.

Атопічний дерматит: характеристика змін системного та локального імунітету (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
148 4969
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

КУРЧЕНКО АНДРІЙ ІГОРОВИЧ

УДК 615.5-002-056.3-07:57.083.3:615.3:612.017.1

Атопічний дерматит: характеристика змін системного та локального
імунітету

14.03.08 – імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

КИЇВ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Національному медичному університеті імені
О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Драннік Георгій Миколайович,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України,
завідувач кафедри клінічної імунології та алергології з курсом дитячої
клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бережна Нінель Михайлівна, Інститут
експериментальної патології, онкології і радіобіології імені.
Р.Є.Кавецького НАН України, керівник лабораторії імунології та
алергології;

доктор медичних наук, професор Прилуцький Олександр Сергійович,
Донецький державний медичний університет імені М.Горького МОЗ України,
завідувач кафедри клінічної імунології та алергології;

доктор медичних наук, професор Бєлоглазов Володимир Олексійович,
Кримський державний медичний університет імені С.І.Георгієвського МОЗ
України, завідувач кафедри внутрішньої медицини №2.

Захист відбудеться “6” березня 2008 р. о 1330 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 у Національному медичному
університеті імені О.О.Богомольця МОЗ України за адресою: 01023, м.
Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул.
Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “25 ” грудня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор __________________ С.Г.Свирид

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Атопічний дерматит (АД) – хронічне рецидивуюче
запальне захворювання шкіри, що характеризується папульозними
висипаннями з типовою локалізацією морфологічних елементів,
ліхеніфікацією, екскоріаціями, вираженою сухістю шкіри та частими
бактеріальними ускладненнями. АД є найпоширенішим системним алергійним
захворюванням, що має стійку тенденцію до прогресуючого плину та
зустрічається із частотою 10-20% у населення економічно розвинених країн
[Ревякина В.А., 2000; Novak N.,2003]. Серед алергійних захворювань
частота АД становить від 30 до 60% [Bieber T., 2004; Leung D.Y.M., 2004;
Степаненко В.І., 2005]. За даними публікацій за останні три десятиліття
в усьому світі відзначений істотний ріст (в 10 і більше раз)
захворюваності АД, у тому числі й в Україні [ Коляденко В.Г., 2002;
Ласиця О.І., 2003; Драннік Г.М., 2006]

У світі усе ще формуються концепції розвитку АД та намічені тенденції
застосування спрямованої, патогенетично обґрунтованої терапії цього
захворювання. Становить інтерес визначення характеру імунологічних
порушень, що відбуваються на системному та локальному рівні у хворих на
IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД [Werfel T., 1999; Кунгуров Н.В.,
2000; Курамшина Д.В., 2003; Novak N., 2003]

На сьогоднішній день у клініці відома та виділяється підгрупа хворих з
типовими шкірними проявами АД, для яких не характерні прояви
гіперчутливості до аеро- і харчових алергенів. В анамнезі таких хворих
немає вказівок на прояви інших атопічних захворювань, таких як алергійна
астма та ринокон’юктивіт. У таких хворих спостерігаються нормальні рівні
сироваткових IgE-антитіл. Такий тип АД зустрічається рідше (від 10 до
40% дорослого контингенту хворих на АД) і виділяється як IgE-незалежна
форма АД, на противагу IgE-залежній формі, для якого характерний
підвищений рівень IgE у крові [Akdis C.A., 2006].

Безсумнівно, розвиток IgE-залежної форми АД, з характерним підвищенням у
крові рівня IgE, пов’язане з активацією імунітету на системному рівні.
Відомо, що в запальних інфільтратах шкіри хворих IgE-залежної форми АД
не спостерігається В-лімфоцитів і плазматичних клітин, які продукують
IgE. Можна думати, що в умовах IgE-залежної форми АД локальне запалення
шкіри ініціює розвиток IgE-залежної відповіді на системному рівні, тоді
як при IgE-незалежній формі АД імунна відповідь формується переважно на
локальному рівні, без залучення в процес клітин, що синтезують IgE
[Schmid-Grendelmeier P., 2001].

