст-інгібуючих цитокінів і білків
генів-супресорів пухлинного росту в регуляції ангіогенезу РЯ та оцінити
прогностичне значення мікроваскуляризації РЯ для індивідуалізації
лікування хворих.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання
дослідження:

1. Дослідити мікроваскуляризацію РЯ, оцінити її клініко-прогностичне
значення та зв’язок із 3- і 5-річною виживаністю.

2. Визначити концентрацію цитокінів ФНП-? та ТФР-? у супернатантах
первинних клітинних культур РЯ і у плазмі крові пацієнток та їх зв’язок
із особливостями мікроваскуляризації пухлин.

3. Дослідити особливості експресії тумор-супресорних білків BRCA1, р53
та р57 у клітинах РЯ з різним ступенем мікроваскуляризації.

4. Визначити функціональні білкові мішені ТФР-? в ендотеліоцитах
мікросудин та оцінити роль ідентифікованих білків у регуляції
ангіогенезу.

5. З’ясувати вплив ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-?, ТФР-?, ІФН-?2b) та
цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) на
функціональну активність ендотеліоцитів мікросудин у системі in vitro.
Обгрунтувати можливість використання ІФН-?2b у “метрономному режимі” для
лікування хворих на РЯ.

Об’єкт дослідження – 125 хворих на РЯ І – IV стадії захворювання.

Предмет дослідження – механізми ангіогенезу РЯ, пов’язані із цитокінами
ТФР-? і ФНП-? та білками генів-супресорів пухлинного росту BRCA1, p53 та
p57; клінічне та прогностичне значення ангіогенез-асоційованих
параметрів.

Методи дослідження – клінічні, гістологічні, імуногістохімічні,
культуральні, тест захоплення [3Н]-тимідину, метилтетразолієвий тест,
імуноцитохімічні, протеомікс – двомірний електрофорез білків,
масс-спектрометрія, імуноблотинг білків, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше встановлена обернена залежність між активністю ангіогенезу РЯ та
рівнем експресії ФНП-? пухлиною.

Вперше досліджено зміни білкового спектру ендотеліальних клітин
мікросудин під впливом ТФР-?, ідентифіковано і проведено функціональний
аналіз 54 білків та ідентифіковано білки, що взаємодіють із основним
компонентом сигнального шляху ТФР-? – білком Смад3.

Визначено залежність активності ангіогенезу РЯ від стадії пухлинного
процесу, гістологічної будови РЯ та ступеня диференціації його клітин і
прогностичну цінність ступеня мікроваскуляризації РЯ для загальної
тривалості життя та 3- і 5-річної виживаності хворих.

Показано зв’язок активації ангіогенезу РЯ зі зниженням експресії
тумор-супресорних білків BRCA1 та p57 у клітинах пухлини, асоціацію
гіперекспресії білка р53 у клітинах РЯ із високим ступенем
мікроваскуляризації пухлини.

Встановлено залежність загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної
виживаності хворих на РЯ від ступеня експресії білка BRCA1 у клітинах
пухлини.

Показано пряму антипроліферативну та проапоптотичну дію ІФН-?2b у
низьких дозах та пряму антипроліферативну дію цис-платину,
циклофосфаміду та паклітакселу у низьких дозах на ендотеліальні клітини
мікросудин.

Практичне значення одержаних результатів.

Запропоновано визначення ступеня мікроваскуляризації РЯ
імуногістохімічним методом із антитілами до фактора VIII для оцінки
прогнозу загальної тривалості життя та 1-, 3- і 5-річної виживаності
хворих.

Запропоновано визначення ступеня експресії тумор-супресорного білка
BRCA1 у клітинах РЯ як показника загальної тривалості життя та 1-, 3- і
5-річної виживаності пацієнток.

Вперше обґрунтовано доцільність застосування ріст-інгібуючого цитокіну
ІФН-?2b із антиангіогенною метою у комбінованому лікуванні хворих на РЯ
та проведено апробацію введення цитокіна у антиангіогенному
низькодозовому „метрономному режимі” у хворих із хіміорезистентним РЯ.

