.

Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення (ав

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
142 4400
Скачать документ

АКАДЕМІЯ медичних НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

Ільєнко Ірина Миколаївна

УДК 576.32/.36:57.016:612.119:616.832:616-001.28

Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у
хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після
опромінення

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Базика Димитрій Анатолійович,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України,

завідувач відділу клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Мінченко Жанна Миколаївна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України,

завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології і
трансплантології;

доктор медичних наук, професор

Видиборець Станіслав Володимирович,

Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ
України,

професор кафедри гематології і трансфузіології.

Захист дисертації відбудеться 13.11.2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної
медицини АМН України, 03115, м. Київ, просп. Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини АМН України, 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий 12.10.2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук _______________________ Л. О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В результаті аварії на ЧАЕС безпрецедентні за
розміром групи населення зазнали багатофакторного впливу, у т.ч.
зовнішнього та внутрішнього опромінення. Визнаним на сьогоднішній день є
розвиток стохастичних ефектів опромінення – серед яких виникнення та
прогресування різних форм онкогематологічних захворювань [И.М. Богданов
и др., 2005; J. Edward et al., 2002]. Моніторинг системи кровотворення в
учасників ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській атомній
електростанції (УЛНА на ЧАЕС) показав, що серед порушень функціонування
кровотворної системи одне з провідних місць займають якісні та
кількісні зміни гемопоезу – лейкопенії, анемії, моноцитоз та
лімфоаденопатії, що є прогностично несприятливими щодо розвитку
злоякісних захворювань системи крові [А.Е. Романенко и др., 2005].
Особливу увагу привертає мієлодиспластичний синдром (МДС), що включає
групу захворювань, яка характеризується клональними порушеннями
кровотворення. На сьогоднішній день МДС віднесено до захворювань, що
можуть бути індуковані іонізуючою радіацією. Відомими є морфологічні
особливості гемопоетичних клітин (ГК) кісткового мозку (КМ) та
периферичної крові (ПК) при МДС у постраждалих внаслідок Чорнобильської
катастрофи [І.В. Белінська, 2002; М.А. Френкель и др., 2001]. Описані
характерні цитогенетичні та молекулярно біологічні зміни [Д.Ф. Глузман и
др., 2003; В. Павлова и др., 1995]. Однак, відносно невелика кількість
робіт присвячена вивченню імунологічного фенотипу клітин ПК та КМ при
МДС. Між тим, функціонування та загибель клітин чітко контролюються
мембранними рецепторами та їх лігандами, які активують як процеси
проліферації, так і апоптозу, порушення яких встановлено при дії
іонізуючого опромінення [Darroudi et al., 2005]. Тому перспективним
напрямком досліджень для розуміння природи МДС, як віддаленого ефекту
опромінення, є визначення як кількісних характеристик експресії
рецепторного апарату, так і наявності/відсутності тих чи інших
антигенів, що визначають стадію диференціювання та лінійну належність
[H.D. Cualing, 2000; T. Horsburgh et al., 2000]. Характерним для МДС є
невідповідність високої проліферативної активності клітин гемопоезу
цитопенічному синдрому, що дозволило сформулювати теорію „неефективного
гемопоезу”. Більшість дослідників схильні вважати, що основним
механізмом цього феномену у хворих на МДС є активація апоптозу [А.Ф.
Романова и др., 2006; A. Raza et al., 1997; S.D. Mundle et al., 1999].
Тому дослідження ролі, специфіки, зв’язків про- та антиапоптотичних
молекул у складному каскаді запрограмованої клітинної загибелі є
пріоритетним напрямком дослідження патогенезу МДС. З іншого боку,
актуальність вивчення апоптозу при даній патології обумовлена
особливостями експресії клітинних рецепторів та маркерів апоптозу у
хворих, які зазнали впливу дії іонізуючого випромінювання, що є одним з
канцерогенних чинників. Співвідношення проліферації та апоптозу є
важливим параметром реакції на активуючі фактори, оскільки визначає її
результативність з точки зору імунної відповіді або формування
імунологічної толерантності [О.А. Рукавицын и др., 2004]. Окреслені
питання, обумовили напрямок проведеного дослідження, яке спрямовано на
з’ясування особливостей клітинних реакцій, що лежать в основі патогенезу
МДС.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є
самостійним завершеним комплексним науковим дослідженням. Дисертаційну
роботу виконано у структурі науково-дослідних робіт (НДР) відділу
клінічної імунології Інституту клінічної радіології (ІКР) Наукового
центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України. Дисертант був
співвиконавцем наступних НДР:

1. 1998-2000 рр. НДР: „Вивчити клітинно-молекулярні механізми взаємодії
мікрооточення та імунної системи при дизгемопоетичних змінах
кровотворної системи у післяаварійний період” на замовлення АМН України
(№ держреєстрації 0198U004901).

2. 1999-2001 рр. НДР: „Вивчення закономірностей виникнення, механізмів
розвитку та особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у
постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи
лікувально-реабілітаційних заходів, первинної та вторинної профілактики
патологічних станів” на замовлення Міністерства України з питань
надзвичайних ситуацій у справах захисту населення від наслідків
Чорнобильської катастрофи, договір № 17/11-Н-99.03 (№ держреєстрації
0199U003595).

3. 2001-2003 рр. НДР: „Вивчити механізми трансформації
мієлодиспластичного синдрому в лейкемію в осіб, які постраждали
внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддалений період” на замовлення АМН України
(№ держреєстрації 0101U001450).

4. 2004-2006 рр. НДР: „Розробка нових програм терапії гострих лейкемій
та мієлодиспластичного синдрому у хворих, які постраждали внаслідок
аварії на ЧАЕС, з урахуванням молекулярно-генетичних аспектів цих
захворювань та множинної медикаментозної резистентності” на замовлення
АМН України (№ держреєстрації 0104U003631).

Мета дослідження. Визначити особливості клітинних реакцій:
диференціації, активації та апоптозу в елементах гемопоезу у хворих на
мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення, для
удосконалення діагностичних та прогностичних критеріїв
радіаційно-обумовлених імунологічних та гематологічних станів.

Завдання дослідження.

1. Встановити особливості імунологічного фенотипу елементів гемопоезу ПК
та КМ хворих на МДС у віддаленому періоді після дії іонізуючої радіації.

2. Дослідити особливості експресії рецепторного апарату на етапах
диференціювання лімфоцитів та можливу залежність їх від дози опромінення
при різних варіантах МДС.

3. Провести дослідження якісних та кількісних параметрів запрограмованої
клітинної загибелі в елементах ПК та КМ при різних варіантах МДС у
віддалений період після опромінення.

4. Провести порівняльний аналіз рівнів спонтанного та
верапаміл-індукованого апоптозу імунокомпетентних та гемопоетичних
клітин ПК та КМ у хворих на МДС в залежності від експресії
протеїнів-регуляторів апоптозу.

5. Вивчити особливості спонтанної та мітоген-індукованої експресії
активаційних антигенів лімфоцитів в групах УЛНА на ЧАЕС 1986 р., хворих
на МДС та опромінених осіб, які не мали гематологічної патології.

6. Встановити in vitro особливості спонтанної та мітоген-індукованої
проліферативної активності імунокомпетентних клітин ПК хворих на МДС за
розподілом по фазах клітинного циклу у віддаленому періоді після
опромінення.

Об’єкт дослідження. Периферична кров та кістковий мозок УЛНА на ЧАЕС
1986 р., опромінених в діапазоні доз від 0,04 до 0,92 Зв, хворих на МДС.

Предмет дослідження. Процеси апоптозу, активації та диференціювання в
імунній та кровотворній системах в УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС у
віддалений період після опромінення.