У зв’язку із цим викликає інтерес зіставлення порушень в усіх ланках
формування системної та локальної імунної відповіді як при IgE-залежній
так і IgE-незалежній формі АД. Можна припустити, що в цих зіставленнях
з’явиться можливість розкрити особливості, якими буде визначатися
розвиток різних форм АД, а також виявити нові критерії діагностики цих
захворювань.

У рамках розмежування шляхів активації імунної відповіді на системну і
локальну, стає більш привабливим застосування цілеспрямованої терапії
препаратами, що чинять вибірковий вплив, як місцево, так і на системному
рівні.

Розуміння суті імунологічних порушень при різних клінічних формах АД,
дозволить також визначити підходи до профілактики та лікування не тільки
АД, але й інших атопічних захворювань, таких як бронхіальна астма та
алергійний ринокон’юнктивіт. При цьому доступність шкіри для досліджень
уможливлює розкриття механізмів хронічних алергійних хвороб інших,
малодоступних для дослідження локалізацій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені
наукові дослідження є частиною комплексних науково-дослідних робіт які
були виконанні на кафедрі клінічної імунології та алергології
Національного медичного університету імені О.О.Богомольця в рамках
наукових тем за планами МОЗ України: “Розробити нові методи діагностики
та лікування імунозалежної патології на основі вивчення механізмів їх
розвитку з врахуванням факторів міжклітинної кооперації” – № державної
реєстрації 0199U002962 (2002-2004 рр.); “Розробка та впровадження нових
методів імунодіагностики та імунотерапії атопічних захворювань” – №
державної реєстрації 0105U003574 (2004-2006 рр.). У ході виконання
планових наукових робіт автор виконував обов’язки відповідального
виконавця, провів літературний та патентний пошук, підбір та клінічне
обстеження хворих, вибір тактики їх лікування та розробив диференційний
підхід щодо імунодіагностики хворих на різні клінічні форми АД.

Мета дослідження: Визначити системні та локальні особливості
імунологічних механізмів розвитку IgE-залежної й IgE-незалежної форм АД,
оптимізувати критерії їхньої диференціальної діагностики та намітити
можливі шляхи медикаментозної корекції.

Завдання дослідження:

1. Дослідити імунофенотипічні властивості мононуклеарних клітин та їх
співвідношення у периферичній крові хворих з різними формами АД у
гострому та хронічному періоді захворювання.

2.З’ясувати функціональні особливості клітин CD4+Т-хелперної
субпопуляції лімфоцитів периферичної крові хворих на IgE-залежну й
IgE-незалежну форму АД на підставі визначення експресії CD45RO, CD45RА,
HLA-DR, CD25 та CLA антигенів.

3. Дослідити імунофенотипічні властивості CD14+ клітин
моноцитарно-макрофагального ряду периферичної крові, визначаючи
експресію високо- та низькоафінних рецепторів для IgE (Fc(RI, Fc(RII) у
хворих на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД.

4. Вивчити імуногістохімічі особливості клітин що формують склад
запальних інфільтратів ураженої шкіри у хворих IgE-залежною та
IgE-незалежною формою АД.

5. Вивчити кількісні зміни й характер розподілу в епідермісі запаленої
шкіри клітин, експресуючих молекули CD1a та HLA-DR, ко-стимуляторні
молекули (CD80, CD86), молекули адгезії ICAM-1 та рецептори до
гамма-інтерферону (ІFN-(R) у хворих з різними формами АД.

6. З’ясувати особливості цитокінового профілю периферичної крові хворих
на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД в гострому та хронічному
періоді захворювання на підставі визначення фонового рівня концентрації
IL-2, IL-5, IL-10, IL-12, IL-16, IL-18, а також ІFN-( та TNF-(.

