.

Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
116 2747
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БІЛОКОНЬ ВАЛЕРІЙ ІВАНОВИЧ

УДК 619:578.833.31.

Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М
вірусу класичної чуми свиней

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету
Міністрів України

Науковий керівник – доктор ветеринарних наук, професор

СКИБІЦЬКИЙ Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології

та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Литвин Володимир Петрович, Національний аграрний університет,
професор кафедри епізоотології та інфекційних хвороб тварин

кандидат біологічних наук,

Кучерявенко Олексій Олександрович, Інститут ветеринарної медицини
УААН, заступник директора з наукової роботи

Провідна установа – Білоцерківський державний аграрний

університет Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист дисертації відбудеться “29” червня 2006р. о 13 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному
аграрному університеті за адресою : м. Київ, вул. Героїв оборони 15,
навчальний корпус №3, ауд.65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного
університету за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони 13,
навчальний корпус №4, к.41

Автореферат розісланий “26” травня 2006р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Класична чума свиней (КЧС) – досить поширена інфекція, здатна
спричиняти суттєві економічні збитки свинарським господарствам. Так,
збитки, нанесені епізоотією КЧС у Німеччині, за 10 років склали понад
4 млрд. німецьких марок.

Незважаючи на те, що на території України нині спалахи хвороби
ліквідовані, існує постійна загроза спалаху інфекції, зокрема, у
зв’язку з інтенсивними контактами у господарській та інших сферах
людської діяльності з регіонами, неблагополучними щодо КЧС свиней.

Важливим елементом у профілактиці КЧС є створення
несприйнятливості чутливих тварин шляхом їх імунізації. Оскільки в
Україні, на період визначення напряму дисертаційних досліджень, останні
не були розроблені, перед нами й було поставлено відповідне завдання,
від вирішення якого повністю залежала якість вітчизняного препарату
специфічної профілактики КЧС.

Для специфічної профілактики КЧС застосовувались різноманітні
засоби, зокрема, ряд інактивованих та живих вакцин, гіперімунні
сироватки, практикувалось симультанне щеплення. Найбільших успіхів у
галузі створення вакцин та розробки профілактичних заходів досягли
Каротин А.С.(1935), Дутамура (1935), Дорсет (1935), Кулеско І.І. (1944)
та інші вчені. Застосування інактивованих вакцин проти КЧС зіграло
позитивну роль у зниженні напруженості епізоотичної ситуації у
неблагополучних щодо КЧС регіонах. Проте недостатня імуногенність,
висока вартість та незручності під час щеплення сприяли тому, що
дослідники віддали перевагу аттенуйованим препаратам. Ці препарати, як
правило, високоімуногенні, оперативно забезпечують специфічну
несприйнятливість, значно дешевші від інактивованих, однак часто не
позбавлені реактогенних властивостей і, при певних обставинах, можуть
виявляти імуносупресивну дію.

Було б важливим мати в розпорядженні вакцини обох типів –
інактивовані й живі та використовувати їх залежно від конкретної
епізоотичної ситуації у регіоні.

Актуальність теми. Актуальність теми диктується відсутністю ефективних
засобів специфічної профілактики класичної чуми свиней та постійною
загрозою виникнення цієї хвороби, здатної заподіяти суттєві економічні
збитки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дослідження
виконані згідно з тематикою науково-дослідної роботи кафедри
мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного
університету “ Вивчення клітинного імунітету тварин з метою теоретичного
та експериментального обґрунтування засобів і методів імунопрофілактики”
(номер Держреєстрації – 0101U01755 ), тематикою лабораторії вакцинних
препаратів Інституту ветеринарної медицини УААН (номер Держреєстрації –
0101U000819).

Мета і завдання роботи. Метою роботи було експериментальне
обґрунтування методики культивування вакцинного штаму в процесі
розробки біотехнології вірусвакцини проти КЧС. Для досягнення мети
необхідно було вирішити наступні наукові завдання:

– отримати первиннотрипсинізовані клітинні культури з тестикул овець і
кіз та оптимізувати окремі етапи відповідних методик;

– здійснити дослідження у плані отримання постійної клітинної лінії
тестикул ягнят (ТЯ);

– розробити цитохімічний варіант імуноферментного аналізу для виявлення
та титрування вірусу КЧС у клітинних культурах;

– оптимізувати методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у
первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ;

– охарактеризувати імуногенні властивості вакцинного штаму ЛК-М вірусу
КЧС, репродукованого у клітинній культурі ТЯ, при експериментальній
інфекції у свиней.