Методи дослідження. Цитофлуориметричний аналіз – визначення
субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин (ІКК), експресії
поверхневого фенотипу ГК та експресії активаційних маркерів у прямому
імунофлуоресцентному тесті. Аналіз запрограмованої клітинної загибелі
та розподілу лімфоцитів за фазами клітинного циклу. Культуральні –
формування короткочасових культур клітин для оцінки активаційної та
проліферативної відповіді лімфоцитів на стимуляцію мітогеном –
конканаваліном А (Кон А); вплив верапамілу, як індуктора апоптозу на ГК
та ІКК ПК та КМ in vitro. Статистичні – дисперсійний аналіз та
регресійно-кореляційний аналіз за параметричними критеріями [А. Бююль,
2002; С. Гланц,1999].

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначено особливості
процесів запрограмованої клітинної загибелі елементів гемопоезу на
різних стадіях їх диференціювання у хворих із радіаційно-асоційованим
МДС: на підставі дослідження молекулярних перебудов цитоплазматичної
мембрани, вперше встановлено залежність рівня апоптозу у хворих на МДС
від дозових навантажень у діапазоні від 0,04 до 0,92 Зв; встановлено
порушення „апоптозної програми” нейтрофілів у хворих на МДС, що
проявляється у зниженні чутливості до дії індуктору апоптозу та
супроводжується відповідними змінами експресії поверхневих антигенів;
вперше серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р. встановлена позитивна кореляційна
залежність між рівнем CD95 та дозою опромінення; зафіксований стан
підвищеної активності у структурно-функціональній системі феномену
запрограмованої клітинної загибелі у віддалений період після
опромінення.

Вперше отримано нові дані про особливості експресії лінійних,
диференційних та активаційних антигенів ІКК та ГК ПК та КМ хворих на МДС
у віддалений період після опромінення. Встановлено особливості
імунофенотипу популяції бластних клітин, яка характеризується експресією
CD34+, CD71+, CD117+, CD34+117+.

Вперше визначена роль імунологічних порушень у формуванні неопластичних
змін гемопоезу. Визначена доцільність використання у
клініко-діагностичній практиці оцінки імунологічної реактивності ІКК у
віддалений період після опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Теоретично обґрунтована
необхідність внесення змін до стратегії діагностики МДС, у т.ч. серед
постраждалого контингенту. Методично визначена інформативність
імунофенотипових параметрів ГК для діагностики та прогнозування перебігу
МДС. Запропоновано використання показників експресії CD71 та
коекспресії CD117, CD34 антигенів ранніх ГК-попередників в якості
діагностичного маркеру МДС. Розроблено новий спосіб діагностики та
прогнозування перебігу МДС: заявка на пат. № u 200706774, який базується
на використанні індексу апоптозу в якості діагностичного та
прогностичного маркеру.

