УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
”ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”
Грінченко Дмитро Миколайович
УДК 619:616-085.371:578.831.1:636.5:616-097.3
Імуностимуляція курчат екстрактом лімфоїдним птахів-реконвалесцентів при
щепленні проти ньюкаслської хвороби
16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового степеня
кандидата ветеринарних наук
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії
Міністерства аграрної політики України.
Науковий керівник – доктор ветеринарних наук, професор,
заслужений працівник сільського господарства України Апатенко
Володимир Максимович, Харківська державна зооветеринарна академія,
професор кафедри мікробіології і біотехнології.
Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН
Красніков Геннадій Андрійович, Національний науковий центр
“Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”,
завідувач лабораторії патоморфології;
кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Безрукава Інна
Юріївна, Інститут птахівництва УААН, завідувач відділу профілактики
хвороб птиці.
Провідна установа – Сумський національний аграрний університет, кафедра
вірусології, патологічної анатомії, ветеринарно-санітарної експертизи,
Міністерство аграрної політики України, м. Суми.
Захист відбудеться “24” квітня 2007 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі
“Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за
адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового
центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за
адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.
Автореферат розісланий “21” березня 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор ветеринарних наук, професор А.Ф.Бабкін
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Птахівництво в даний час інтенсивно розвивається і
потребує сучасного ветеринарного забезпечення.
Наявність прискорених еволюційних процесів зумовила ускладнення
епізоотичної ситуації, підвищення патогенних властивостей збудника,
поширення інфекційних захворювань.
Пошук нових імуностимулюючих препаратів продовжується з урахуванням
всезростаючих потреб у зв’язку з широким поширенням імунодефіцитів
(Андреєва А.В., 2003; Апатенко В.М., 1996; Аріон В.Я, 1994; Басова Н.Ю.,
2003; Красніков Г.А., 2003 та ін.).
Проблема імунного захисту є актуальною і пов’язана з імунодефіцитами,
які широко поширені в птахівництві. У зв’язку з цим необхідні заходи,
спрямовані на підвищення імунного статусу, насамперед, у молодняка.
За такої епізоотичної ситуації необхідним є підвищення природної
резистентності із застосуванням імуностимуляторів як із лікувальною, так
і з профілактичною метою.
Відомо, що імуностимулятори підсилюють функціональні властивості
імунокомпетентної системи та можуть нейтралізувати імунодепресивну дію.
Загрозу інфекційних захворювань можна попередити вакцинацією, а для
підвищення ефективності вакцин багато дослідників пропонують
застосовувати імуностимулятори різного походження та різних форм.
(Б.Я.Бірман, И.М.Громов, 2000).
З цією метою застосовується великий арсенал рослинних, тваринних і
синтетичних імуностимуляторів різних модифікацій за різних способів
застосування.
Пошукові роботи у цьому напрямку тривають. Потрібні високоефективні,
доступні та недорогі препарати, які мають бути нешкідливими при
застосуванні.
З урахуванням цих вимог лімфоїдні імуностимулюючі препарати мають
пріоритет як фізіологічні природні засоби. Саме у цьому напрямку
виконувалася дана робота.
У проведених дослідах відпрацьовувалась схема виготовлення та вивчалися
імуностимулюючі властивості лімфоїдного імуностимулятору (ЕЛПР),
виготовленого з тимусу, бурси Фабриціуса та селезінки. Крім того,
досліджувався вплив цього екстракта на результати вакцинації живою
вірус-вакциною проти ньюкаслської хвороби.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема
дисертаційної роботи є частиною науково-дослідної роботи кафедри
мікробіології і біотехнології Харківської державної зооветеринарної
академії, що виконується згідно з програмою УААН „Визначення деяких
імунологічних показників птиць та вживання імуностимуляторів
виготовлених з лімфоїдної тканини” (2004-2006), держреєстрація №
0104U009817.
Мета і задачі досліджень. Метою роботи було розробити спосіб
імуностимуляції курчат новим препаратом ЕЛПР, вивчити його
імуностимулюючі властивості, спосіб застосування для підвищення імунного
статусу птахів, встановити можливий вплив ЕЛПР на посилення імунної
відповіді при вакцинації проти ньюкаслської хвороби.
У роботі було поставлено такі завдання:
– обґрунтувати та розробити технологію одержання лімфоїдного екстракту з
використанням тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки курчат;
– провести біологічний контроль екстракта на мікробну та вірусну
контамінації, нешкідливість, апірогенність та біологічну активність;
– визначити оптимальну дозу, метод і терміни застосування екстракта;
– провести імуноморфологічні дослідження в динаміці та у залежності від
віку птиці, схеми застосування і методу вживання.