Об’єкт дослідження— вакцинний штам ЛК-М вірусу класичної чуми свиней.

Предмет дослідження — культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у
клітинних культурах ТЯ і SК-6, вплив різних факторів на його
врожайність; імуногенність штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у
первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ.

Методи досліджень: вірусологічні (вивчення властивостей вірусного
штаму), імунологічні (визначення впливу вірусного штаму на імунітет
тварин), клінічні (визначення клінічного стану тварин під дією
вакцинного та контрольного штаму класичної чуми свиней),
патологоанатомічні (оцінка характерних змін при загибелі тварин від
класичної чуми свиней), статистичні (визначення достовірності проведених
досліджень).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні розроблено
технологію культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС, яка
забезпечує достатню його урожайність та високі імуногенні властивості.

Розроблено цитохімічний варіант імуноферментного аналізу (ІФА) з метою
виявлення та титрування вірусу КЧС у заражених клітинних культурах.

Вперше охарактеризовано вплив штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у
первиннотрипсинізованій клітинній культурі тестикул ягнят, на деякі
показники клітинного імунітету.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені оптимальні методики
отримання первиннотрипсинізованої клітинної культури із ТЯ, методика
зараження клітинних культур вакцинним штамом вірусу КЧС, методика
виявлення та титрування останнього у клітинних культурах, які були
використані при створенні науково-технічної документації (НТД) на
виготовлення та застосування вакцини ЛК-М проти КЧС, впровадженої у
практику ветеринарної медицини України (ТУУ 46.15.079 – 95), додатки до
ТУУ №1 (2000р.) та №2 (2005р.)

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто отримував біологічний
матеріал (тестикули тварин, сироватку крові), здійснював трипсинізацію,
культивував клітини, оцінював їх моношар, оптимізував параметри
культивування та зараження клітинних культур, визначав титр вірусу й
здійснював усі інші маніпуляції щодо експериментального обгрунтування
результатів, одержаних під час вирішення поставлених у роботі наукових
завдань; аналізував результати власних досліджень, робив наукові
висновки та пропозиції для виробництва. Окремі дослідження виконував
разом з іншими науковцями: Собком Ю. А., Панченком О. О., Вергун Л. Ю.,
Ситюком М. П.

У розробці цитохімічного варіанту ІФА для детекції вірусу брали участь:
кандидат ветеринарних наук Собко Ю. А., кандидати біологічних наук
Вергун Л.Ю. та Темніханов Ю. Д., доктор ветеринарних наук Прискока В.
А., лікар ветеринарної медицини Левченко К. А.

Визначенню впливу вакцинного штаму ЛК-М, репродукованого в клітинній
культурі ТЯ, на деякі показники імунітету сприяв кандидат ветеринарних
наук Столюк В. В.

Експерименти на свинях виконували разом з головним інспектором
ветеринарної медицини Васильківського району Хижняком М.М., приватним
підприємцем Іващенком С.А., науковим співробітником Луком О.М., головним
лікарем районного підприємства ветеринарної медицини Новоушицького
району Візнюком С.П., приватним підприємцем Семеновим О.О., науковим
співробітником ІВМ Ситюком М. П.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень,
викладені у дисертації, були повідомлені й обговорені на щорічних
конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів
Національного аграрного університету (1998 – 2004 рр.), а також на
Всеукраїнській конференції ветеринарних вірусологів у м. Маріуполь (2002
р.), Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини ( 3-4
серпня 2004 р.) та курсах підвищення кваліфікації головних спеціалістів
вірусологічних відділів обласних державних лабораторій ветеринарної
медицини (2001-2005рр.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 7
наукових праць. Із них 6 статей – у фахових виданнях, перелік яких
затверджений ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи:
вступ, огляд літератури, власні дослідження, аналіз та узагальнення
результатів досліджень, висновки та пропозиції виробництву, список
використаних джерел літератури, додатки.