Розроблені в дисертаційній роботі підходи щодо діагностики МДС з
урахуванням радіаційної компоненти, впроваджені у практику роботи
відділу клінічної імунології та відділення радіаційної гематології
дорослих ІКР НЦРМ АМН України.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз наукових
літературних даних та визначення ступеня вирішеності наукового завдання
в межах теми, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його
мета і задачі, сформовано групи обстеження. Особисто розроблено алгоритм
дослідження, обґрунтовано і відібрано методи дослідження, розроблено
протокол для систематизації та фіксації результатів, структуру бази
даних. Самостійно визначений імунофенотип ГК та ІКК у групах обстеження,
встановлено особливості спонтанної та мітоген-залежної активації
лімфоцитів. Автором проведений диференційний аналіз рівня спонтанного та
індукованого апоптозу і надана оцінка розподілу лімфоцитів за фазами
клітинного циклу. Особисто проведено експериментальні дослідження in
vitro із формуванням короткочасових культур клітин. Заповнена база даних
з подальшою статистичною обробкою та аналізом отриманих результатів.
Особисто виконано написання всіх розділів дисертаційної роботи,
створення ілюстративного матеріалу та формування висновків і практичних
рекомендацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені
та обговорені на національних та міжнародних науково-практичних
конференціях та конгресах: IV з’їзді гематологів та трансфузіологів
України (Київ, 2001); Міжнародній конференції “П’ятнадцять років
Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання” (Київ, 2001); 3-ей
Международной конференции “Медицинские последствия Чернобыльской
катастрофы: итоги 15-летних исследований” (Киев, 2001);
Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Российскому НИИ
гематологии и трансфузиологии “Актуальные вопросы гематологии и
трансфузиологии” (Санкт-Петербург, 2002); The 8th Annual Meeting of EHA
Assotiation (Lion, France, 2003); Науково-практичній конференції
“Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”
(Київ, 2005); 5th Parnas Conference (2005); 3th International Symposium:
Chronic Radiation Exposure: Biological and Heаlth Effects (Chelyabinsk,
2005); X Congress European Hematology Association (Stockholm, 2005);
Міжнародній конференції “Двадцять років Чорнобильської катастрофи.
Погляд у майбутнє” (Київ, 2006); Ювілейній науково-практичній
конференції до 20-річчя гематологічного відділення ІКР НЦРМ АМН України
“Радіаційна гематологія: етапи становлення, основні досягнення та
перспективи розвитку” (Київ, 2007); Conference “Death, Danger and
Immunity” Institut Pasteur (Paris, France, 2007); The Ninth
International Symposium on Myelodysplastic Syndromes (Florence, Italy,
2007); The 12th Congress of the European Hematology Association (Vienna,
Austria, 2007).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 20 наукових праць;
із них: 5 статей у фахових виданнях, 1 заявка на патент, 14 тез
доповідей (у т.ч. 7 – за кордоном).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6
розділів основної частини (аналітичний огляд літератури, матеріал та
методи, три розділи результатів власних досліджень, аналіз та
узагальнення результатів дослідження) висновків, практичних рекомендацій
та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 31 таблицею і 34
рисунками. Повний обсяг дисертації – 176 сторінок, із них 149 сторінок
складає основна частина. Список літератури викладений на 27 сторінках та
містить 258 джерел (83 кирилицею, 175 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В роботі проаналізовано та узагальнено
результати досліджень у 130 осіб. Основну групу обстеження склали
пацієнти, які перебували на лікуванні у клінічних відділеннях НЦРМ АМН
України з діагнозом МДС. Клінічний діагноз та підтип МДС встановлено у
відділенні радіаційної гематології дорослих ІКР НЦРМ АМН України за
критеріями ФАБ-класифікації [H. Muller-Berndoff et al., 2006; J.M.
Bennet et al., 1982]. Загальна кількість осіб, які склали дану групу
становила 55 осіб. Відповідно до модифікованої ФАБ-класифікації, яка в
останні роки була доповнена некласифікованим варіантом МДС, обстежені
хворі були розподілені за встановленим діагнозом наступним чином:
рефрактерна анемія (РА); рефрактерна анемія із надлишком бластів (РАНБ);
рефрактерна анемія із надлишком бластів у стадії трансформації (РАНБ-Т);
некласифікований варіант МДС (МДС-Н). Для проведення аналізу підтипи МДС
були об’єднані за ступенем злоякісності та відсотком бластних клітин у
дві підгрупи:

I підгрупа – РА, МДС-Н. Вік обстежених складав 54,6±17,20 (M±SD);

II підгрупа – РАНБ, РАНБ-Т. Вік обстежених складав 56,4±13,08 (M±SD);

Серед осіб основної групи дослідження виділена група хворих на МДС, які
були УЛНА на ЧАЕС 1986 р. та зазнали впливу низьких доз іонізуючого
випромінення (від 0,04 до 0,92 Зв). Ця підгрупа склала 17 осіб. Частина
хворих обстежувалась повторно на різних етапах мієлопроліферативного
процесу. Групу порівняння склали 55 УЛНА на ЧАЕС, які перебували в 30-ти
кілометровій зоні ЧАЕС у 1986 р., опромінені в діапазоні доз від 0,01 до
0,95 Зв. Вік обстежених складав 50,0±8,86 (M±SD). В анамнезі не
встановлено інших шкідливих факторів та захворювань, які б мали вплив на
кровотворну або імунну системи. Контрольну групу склали 20 практично
здорових осіб, гематологічні та імунологічні показники яких коливались в
межах вікових норм. Середній вік складав 52,5±5,41 (M±SD). Всі особи
контрольної групи не зазнавали впливу іонізуючого випромінювання, яке б
перевищувало рівень природного радіаційного фону.