7. Дослідити ступінь функціональної активності мононуклеарних клітин
циркулюючої крові за рівнем спонтанної та індукованої продукції in vitro
цитокінів ( IL-1, TNF-(, IL-12, IL-2, IFN-(, IL-4, IL-5, IL-10 і TGF-()
у хворих IgE-залежною й IgE-незалежною формою АД в гострому та
хронічному періоді захворювання.

8. Провести імунофенотипічний аналіз культивованих in vitro лімфоцитів
ураженої шкіри хворих IgE-залежною та IgE-незалежною формою АД.

9. Визначити in vitro рівень проліферативної активності лімфоцитів,
виділених із запаленої шкіри хворих АД, при стимуляції стафілококовим
токсином токсичного шоку – 1 (TSST-1) та ентеро-токсином В (SEB).

10. Вивчити можливість асоціації HLA фенотипу індивіда з розвитком
IgE-залежної та IgE-незалежної форм АД.

11. Дослідити імуномодулюючий ефект препарату Ербісол, визначаючи in
vitro характер його впливу на продукцію цитокінів: IFN-(, IL-4 і TGF-(
мононуклеарними клітинами крові хворих IgE-залежною формою АД.

12. Вивчити протизапальний ефект антигістамінних препаратів, визначаючи
зміни спонтанної та індукованої продукції цитокінів мононуклеарними
клітинами крові in vitro і експресію кератиноцитами молекул адгезії
ICAM-1 in vivo у хворих IgE-залежною формою АД.

Об’ект дослідження: імунні механізми, що формують розвиток запального
процесу в шкірі хворих атопічним дерматитом.

Предмет дослідження: характеристика локальних і системних імунних
реакцій при IgE-залежній і IgE-незалежній формі АД.

Методи дослідження: клінічні, лабораторні, імунологічні,
імуногістохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Основні положення, які
характеризують новизну результатів досліджень, що виносяться на захист,
зводяться до наступного: Доведено, що формування IgE-залежної форми АД
пов’язано зі збільшенням кількості клітин периферичної крові,
експресуючих маркери CD25 і HLA-DR, збільшенням у рамках субпопуляції
CD4+ Т-лімфоцитів чисельності клітин з експресією CD45RA, CD45RO, CLA
антигенів, а також збільшенням чисельності CD14+CD16+ і CD14+FcеRI+
моноцитів. Для IgE-незалежної форми АД характерних розходжень у
співвідношеннях клітин імунної системи периферичної крові не виявлено.

Показано, що IgE-залежна форма АД характеризується збільшенням кількості
CD1a+дендритних клітин епідермісу, експресуючих ко-стимуляторні молекули
CD80 та CD86, збільшенням кількості кератиноцитів, що експресують
рецептори до IFN-(, молекули адгезії ICAM-1 та HLA-DR антигени, а також
збільшенням кількості клітин дермального інфільтрату що експресують CD25
та HLA-DR антигени. При аналогічному зіставленні імуноморфологічних
властивостей епідермального та дермального компонентів ураженої шкіри
хворих різними формами АД у хворих на IgE-незалежну форму АД
особливостей не виявлено.

Встановлено розходження в цитокіновому профілі периферичної крові хворих
IgE-залежною та IgE-незалежною формами АД, як у гострому, так і в
хронічному періоді захворювання. IgE-залежна форма АД, на відміну від
IgE-незалежної форми в гострому періоді захворювання супроводжується
збільшенням у крові рівня концентрації цитокінів Th2 профілю та
зниженням рівня концентрації цитокінів Th1 профілю. Для хронічного
періоду IgE-залежної форми АД характерне підвищення в крові концентрації
IL-2, IL-5, IL-12, IL-16, IL-18, а також підвищення показників рівня
концентрації IFN-( та TNF-(.