Об’єкт дослідження – імунна реактивність курчат при стимуляції
імунокомпетентної системи.
Предмет дослідження – стимуляція імунітету курчат екстрактом лімфоїдним
птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) і підвищення імунної відповіді при
щепленні проти ньюкаслської хвороби.
Методи досліджень – робота виконувалася з використанням серологічних,
бактеріологічних, вірусологічних, імуноморфологічних, морфометричних і
біохімічних методів. Статистичну обробку результатів проводили за
програмою Microsoft Еxcel на персональному комп’ютері.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні
– розроблено новий імуностимулятор, виготовлений з пташиних лімфоїдних
органів: тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки;
– встановлено, що виготовлений екстракт має імуностимулюючі властивості
та підвищує імунний статус курчат при ентеральному введенні;
– при застосуванні даного екстракту разом із щепленням проти
ньюкаслської хвороби імунна відповідь значно підвищується.
Наукова новизна одержаних результатів підтверджується трьома патентами:
Деклараційний патент 5365 Україна, МКІ A61К39/12, А61К35/74. Спосіб
вакцинопрофілактики птиці проти хвороби Ньюкасла / Д.М. Грінченко, В.М.
Апатенко. – №2004032289; Заявлено 29.03.2004; Опубл.15.03.2005, Бюл. №
3. – 3с.
Деклараційний патент 3753 Україна, МКІ А61К39/12, А61К35/74. Спосіб
виготовлення імуностимулятора „ЕЛПР” / Д.М. Грінченко, В.М. Апатенко. –
№2004031536; Заявлено 02.03.2004; Опубл. 15.12.2004, Бюл. № 12. – 3с.
Деклараційний патент 7403 Україна, МКІ А61К39/12, А61К35/74. Спосіб
підвищення іммунної відповіді при вакцинації птиці проти хвороби
Ньюкасла / В.М. Апатенко, Д.М. Грінченко, О.І. Сосницький, В.П.
Заболотна. – №20041210170; Заявлено 10.12.2004; Опубл. 15.06.2005, Бюл.
№ 6. – 4с.
Практичне значення отриманих результатів. На основі результатів
експериментальних досліджень розроблено „Методичні рекомендації щодо
застосування екстракту лімфоїдного птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) для
підвищення рівня імунного статусу курчат і для посилення імунної
відповіді при вакцинації”, які ухвалені науково-методичною радою
Державного департаменту ветеринарної медицини від 23 грудня 2005 року,
протокол № 3, та затверджені Державним департаментом ветеринарної
медицини Міністерства аграрної політики України.
Запропонований в умовах господарства новий імуностимулюючий ЕЛПР при
введенні курчатам ентерально дає змогу підвищити імунний статус і
збереженість молодняка птиці.
Матеріали дисертації використовуються в навчальному процесі у курсах
мікробіології, біотехнології та імунології і включені до спецкурсу
„Хвороби птиці” для студентів факультету ветеринарної медицини
Харківської державної зооветеринарної академії.
Особистий внесок здобувача: автором самостійно проведено весь обсяг
експериментальних досліджень, аналіз отриманих результатів і їх
статистична обробка та узагальнення. Самостійно опрацьований
літературний огляд, освоєно складні методи досліджень, організовано і
проведено лабораторні та виробничі експерименти.
Розроблено „Методичні рекомендації щодо застосування екстракту
лімфоїдного птахів-реконвалесцентів (ЕЛПР) для підвищення рівня імунного
статусу курчат і для посилення імунної відповіді при вакцинації”.
Розроблений імуностимулюючий ЕЛПР запропоновано для виробництва.
Апробація результатів дисертації: Результати досліджень були
представлені та обговорені на засіданнях кафедри мікробіології і
біотехнології та на науково-практичних конференціях: Наукова конференція
за міжнародної участі, присвячена 160-річчю з дня народження
І.І.Мєчнікова (Харків, ХДЗВА, І грудня 2005); Міжнародна
науково-практична конференція „Ветеринарна медицина – 2005” (м. Ялта, АР
Крим, 30 травня – 4 червня 2005); Міжнародна науково-практична
конференція „Проблеми птахівництва”(м. Ялта, 26 жовтня 2005р); Курсова
науково-теоретична конференція (м. Харків, ХДЗВА, 26 листопада 2005р);
VI з’їзд паразитоценологів України за міжнародної участі (11-13 жовтня
2006 року, м. Харків, ХДЗВА).