Обстеженим особам з встановленим діагнозом МДС проведено
імунофенотипування клітин ПК та КМ методом лазерної проточної
цитофлуориметрії. Субпопуляційний склад лейкоцитів та експресію
поверхневих антигенів визначали у прямому імунофлуоресцентному тесті за
допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu фірми Becton
Dickinson (BD) методом дво- та трьохкольорового аналізу. Антитіла, були
мічені флуорусцеїнізоцианатом (FITC) та фікоеритрином (PE). За
специфічністю використані МКАТ розподілялись наступним чином: CD45/CD14
– диференціювання лімфоцитів, моноцитів та гранулоцитів; CD34, CD117,
CD71, CD10 – антигени клітин-попередників; CD33, CD13 – лінійні
мієлоїдні антигени, які експресуються на клітинах мієлоїдного походження
різного ступеня дозрівання; CD3/CD22, CD5/CD20, CD7, CD19 – визначення
загальної кількості Т- та В-клітин; CD4/CD8 – оцінка імунорегуляторних
субпопуляцій Т–лімфоцитів; HLA-DR/CD56 – оцінка цитотоксичних
Т-лімфоцитів та природних кілерів. Контролем були мікросфери “CaliBRITE”
(BD), помічені відповідно FITC чи РЕ, та МКАТ до імуноглобулінів миші
IgG1 – FITC / IgG2a – PE.

Зразки готували за рекомендаціями по використанню набору Acute Leukemia
Phenotyping Kit (BD, США). За стандартним протоколом аналізу даних
проточної цитометрії пряме (FSC) та бокове (SSC) світлорозсіювання було
використано для виділення трьохчасткового диференціювання популяцій
клітин. Визначення інтенсивності флуоресценції (ІФ) у зеленому спектрі
(FITC) – перший канал флуоресценції (FL1) та у червоному спектрі (PE) –
другий канал флуоресценції (FL2) проводили у логарифмічному режимі.
Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флуоресценції складали 0,7%
для FL1 та 18% для FL2. Аналіз проводили на лазерному проточному
цитофлуориметрі FACScan (BD, США). Для збудження використовували
аргоновий лазер потужністю 25мВт (довжина хвилі 488 нм). Первинний
аналіз проводили з використанням програми збору та обробки даних Lysis
II.

Проліферативний потенціал ІКК досліджували в короткочасовій 24-годинній
культурі. Використовували мітоген конканавалін А (Кон A) у концентрації
5 мкг/мл. Суспензію клітин готували у концентрації 5Ч106 клітин/мл в
повному живильному середовищі на основі RPMI-1640 („SIGMA”, США),
L-глутаміну – 300 мкл/мл, гентаміцину – 60 мкг/мл („PHARMACHIM”,
Болгарія), HEPES („SIGMA”, США). В об’ємі 200 мкл 96-лункового
плоскодонного планшету суспензію клітин інкубували з Кон A при
температурі 37°С та зволоженій атмосфері з 5% СО2. Після інкубації
суспензію клітин переносили до пластикових пробірок для цитометричного
аналізу та проводили лізис еритроцитів з використанням Lysing Solution
(BD, США).

Активаційну відповідь оцінювали за кількістю клітин, які експресують на
своїй мембрані маркери активації (МА), а саме: аnti-CD25, аnti-CD71,
аnti-HLA-DR, anti-CD38. Оцінка здатності лімфоцитів відповідати на
мітоген проводилась за коефіцієнтом активації, який обчислювали окремо
для кожного МА, як відношення відсотку клітин, які експресують МА після
інкубації з мітогеном, до відсотку клітин, що експресують МА спонтанно.

Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів використовували метод
розподілення клітин за фазами клітинного циклу. Після культивування
проводили пермабілізацію клітинних мембран лімфоцитів за допомогою
Permeabilizing Solution (BD, США). Як наслідок – інтеркалюючий барвник
пропідію йодид (PI) вільно проникає у клітини і зв’язується з ДНК.
Суспензію клітин з PI у концентрації 5 мкг/мл інкубували 20 хв. у
темряві. Аналіз проводили за допомогою проточної цитофлуориметрії шляхом
оцінки червоного спектру флуоресценції (FL2) PI для 10000 клітин.
Визначали процент гіподиплоїдних клітин (апоптотичні клітини),
диплоїдних клітин (фази G0/G1) та відсоток тетраплоїдних клітин у S/G2
фазах клітинного циклу.

Визначення спонтанного та верапаміл-індукованого апоптозу проводили за
допомогою системи для визначення деформацій (перебудов) клітинних
мембран, що супроводжують запрограмовану клітинну загибель – Annexin
V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD, США). Забарвлення проводили
згідно з протоколом рекомендованого фірмою-виробником. Апоптоз також
оцінювали шляхом підрахунку індексу апоптозу, який обчислювали як
співвідношення анексин-V+PI- клітин до загальної кількості клітин в
регіоні [Qi-Zhen Cao et al., 2005].

Для активації апоптотичних процесів використовували блокатор кальцієвих
каналів верапаміл у концентрації 100 мМоль/л. Клітини ПК інкубували в
загальному об’ємі 200 мкл у 96-лунковому планшеті протягом 5 годин при
температурі 370С та зволоженій атмосфері з 5 % СО2. До комплексу
досліджень спонтанного апоптозу входило визначення відсотку маркеру
запрограмованої клітинної загибелі – CD95 (Fas-рецептор) (BD, США).
Паралельно проводили внутрішньоклітинне визначення антиапоптогенних
молекул Bcl-2 (BD, США). Підготовку зразків проводили за стандартною
методикою для прямого імунофлуоресцентного тесту.

Первинні дані були отримані з використанням програми WinMDI 2.8.
Статистичний аналіз та презентацію отриманих результатів проводили у
форматі пакету для статистичної обробки даних SPSS 15.0.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень. Проведено аналіз
популяційного складу лейкоцитів ПК хворих на МДС, з використанням МКАТ
до диференційних антигенів CD14 та CD45. Рівень експресії CD45 антигену
знижений на клітинах гранулоцитарного ряду при всіх підтипах МДС, що в
зв’язку з участю CD45 у процесах активації клітин та утворення клітин
пам’яті, може розцінюватись, як прояв імунологічної недостатності.
Незміненим залишається цей показник серед клітин лімфоїдного регіону. В
клітинах моноцитарного ряду встановлено підвищення відсоткового вмісту
CD45–14+ клітин, особливо у підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т, порівняно з
контролем. Порівняльний аналіз популяційного складу ПК та КМ хворих на
МДС показав при всіх варіантах значне зниження експресії CD45 антигену
на клітинах лімфоїдного ряду КМ. Гранулоцити КМ у підгрупі хворих на РА,
МДС-Н були представлені домінуючою популяцією з високою експресією CD45,
що можна розцінювати як прояв процесів дисгранулоцитопоезу. Характерною
особливістю КМ у підгрупі, яка об’єднує хворих на РАНБ, РАНБ-Т, є
підвищення відсоткового вмісту CD45+14– бластних клітин порівняно із ПК,
що корелює із критеріями FAB-класифікації МДС [J.M. Bennet et al.,
1982]. Проведений аналіз популяційного складу ПК та КМ за показниками
бокового світлорозсіяння – SSC. Зафіксована наявність популяцій
гранулоцитів із зниженою гранулярністю за рахунок мієлобластів у ПК та
КМ хворих на МДС. Гіпогранулярність в регіоні гранулоцитів КМ має більш
виражений характер порівняно з ПК.