Отримані нові дані про функціональні властивості мононуклеарних клітин
крові хворих різними формами АД, що виявилися в спонтанній та
індукованій продукції цитокінів в умовах in vitro. Для IgE-залежної
форми АД був характерний високий рівень індукованої продукції клітинами
IL-5, IL-12, TNF-( і IFN-( при незначному підвищенні рівня продукції
IL-1, IL-2, IL-10 і зменшенні продукції TGF-(. Для мононуклеарних клітин
крові хворих IgE-незалежною формою АД був характерний високий рівень
спонтанної продукції TGF-( і IFN-(, при незначному підвищенні IL-5,
IL-1, IL-12, IL-4. Для цієї форми АД було також характерне підвищення
індукованої продукції IL-12, TGF-(, TNF-(, IL-4, при підвищенні
продукції IL-1, IL-2, IL-5, IL-10 і зниженні продукції IFN-(.

Вперше показано, що IgE-залежна форма АД характеризується асоціацією з
HLA-А24, В7, В22, DR2 фенотипами, що не характерно для IgE-незалежної
форми захворювання.

При випробуванні виявлені нові властивості препарату Ербісол, які
проявляються в здатності стимулювати in vitro продукцію цитокінів TGF-(
і IFN-( лімфоцитами, виділеними із крові хворих IgE-залежною формою АД.

Вперше виявлено властивості антигістамінного препарату цетиризин, що
проявляються в збільшенні синтезу мононуклеарними клітинами крові TGF-(
та IL-10, а також у зменшенні експресії молекул адгезії ICAM-1
кератиноцитами базального відділу епідермісу у хворих IgE-залежною
формою АД.

Практичне значення та впровадження одержаних результатів. На підставі
великої кількості досліджень автором розкриті нові механізми
імунопатогенезу різних клінічних форм АД та запропонований
імунодіагностичний алгоритм, що дозволяє проводити диференціальну
діагностику між IgE-залежною й IgE-незалежною формою АД.

Запропоновано новий метод культивування лімфоцитів, що інфільтрують
уражену шкіру, який дозволяє провести кількісний імунофенотипічний
аналіз лімфоцитарного складу запального інфільтрату у хворих різними
формами АД, а також визначити ступінь проліферативної активності
лімфоцитів у відповідь на дію стафілококових токсинів.

Проведені в умовах in vitro експерименти дозволили встановити, що
препарат Ербісол має ефект із впливом на клітинну ланку та цитокіновий
профіль, що дає можливість включити його в схему імунотропної терапії у
хворих IgE-залежною формою АД. На підставі клініко-лабораторних і
сучасних імунологічних досліджень були продемонстровані позитивні ефекти
пролонгованої терапії сучасним антигістамінним препаратом цетиризин.

Запропонований алгоритм диференціальної імунодіагностики та методи
лікування хворих на різні клінічні форми АД апробовано на кафедрі
клінічної імунології та алергології Національного медичного університету
імені О.О.Богомольця та в клініці Київського міського
шкірно-венерологічного диспансеру. Результати дослідження та
запропоновані методи діагностики та лікування хворих на АД можуть бути
впроваджені в спеціалізованих клініках та при амбулаторному лікуванні
фахівцями відповідного профілю – алергологами, клінічними імунологами,
дерматологами, а також у навчальний процес (в тематику лекцій та
практичних занять на кафедрах клінічної імунології та алергології,
дерматовенерології, патологічної анатомії та клінічної фармакології.
Матеріали дисертації увійшли в розділи посібника під редакцією професора
Г.М. Дранніка: „Навчальний посібник з клінічної імунології та
алергології для позааудитної роботи студентів” (Київ, 2005 р.).
Методичні підходи до імунодіагностики IgE-залежної та IgE-незалежної
форм АД дозволяють рекомендувати їх для використання, крім вищезгаданих
фахівців, лікарями-лаборантами і педіатрами.