Публікації. Матеріали дисертаційної роботи викладено в 10 наукових
публікаціях, у тому числі 7 – у фахових виданнях та 2 з них –
одноосібні. Крім того, отримано патенти та розроблено методичні
рекомендації, затверджені на засіданні науково-методичної Ради
Державного департаменту ветеринарної медицини від 23 грудня 2005 року,
протокол № 3.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 144 сторінках
комп’ютерного тексту, ілюстрована 8 таблицями, 13 фотографіями та 2
малюнками.
Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів
і методів дослідження, власних досліджень, обговорення результатів
дослідження, висновків, пропозицій виробництву і списку цитованої
літератури, який містить 286 найменувань, зокрема 76 іноземних.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлена робота виконувалась як самостійний розділ теми ХДЗВА
„Визначення деяких імунологічних показників птиць та вживання
імуностимуляторів виготовленних з лімфоїдної тканини”
Робота виконувалася на кафедрі мікробіології і біотехнології та на базі
кафедри анатомії і гістології Харківської державної зооветеринарної
академії, в лабораторії біохімії ННЦ „Інституту експериментальної та
клінічної медицини” та в інституті медичної радіології АМН України.
Для виготовлення ЕЛПР застосовували лімфоїдні органи: тимус, бурсу
Фабриціуса та селезінку.
Матеріал відбирали під час забою птиці на конвеєрі. Відібраний матеріал
зберігали в морозильній камері холодильника як сировинний матеріал.
Для виготовлення ЕЛПР лімфоїдні органи були відібрані в загальній
кількості від 900 забитих бройлерів.
При вивченні властивостей отриманого ЕЛПР та при визначенні його
імуностимулюючої ефективності проводились експериментальні дослідження в
загальній кількості на 151 курчаті.
В умовах виробництва дослідження було проведено на 500 курчатах,
вакцинованих проти ньюкаслської хвороби.
Реакцію гемаглютинації (РГА) та реакцію затримки гемаглютинації (РЗГА)
проводили за загальновідомими методиками. У РГА визначали титри вірусу,
а в РЗГА – титри антигемаглютинінів.
Серологічні дослідження проводили при визначенні рівня поствакцинального
імунітету після щеплення вірус-вакциною „Ла-Сота” проти ньюкаслської
хвороби.
Визначення імуноглобулінів основних класів (А, М, G) у сироватці крові
проводили за методом G. Mancini простої радіальної імунодифузії в гелі.
У дослідах використовували Bactoagar typ USY (Німеччина), еталонні та
моноспецифічні сироватки проти Ig птахів. Еталонні сироватки відповідали
світовим стандартам.
Загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їхній
фракційний склад за молекулярною масою визначали методом преципітації в
розчині поліетиленгліколя з молекулярною масою 6000 Дальтон за М.Digeon
et al. у модифікації Г. Фримеля (1987).
Рівень серомукоїдів визначали турбідиметричним методом за В.С.
Калашниковим.
Бактерицидну активність сироватки крові визначали за оптичною густиною
м’ясо-пептонного бульйону (МПБ) при рості в ньому мікробів з додаванням
та без додавання досліджуваної сироватки. Для постановки реакції
використовували 24-годинні бульйонні культури E. coli штаму 0111.
Реакцію ставили за загально прийнятою методикою.
Для визначення лізоцимної активності використовували ацетоновий порошок
культури Micrococcus lysodeіcticus, штаму 2665.
Імуноморфологічні дослідження проводилися на макроскопічному та
мікроскопічному рівнях.
При макроскопічному дослідженні проводили огляд піддослідних тварин і
внутрішніх органів. Розраховували індекси тимуса, бурси Фабриціуса та
селезінки.
На мікроскопічному рівні імуноморфологічні дослідження проводили із
застосуванням гістологічних досліджень та морфометричних методів.
Гістологічні дослідження проводили на кафедрі анатомії та гістології
ХДЗВА та у відділі морфології Харківського науково-дослідного інституту
медичної радіології.
Досліджували тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку. У деяких випадках
досліджували сліпі відростки кишківника та печінку. Відібраний матеріал
фіксували 10%-им нейтральним формаліном та рідиною Карнуа. Готували
парафінові зрізи, проводили загальне фарбування гематоксилін-еозином та
фарбували за Браше для виявлення РНК.
Морфометричними вимірами бурси Фабриціуса у п’яти найбільш великих
лімфоїдних вузликах визначали середню товщину кіркового шару шляхом
підрахунку кількості рядів клітин у широкій та вузькій його частинах.
Підраховували морфо-функціональний потенціал (МФП) лімфоїдних вузликів
шляхом множення довжини лімфоїдних вузликів на ширину їхнього кіркового
шару з подальшим сторазовим зменшенням результату.