Застосування широкої панелі МКАТ дозволило провести дослідження
експресії лінійних та диференційних антигенів у групах обстеження. При
аналізі даних імунофлуоресценції визначали відсоток позитивних клітин та
інтенсивність експресії досліджуваних антигенів. Проведений аналіз
показав наявність порушень експресії лінійних, диференційних та
активаційних антигенів клітин кровотворної системи у хворих на МДС.
Вміст клітин з експресією диференційних антигенів Т-лімфоцитів, а саме
CD5+, CD3+, CD7+, був стабільним. Поряд з цим показники ІФ Т-клітинних
диференційних антигенів лімфоцитів були достовірно знижені. Зміни
рецепторного апарату Т-клітин у хворих на МДС свідчать про функціональну
недостатність цієї ланки лімфоїдного ряду і можуть бути відображенням
переходу до мієлодиспластичного стану. Субпопуляційний склад ІКК
характеризувався достатнім рівнем зрілих CD4+ та CD8+ лімфоцитів. Однак,
спостерігається тенденція до зростання популяції CD8+ клітин у поєднанні
із зниженням вмісту CD4+ клітин. Відмічено зростання CD56+ клітин у
підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т та CD56+DR+ при всіх варіантах МДС.
Активація гомофільної молекули міжклітинної адгезії CD56+ не виключає
реципрокну депресивну дію на елементи гемопоезу шляхом зміни продукції
розчинних ростових факторів. Зазначений дефект може відображати
спільність механізмів дисгемопоезу, який спостерігається при МДС, а
також процесів диференціювання ІКК. Поряд з цим зафіксоване зниження ІФ
CD56 антигену, що пов’язано з відповідними порушеннями функціональної
активності натуральних кілерів (CD56+) при всіх варіантах МДС та має
особливе значення у формуванні непластичних змін гемопоезу. Однак, не
можна виключити, що порушення в імунній системі – лише наслідок хвороби.
З метою встановлення внеску радіаційного чинника у формування
патологічних станів імунної системи у хворих на МДС, проведено аналіз
субпопуляційного складу ІКК у трьох групах обстеження: групі
нозологічного контролю (неопромінені хворі на МДС); хворих на МДС-УЛНА
на ЧАЕС 1986 р.; УЛНА на ЧАЕС 1986 р. без гематологічних патологій. У
групі нозологічного контролю спостерігали зростання кількості CD4–8+
клітин на фоні зниження CD4+8– клітин. Протилежний характер змін
зафіксовано серед УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС з дозовим навантаженням.
Виявлено негативну кореляцію між дозою опромінення та відносною
кількістю Т-супресорів серед цієї категорії осіб (r = –0,634; рt??°?i’ ” ae ae e '?” ae ae e e i 6 8 : Z – - \ ae.Ae1ooo»?????????????? ?? ?? ?? ?? ?? ?? WNNBBB ітин у поєднанні із зниженням вираженості апоптозу у гранулоцитах хворих на МДС, що може бути пов’язаним із негативним прогнозом, первинною резистентністю до хіміотерапії і відповідно скороченням тривалості життя. Проведена порівняльна характеристика рівнів експресії CD95 та Bcl-2 у ПК та КМ хворих на МДС. Картина, яка спостерігалася у КМ в обстежених підгрупах, мала протилежний характер, ніж у ПК. Різноспрямованість процесів у ПК та КМ знайшла відображення як у зниженні відсоткового вмісту Bcl-2, так і зростанні експресії CD95-рецептора. У підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т підвищення рівня експресії CD95 на ГК КМ корелює з рівнем експресії CD34-рецептора. Враховуючи важливу роль Fas-рецептора у реалізації запрограмованої клітинної загибелі, такий зв’язок може стати відображенням аномальної програми гемопоезу при мієлодисплазіях. Наступний етап у напрямку вивчення особливої ролі апоптозу у патогенезі МДС пов’язаний із специфічними структурно-молекулярними перебудовами, які характерні для клітини у стані запрограмованої клітинної загибелі [А.