Робота викладена на 168 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована
21 рисунком, у ній наведено 17 таблиць. До списку літератури
входить 257 джерел, у т.ч. 196 – іноземними мовами.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Робота виконана на базі кафедри мікробіології, вірусології та
біотехнології Національного аграрного університету. Частину досліджень
проведено на базі НВП “Біо-Тест-Лабораторія ” (м. Київ), деякі з них –
в умовах Центру з вивчення особливо небезпечних хвороб тварин УААН (м.
Житомир) та у тваринницьких господарствах (К.С.П. “Придніпровське”
Обухівського району Київської області ) .

У процесі виконання роботи були використані штами вірусів, первинні й
перещеплювальні клітинні культури, різні види тварин: свині, вівці,
кози.

Штами вірусу КЧС : штам ЛК-М – вакцинний, отриманий в умовах
НВП “Біо-Тест-Лабораторія” ( за нашою участю) методом клонування
вакцинного штаму ЛК-ВНДІВІМ, адаптований до КК ТЯ (депонований у
Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів
мікроорганізмів, м. Київ);

штам Ші – Минь, одержаний у Центрі з вивчення особливо небезпечних
хвороб тварин (м. Житомир), вірулентний для свиней різного віку при
парентеральному зараженні.

Клітинні культури (КК): постійні лінії клітин РК-15 та SK-6 (
одержані з банку клітинних культур НВП “Біо-Тест-Лабораторія”),
адаптовані до живильних середовищ вітчизняного виробництва: ГЛА, RPMI.
Зберігаються у замороженому стані (- 196 0 С);

первиннотрипсинізована клітинна культура з тканин тестикул ягнят,
отримана за загальноприйнятою методикою та власною модифікацією ряду
елементів.

Сировиною для отримання первиннотрипсинізованої КК ТЯ були тестикули
ягнят. В умовах господарства відбирали баранчиків віком 1 – 4 місяці й
кастрували їх закритим способом. Тестикули із загальною піхвовою
оболонкою поміщали в склянку з підтримуючим середовищем RРМІ – 1640,
охолодженим до 4 0 С, яке містило антибіотики – стрептоміцину сульфат 2
мг/см3 та бензил-пеніциліну 2000 ОД / см3. Матеріал транспортували в
лабораторію і відразу ж піддавали трипсинізації.

Трипсинізацію здійснювали при різних температурних режимах (40С,
200С та 370С). Використовували стандартний 0,25%-ний розчин трипсину.
Під час трипсинізації у флакон із шматочками тканини почергово вносили
трипсин та живильне середовище RPMI без сироватки крові. Така
модифікація забезпечувала стабільний позитивний результат під час
отримання клітинної культури з тканин тестикул ( наша модифікація ).

Після підрахунку кількості живих клітин одержували суспензію на
ростовому живильному середовищі (ГЛА / RPMI 50 / 50 з 10 % сироватки
крові вівці), додавали зазначене живильне середовище з таким
розрахунком, щоб концентрація клітин становила 200 тис./ см3, та
висівали в скляні або пластикові матраси, ролерні флакони, 96 – лункові
планшети фірми SARSTED (залежно від потреб). Інкубували в стаціонарних
та ролерних умовах (1-2об./хв) при температурі 370 С. Стан формування
моношару клітин визначали візуально та за допомогою інвертованого
мікроскопа Оpton – ID – 02.

Зараження клітинних культур здійснювали за загальноприйнятим
методом і різноманітними модифікаціями. У першому випадку живильне
середовище зливали, у кожний матрас з культурою вносили вірусвмісну
рідину, яку розподіляли по всьому моношару клітин. Адсорбцію
здійснювали протягом 30-45 хвилин при кімнатній температурі (18-250С),
після чого вносили живильне середовище (ГЛА або Ігла на основі ФГМ-С з
4 % сироватки вівці або ягнят, рН 7,5-7,6).

Заражені клітинні культури інкубували протягом 4 – 5 діб у
термостаті при температурі 370С. Титр вірусу визначали за допомогою
розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА.

У зв’язку з пошуком методу зараження клітинних культур, який
забезпечував би належну врожайність вірусного штаму та був достатньо
технологічним, паралельно з описаним методом, проводили зараження за
різними варіантами :

з попереднім відмиванням моношару та без відмивання;

з використанням процедури “адсорбція” вірусу та шляхом безпосереднього
внесення вірусу в ростове живильне середовище.

Досліджували також вплив інших елементів на врожайність вірусу:
інфікуючої дози, присутності трипсину у підтримуючому середовищі,
експозиції культивування.