Результати роботи впроваджені у Закарпатському, Івано-Франківському,
Тернопільському обласних онкологічних диспансерах.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено клінічний відбір хворих на
РЯ, відбір гістологічних блоків у патологоанатомічному відділенні
Львівського державного онкологічного регіонального
лікувально-діагностичного центру, аналіз документації канцер-реєстру,
імуногістохімічні дослідження РЯ та аналіз їх результатів. Автором
виконано інтраопераційний забір зразків РЯ, проведено ензимну
дезагрегацію із отриманням первинних клітинних культур РЯ та їх добових
супернатантів. Автором виконано вимірювання концентрації цитокінів ФНП-?
та ТФР-? у супернатантах первинних клітинних культур РЯ біологічним
методом. Автор брала участь у клінічному обстеженні та лікуванні
(оперативному, хіміотерапевтичному та антиангіогенному) хворих на РЯ,
проводила моніторинг пацієнток, що отримували антиангіогенну терапію із
використанням ІФН-?2b. У Людвіг-Інституті дослідження раку (м. Упсала,
Швеція) автор виконала дослідження впливу ІФН-?2b та цитостатиків у
низьких дозах на проліферацію та апоптоз ендотеліоцитів мікросудин in
vitro. Автор виконала двомірний електрофорез білків, масс-спектрометрію,
і вивчила зміни білкового спектру ендотеліоцитів мікросудин під впливом
ТФР-? та ідентифікацію білків, що взаємодіють з білком Смад3. Автор
проаналізувала результати, оформила їх у статтях та доповіла на
конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
представлені та обговорені на: ІХ Міжнародному конгресі студентів та
молодих вчених (Тернопіль, 2005); І-му Українському Конгресі клітинної
біології (Львів, 2004); 14-й Європейській конференції студентів та
молодих вчених (Німеччина, 2003); Міжнародній зустрічі дослідників ТФР-?
(Швеція, 2003); Міжнародному форумі „Онкологія-ХХІ” (Київ, 2003);
конференції „Проблеми онкоімунології” (Київ, 2003); Міжнародній медичній
конференції студентів та молодих науковців (Дніпропетровськ, 2001); 11-й
Європейській конференції студентів та молодих вчених (Німеччина, 2000);
2-й Міжнародній медичній конференції студентів та молодих лікарів із 9-м
Міжнародним симпозіумом Європейської асоціації студентів-медиків
(Польща, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 статей у
провідних фахових журналах, в тому числі – у 2 іноземних, та 17 тез у
матеріалах конференцій, в тому числі – міжнародних.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 8
розділів, висновків, практичних рекомендацій. Вона викладена на 149
сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 33 таблицями та 41 рисунком,
містить додатки (6 сторінок). Список літератури включає 353 літературні
джерела (англомовних – 330, українських і російських – 23) на 37
сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на базі
Львівського державного онкологічного регіонального
лікувально-діагностичного центру (ЛДОРЛДЦ), у науково-дослідному секторі
кафедри онкології та медичної радіології Львівського національного
медичного університету ім. Данила Галицького та у Людвіг-Інституті
дослідження раку (м. Упсала, Швеція).

Клінічну групу склали 125 хворих на РЯ, які лікувались протягом
1995-2005рр. Середній вік пацієнток становив 54,7?0,9 років (90,4%
хворих вікового діапазону 45 – 65 років). У 48(38%) хворих була І та ІІ
стадії РЯ, а у 77(62%) – III та IV стадії (за класифікацією FIGO).
Лікування 78 (62,4%) хворих було комбінованим: радикальне оперативне
(екстирпація матки з додатками, оментектомія) із ад’ювантною
поліхіміотерапією (ПХТ), а 35 (28%) полягало у неоад’ювантній ПХТ із
операцією та ад’ювантною ПХТ (за схемою СР – 6 циклів: цис-платин 75,0
мг/м2, циклофосфамід 750,0 мг/м2). У рандомізованій групі 22 хворих із
хіміорезистентним нерезектебельним рецидивним РЯ проведено апробацію
застосування Лаферону у антиангіогенному режимі.

Усім хворим проведено комплексне обстеження (бімануальне,
трансвагінальне ультразвукове дослідження органів малого тазу, черевної
порожнини із допплер-ефектом, рентгенобстеження органів грудної клітки,
визначення рівня СА-125 у плазмі крові, цитологічне дослідження асцитної
рідини, фіброезофагогастродуоденоскопія, ректороманоскопія, цистоскопія,
колоноскопія), за показами – комп’ютерну томографію тазу. Опрацьовано
історії хвороб, амбулаторні картки, матеріали Національного
Канцер-реєстру.

Проведено інтраопераційний забір пухлинного матеріалу та підбір
парафінових блоків видалених пухлин поточного та ретроспективного
матеріалу (103 хворих на РЯ). Для оцінки виживаності хворих на РЯ
відібрано групу з 66 пацієнток, період спостереження за якими
перевищував 5 років від початку специфічного лікування. На клінічному
матеріалі 49 хворих (частина з них із попередньої групи) проведено
дослідження зв’язку ангіогенезу РЯ із експресією білків генів-супресорів
пухлинного росту, на 37 із них – із експресією цитокінів.