При імуноморфологічному дослідженні тимусу враховували розвиненість
кіркового шару. Для цього обчислювали співвідношення товщини мозкової
речовини з товщиною кіркового шару з обох сторін часточки по її
середині. Отримували мозково-кіркове співвідношення (МКС).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНІЙ АНАЛІЗ
Обґрунтування виготовлення ЕЛПР. В умовах широкого поширення
імунодефіцитів необхідна імунологічна реабілітація із застосуванням
стимуляторів імунокомпетентної системи. У медичній та ветеринарній
практиці широко застосовують Т-активін, який готують з лімфоїдної
тканини тимусу теляти в умовах складної заводської технології.
Нами було розроблено більш просту технологію виготовлення
імуностимулятора пташиного походження не лише з тимусу, а й з бурси
Фабриціуса та селезінки.
Технологічна схема виготовлення та біологічного контролю ЕЛПР. Сировину
для виготовлення екстракту одержували від клінічно здорових птахів під
час забою. Відбирали тимус, бурсу Фабриціуса і селезінку. Відібраний
матеріал звільняли від сполучнотканинних капсул, плівок, жирових
накопичень і пропускали через електром’ясорубку. Потім додатково
подрібнювали гомогенізатором до повної однорідності одержаної маси, яка
набувала консистенції пасти. З метою руйнування клітин для одержання
більш насиченого екстракту проводили заморожування за мінусової
температури (-12-150 С) протягом 8-12 годин та відтавання у термостаті
за температури 370 С.
Гомогенат лімфоїдної тканини зважували. До нього додавали виготовлений
забуферений фізіологічний розчин рН 7,4 у співвідношенні 1:9, періодично
перемішували і витримували у холодильнику 10 – 12 години за t0 +40С. У
такий спосіб проводили екстрагування лімфоїдної тканини із одержаних
лімфоїдних органів. Для видалення клітинного детриту з одержаної
суспензії застосовували центрифугування при 5000 об/хв упродовж 10 хв. у
великих центрифужних стаканах. Після цього надосадкову рідину
декантирували і використовували далі як екстракт лімфоїдної тканини.
Консервація одержаного екстракту проводилася шляхом додавання
формальдегіду з кінцевою концентрацією 0,125%.
Екстракт стерилізували в два етапи. Спочатку піддавали стерилізуючій
фільтрації крізь систему предфільтр „Startopor” (порозність 1,2 нм),
фільтр „Sartobran” (порозність 0,2 нм), а потім опромінювали
ультрафіолетом.
Після стерилізації та консервації екстракт розфасовували у флакони над
полум’ям спиртівки в умовах стерильного боксу по 200, 100 або 50 см3.
Укупорені флакони закривали ковпачками з алюмінієвої фольги, закатували
та етикетували. Екстракт зберігали в затемненому прохолодному місці за
t0 +2–200С. Термін придатності екстракту – 6 місяців.
Виготовлений ЕЛПР піддавали контролю на бактеріальну контамінацію шляхом
висіву на поживні середовища. Вірусну контамінацію визначали на курячих
ембріонах, яким вводили екстракт і перевіряли на наявність змін.
Крім того, випробовували екстракт на нешкідливість із використанням
білих мишей, яким його вводили інтраперітонеально. Пірогенність
оцінювали на кролях, яким ЕЛПР вводили внутрішньовенно з урахуванням
результатів за показниками температури тіла тварин.
ЕЛПР досліджували на вміст загального білку за методом Біуретта, а також
визначали рН та фізичні якості екстракту.
Визначення оптимальної імуностимулюючої дози ЕЛПР. Оптимальну дозу
визначали в межах 0,1-1,0 см3 на курчатах двотижневого віку при
ентеральному введенні.
Встановлено збільшення показників із збільшенням дозування. Мінімальні
дози 0,1 та 0,3 см3 на голову викликали незначні збільшення у вмісті
імуноглобулінів і збільшення індексів тимусу, селезінки і бурси
Фабриціуса. Доза 0,5 см3 на голову значно відрізнялась у бік збільшення
і досягала показників відповідно: рівень IgG сягав 8,03±0,036 мг/см3
(Р
¦
?
AEi6
n
Oe
O
^
–
?
?
?
?
c
¤
¦
?
?
AE
o
&
F
‹
??????
????
????
??????
????????
??????
!. Кількість Т-лімфоцитів найбільше було виявлено у 6 групі, але
збільшення цього показника проходило нерівномірно. При дозі 0,5 см3
кількість Т-лімфоцитів значно збільшувалась порівняно з контрольною
групою. Найменша кількість В-лімфоцитів була в контрольній групі –
13±0,15 %, а найбільше значення було виявлено у курчат 6 групи – 27±0,23
% (Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