Особистий внесок здобувача. Ідея дисертаційної роботи запропонована
автором і підтримана провідними спеціалістами в області клінічної
імунології, алергології та дерматології – доктором медичних наук,
професором Г.М. Дранніком і доктором медичних наук, професором Б.Т.
Глухеньким. Автором самостійно проведено відбір, обстеження та лікування
хворих АД зі спостереженням пацієнтів у динаміці. Діагностика і терапія
хворих на АД проводилася за допомогою як традиційних, так і
запропонованих дисертантом науково-обґрунтованих внаслідок проведених
досліджень методів. У процесі роботи над дисертацією автором
оптимізовані та розроблені методи диференційної імунодіагностики і
терапії різних форм захворювання. Загально-клінічне, алергологічне,
імунологічне та імуногістохімічне обстеження хворих було проведено
автором спільно з фахівцями відповідного профілю. Дерматологічне
обстеження пацієнтів відбувалося на клінічній базі НМУ – Київського
міського шкірно-венерологічного диспансеру і кафедри клінічної
імунології та алергології НМУ імені О.О.Богомольця. Імунологічні
дослідження були проведені разом зі співробітниками імунологічних
лабораторій інститутів урології, нефрології та гематології АМН України.
Імуногістохімічні дослідження були проведені спільно з фахівцями кафедри
патологічної анатомії Буковинського державного медичного університету та
лабораторіями патоморфології інститутів урології та нефрології АМН
України. Розробка основних напрямків досліджень, визначення мети і
завдання роботи, а також аналіз отриманих результатів, положень і
висновків проведено автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були
повідомлені та обговорені на конференціях і з’їздах: “V Українській
науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології
та алергології” (Київ, 2000); Всеукраїнський науково-практичній
конференції “Імунозалежні, мікотичні, паразитарні дерматози та
захворювання, що передаються статевим шляхом” (Київ, 2001);
“Науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю Наукового
товариства лікарів-дерматовенерологів міста Києва” (Київ, 2001); “VI
Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної
і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації” (Київ,
2002);

“І Українській науково-практичній школи-семінару з актуальних питань
клінічної імунології та алергології” (Судак, 2003); VI Міждисциплінарній
науково-практичній конференції: „Епідеміологія, імунопатогенез,
діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій” (Київ, 2004);

“VII Українській науково-практичній конференції з актуальних питань
клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації”
(Київ, 2005); I(VIII)З’їзді української асоціації
лікарів-дерматовенерологів і косметологів” (Київ, 2005); “VIIІ
Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної
і лабораторної імунології та імунореабілітації” (Київ, 2007); “II
Національному конгресі з клінічної імунології та алергології” (Миргород
2007).

На міжнародних симпозіумах і конгресах: “American College of Allergy,
Asthma and Immunology Annual Meeting”(Orlando, USA, 2001); “American
Academy of Allergy, Asthma and Immunology 58th Annual Meeting”(New-York,
USA, 2002); “World Allergy Organization Congress – XVIII ICACI”
(Vancouver, Canada, 2003); American Academy of Allergy, Asthma and
Immunology 60th anniversary meeting” (Denver, USA, 2003); “XXII Congress
of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology” (Paris,
France, 2003); “American College of Allergy, Asthma and Immunology
Annual Meeting”(New Orleans, USA, 2003); “American College of Allergy,
Asthma and Immunology Annual Meeting”(Boston, USA, 2004); “American
Academy of Allergy, Asthma and Immunology 61st Annual Meeting”
(San-Antonio, USA, 2005); “Federation of Clinical Immunology Societies
(FOCIS) 5th Annual Meeting”(Boston, USA, 2005); “World Allergy Congress”
(Munich, Germany, 2005); “American College of Allergy, Asthma and
Immunology Annual Meeting” (Anaheim, USA, 2005); “American Academy of
Allergy, Asthma and Immunology 62nd Annual Meeting” (Florida, USA.
2006); “XXV Congress of the European Academy of Allergology and Clinical
Immunology” (Vienna, Austria, 2006); “American College of Allergy,
Asthma and Immunology Annual Meeting” (Philadelphia, USA, 2006);
“American Academy of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting” (San
Diego, USA, 2007); “XXVI Congress of the European Academy of Allergology
and Clinical Immunology” (Goteborg, Sweden, 2007);
“Amer?????????????????????????????????????????