А. Болдырев и др., 2005]. Проведене нами дослідження було побудоване на визначенні сформованих молекул фосфатидилсерину шляхом взаємодії з анексином-V (рис. 3). Кількість анексин-V+PI– клітин гранулоцитарного ряду ПК підвищена за рахунок клітин на пізніх стадіях апоптозу. Відсоток анексин-V+PI– та анексин-V+PI+ серед клітин лімфоїдного ряду КМ був вищий ніж у ПК при всіх підтипах МДС. Рівень апоптотичних клітин у гранулоцитарній популяції КМ також зростав, однак у підгрупі, яка об’єднує хворих на РАНБ, РАНБ-Т цей показник був знижений, порівняно з підгрупою хворих на РА, МДС-Н. Знижений рівень апоптозу може пояснити більш високий ступінь трансформації в ГЛ. Найвищий ступінь апоптозу у нашому дослідженні був зафіксований у бластних клітинах КМ, що підтверджується високими середньогруповими значеннями індексу апоптозу, який був підрахований згідно з рекомендаціями Qi-Zhen Cao et al., 2005. Низький апоптотичний індекс встановлений для підгрупи хворих на РАНБ, РАНБ-Т імовірно пов’язаний з негативним прогнозом даних варіантів МДС. Б. Рис. 3. Дискримінаційний аналіз стадій запрограмованої клітинної загибелі в нормі (А) та МДС (Б). 1-й квадрат – клітини мічені тільки PI (початкова стадія некрозу); 2-й квадрат – клітини, які мічені як PI, так і анексином-V-FITC (пізні стадії апоптозу); 3-й квадрат – клітини, які не мічені ні PI, ні анексином-V-FITC (живі клітини); 4–й квадрат – клітини мічені тільки анексином-V-FITC (ранні стадії апоптозу). Відомий зв’язок між ростом популяції пухлинних клітин та своєчасним запуском запрограмованої клітинної загибелі [В.И. Петухов, 2000; A. Parcharidou et al., 1999]. Тим важливішим є вибір способів індукції апоптозу. У нашому дослідженні верапаміл був використаний як індуктор апоптозу у клітинах ПК та КМ in vitro в групах дослідження та проведена оцінка особливостей відповіді ІКК при МДС. Серед отриманих результатів слід звернути увагу на ті, що продемонстрували нечутливість до дії індукторів апоптозу гранулоцитарної популяції ПК, що може свідчити про запрограмованість на інший шлях розвитку, який не передбачає елімінації пухлинного клону клітин шляхом апоптозу, і як наслідок може бути пов’язаний з високим ризиком трансформації у ГЛ. Клітини КМ мієлоїдного ряду у нормі не запрограмовані на загибель шляхом апоптозу [Н.А. Маянский, 2001], однак з отриманих нами результатів саме цей паросток кровотворення мав максимальну відповідь на індуктор апоптозу, що свідчить про порушення рецепторного апарату та диференціювання серед ГК КМ. Серед питань, які були розглянуті, особливий інтерес представляють реакції запрограмованої клітинної загибелі серед хворих на МДС, у віддалений період після опромінення. З часом збільшується доля патологічних процесів, що базуються на підсиленні апоптозу, яке викликане дією зовнішніх апоптогенних факторів. На першому місці серед них знаходиться іонізуюча радіація. Є свідчення про підвищення при дії іонізуючої радіації в низьких дозах ключових регуляторів апоптозу [D.E. Fisher et al., 1994; M.E. Peter et al., 1998], що знайшло відображення у нашому дослідженні. У групі УЛНА на ЧАЕС спостерігається підвищена готовність лімфоцитів до Fas-опосередкованого апоптозу. Показники відсоткового рівня Fas-позитивних клітин у хворих на МДС з радіаційним навантаженням були найвищими порівняно з контрольною групою та групою УЛНА на ЧАЕС. В умовах виявленої низької експресії антиапоптотичних систем, представником яких є Bcl-2, можуть спрацьовувати сигнали до розвитку апоптозу особливо при радіаційному ураженні лімфоцитів. Апоптоз в даному випадку є захисним механізмом у процесі формування канцерогенних ефектів. Підтвердженням такого припущення є позитивна кореляційна залежність, яка встановлена між рівнем CD95+ клітин та дозою опромінення в групі УЛНА на ЧАЕС (r = 0,63; р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020