Для експериментальної частини дослідження використано наступні методи:
клінічні; гістологічні; імуногістохімічні з моноклональними антитілами
до фактора VIII для візуалізації ендотеліоцитів мікросудин із наступним
підрахунком останніх під світловим мікроскопом (20 полів зору, *1500), а
також – з моноклональними антитілами до білків BRCA1, p53 та p57 для
вивчення експресії цих білків у клітинах РЯ. Експресію білка BRCA1
вважали слабкою при його експресії у 10-30% клітин, помірною – у 31 –
50% клітин, сильною – понад 50% клітин. Експресію у 10 – 25% клітин
ввавжали легкою, у 26 – 50% клітин – помірною, у понад 50% клітин –
сильною. Експресію білка р57 вважали позитивною при експресії у 50%
клітин. Біологічним методом із клітинами ліній L929 та Mv1Lu (CCL64)
визначено концентрацію цитокінів ФНП-? і ТФР-?, відповідно. Клітини
лінії ендотеліоцитів мікросудин дерми людини для вивчення впливу
ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-?, ТФР-?, ІФН-?2b), цитостатиків
(цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) на ці клітини та для
дослідження ТФР-?-залежного білкового спектру цих клітин. Виділення
первинних клітинних культур РЯ проводили шляхом ензимної дезагрегації
пухлин і короткотривалого культивування для отримання добових
супернатантів первинних клітинних культур РЯ та визначення концентрації
ФНП-? і ТФР-? у них. Для вивчення проліферації клітин та її змін під
впливом ріст-інгібуючих цитокінів (ФНП-?, ТФР-?, ІФН-?2b) та
цитостатиків (цис-платину, циклофосфаміду і паклітакселу) використано
тест захоплення [3Н]-тимідину та метилтетразолієвий тест. Для
візуалізації апоптозу в ендотеліоцитах мікросудин реагентом ДАФІ
використано імуноцитохімічний метод. Проведено аналіз
ТФР-?-регульованого протеому ендотеліальних клітин мікросудин: двомірний
електрофорез білків на апараті Dalt-Six (Amersham Biosciences) для
розділення білків лізатів ендотеліальних клітин мікросудин, що
інкубувались із ТФР-?1 (5,0 нг/мл) або без нього, за молекулярною масою
(до 250 кДа) та градієнтом рН (3-10). Проведено статично обґрунтований
аналіз двомірних електрофореграм білків з допомогою комп’ютерної
програми ImageMaster2DElite (Amersham Biosciences, Швеція) для відбору
білкових точок і наступною їх трипсинізацією до пептидних сумішей.
Масс-спектрометрію пептидних сумішей проведено на апараті Bruker
Autoflex MALDI (Bruker Daltonics, Німеччина) для ідентифікації окремих
пептидів, за вмістом, яких за допомогою систем MASCOT ( HYPERLINK
“http://www.matrixscience.com” www.matrixscience.com ) і ProFound (
HYPERLINK “http://65.219.84.5/service/prowl/profound.html),
ідентифіковано білки.” http://65.219.84.5/service/prowl/profound.html),
ідентифіковано білки. Правильність ідентифікації підтверджено
імуноблотингом білків з комерційними антитілами. Статистичні методи
аналізу результатів дослідження проведено за допомогою комп’ютерної
програми STATISTICA 6.0. (StatSoft Inc.,1994-2001 – HYPERLINK
“http://www.statsoft.com” www.statsoft.com ) для визначення критерію
Ст’юдента (t), коефіцієнтів відповідності (?2) та кореляції (r),
загальної тривалості життя однопоказниковим методом Каплана-Меєра,
незалежних факторів прогнозу багатопоказниковим методом регресійних
моделей ризику Кокса.

Результати досліджень та їх обговорення

Прогностичне значення мікроваскуляризації (МВ) раку яєчника

Після імуногістохімічної візуалізації мікросудин з’ясувалось, що ступінь
МВ РЯ не є однорідним, зокрема, кількість мікросудин у 20 полях зору
(?1500) коливалась від 24 до 156. Тому за дискримінантою у 75
мікросудин, хворих на РЯ розділено на дві групи – із високим ступенем
мікроваскуляризації (ВМВ – 100,2±4,7 мікросудин) та низьким ступенем
мікрваскуляризації (НМВ – 51,6±2,2 мікросудин). У хворих, лікування яких
розпочиналось із оперативного, спостерігалась однакова кількість
пацієнток із ВМВ та НМВ РЯ: у 27 (32%) хворих на РЯ спостерігали ВМВ, а
у 30 (35%) – НМВ. Натомість, серед хворих на РЯ, лікування яких
розпочиналось із неоад’ювантної ПХТ, переважали пухлини, які
характеризувались ВМВ (20 випадків із 28 – 71,4%). Середня кількість
мікросудин пухлин у цій групі була достовірно вищою (119,0±4,4), ніж у
пацієнток, яким відразу проводилось радикальне оперативне лікування
(екстирпація матки з додатками, оментектомія) (t=2,94, p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020