Кров від свиней відбирали за методикою У. Ерфле з
співавторами (1987 р.).

Постановку гістохімічного варіанту імунопероксидазного методу
здійснювали в пластикових планшетах фірми SARSTED. Використовували
імунопероксидазний кон’югат власного приготування. Специфічну щодо
збудника КЧС сироватку отримували на свинях, пероксидазу одержували від
фірми SEGMA. Кон’югацію проводили за власною методикою. Результати
постановки ІФА визначали візуально.

Постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів здійснювали за
методикою, описаною Г. Фримелем (1987), у якості клітин-мішеней
використовували лейкоцити селезінки мишей.

Перещеплювальну клітинну культуру ТЯ отримували на основі
первиннотрипсинізованої клітинної культури ТЯ шляхом клонування та
тривалого пасажування in vitro.

Достовірність результатів досліджень визначали шляхом статистичного
опрацювання отриманих цифрових даних за програмою “Біом-3”.

Результати власних досліджень

Використовуючи загальновідомий принцип отримання
первинно-трипсинізованих клітинних культур та запровадивши ряд власних
модифікацій, нам вдалось розробити методику отримання
первинно-трипсинізованої клітинної культури з тканин тестикул баранчиків
і козлят. Клітини обох культур мали епітеліоподібний вигляд, формували
якісний моношар протягом 3-4–х діб. Останній, за оптимальних умов,
залишався без видимих деструктивних явищ протягом 10-14–ти діб.

Шляхом клонування та опромінення (0,5 мегарад) під час тривалого
пасажування клітинної культури ТЯ, була отримана постійна клітинна лінія
(перещеплювальна) ТЯ. За чутливістю та здатністю забезпечувати належну
репродукцію вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС вона не поступається
відповідній первиннотрипсинізованій клітинній культурі.

Орієнтуючись на відомі дослідження, що стосуються суті
гістохімічних варіантів детекції патогенів, нами була розроблена
методика виявлення вірусу КЧС у клітинних культурах та інших
біологічних (патологічних) матеріалах, яка грунтується на
гістохімічному варіанті ІФА. В процесі її розробки шляхом
гіперімунізації кіз були одержані антивидові (проти імуноглобулінів
свині) імуноглобуліни, отримані на їх основі імунопероксидазні
кон’югати, оптимізовані всі етапи постановки гістохімічного
варіанту ІФА та під час виявлення збудника КЧС ( чи його компонентів)
у клітинних культурах. В таблиці 1 представлені результати титрування
вірусу КЧС за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА та
методу імунофлуоресціюючих антитіл.

Таблиця 1 – Порівняльне титрування вірусу КЧС ( штам ЛК-М) у клітинних
культурах ТЯ і SК-6, визначені різними методами

Як свідчать вищенаведені дані, показники титру вірусу КЧС при
застосуванні гістохімічного варіанту ІФА суттєво перевищували показники
титру, визначені за допомогою ІФА (Р 0,05). Кількість
лейкоцитів периферійної крові у свиней дослідної групи вірогідно
знизилася на сьому добу експерименту й становила 8,9 ± 0,32 Г/л, що на
2,6 Г/л було нижчим за показник контролю на даний період дослідження та
2,4 Г/л – за відповідний показник на третю добу експерименту (Р 0,05).

Максимальний відносний вміст лімфоцитів у свиней дослідної групи
встановлений на 14-ту добу досліду і становив 51,2 ± 2,56 %, проте
найвища абсолютна їх кількість була на сьому добу після введення вакцини
і становила 5,02 ± 0,393 Г/л, що вірогідно, на 0,44 Г/л, перевищувало
відповідний показник контролю (Р 0,05) та вірогідно,
на 0,2 Г/л – відповідні показники на 14-й день з моменту введення
вакцини (Р 0,05).

Дослідження не виявило вірогідного впливу вакцини ЛК-М на фагоцитарну
активність нейтрофілів (Р > 0,05).

Серед змін біохімічних показників сироватки крові вакцинованих свиней
відзначено вірогідне зростання загального вмісту глобулінів на 14-ту
добу експерименту, причому цей показник вірогідно перевищував відповідні
дані до введення вакцини на 10,47 %, а дані тварин контрольної групи –
на 9,57 % (Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020