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи достатньо повно
висвітлені у 55 роботах, у тому числі в 27 статтях у фахових наукових
журналах, які входять до переліку ВАК України, 28 в матеріалах
конференцій: тезах та постерних доповідях, з яких 17 опубліковано за
кордоном.

Структура та обсяг дисертації. Загальний обсяг дисертації становить 320
сторінок, робота складається із вступу, огляду літератури, 8 глав
власних досліджень, аналізу та узагальненню отриманих результатів,
висновків, рекомендацій щодо наукового та практичного використання
здобутих даних. Результати досліджень відображені у 32 таблицях та у 35
малюнках. Вказівник літератури включає 350 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дисертаційна робота базується на
аналізах результатів обстеження та лікування 160 хворих з різними
клінічними формами атопічного дерматиту, які перебували на стаціонарному
та диспансерному лікуванні в умовах поліклінічного та стаціонарного
відділень клініки Київського міського шкірно-венерологічного диспансеру,
а також на базах кафедри клінічної імунології та алергології НМУ імені
О.О.Богомольця що розташовуються на території вузлової залізничної
лікарні № 1 ст. Дарниця та поліклініки № 3 Подільського району м. Києва
в період з 1999 по 2006 рр. Досліджувану групу склали винятково дорослі
люди віком від 16 до 55 років. По вікових групах хворі розподілилися в
такий спосіб (рис.1). Контрольну групу склали 30 здорових осіб
репрезентативного віку.

Рис. 1. Процентний розподіл хворих за віком.

Комісією з біоетики Національного медичного університету імені
О.О.Богомольця (протокол № 20 від 30.05.07 р.) встановлено, що
обстеження, лікування хворих, проведення лабораторних та наукових
досліджень в дисертаційній роботі відповідають вимогам норм біоетики.

Діагноз атопічний дерматит визначався згідно широко використовуваним в
зарубіжній і вітчизняній практиці клінічним критеріям, запропонованим
Hanifin і Rajka [1980] та підтвердженим рекомендаціями об’єднаного
експертного комітету європейської та американської академій алергології
та клінічної імунології [PRACTALL, 2006]. У більшості обстежених хворих
спостерігалися 2 основних і 3-4 додаткових клінічних критеріїв, що було
достатньо для постановки діагнозу. Беручи до уваги поліморфізм клінічної
картини АД, а також відсутність єдиної думки із приводу класифікації
дерматозу, ми провели поглиблене комплексне клініко-лабораторне
обстеження всіх 160 хворих. При розподілі хворих на групи ми
використовували один з основних діагностичних лабораторних критеріїв АД,
запропонованих проблемною комісією по номенклатурі атопічних захворювань
Європейської академії алергології та клінічної імунології [EAACI, 2001]
яким служила висока концентрація загального IgE в крові хворих на АД.
Відповідно до цих рекомендацій всі обстежені хворі атопічним дерматитом
(80 пацієнтів), що мали високі рівні, як загального, так і специфічного
IgE були визначені нами в групу IgE-залежної форми АД.

Хворі, з типовими клінічними проявами захворювання, у яких концентрації
загального і специфічного IgE були низькими, або перебували в межах
показників вікової норми, склали групу (80 хворих) IgE-незалежної форми
атопічного дерматиту.

Відповідно до встановлених мети і завдань при обстеженні пацієнтів
підбиралися та використовувалися загальноприйняті в алергології та
клінічній імунології клініко-анамнестичні та лабораторні методи
дослідження. Основна увага приділялась збору алергологічного анамнезу.

Концентрацію загального та алерген специфічного IgE в сироватці крові
визначали відповідними тест-системами методом твердофазного
імуноферментного аналізу (ELISA) за методикою запропонованою фірмою
“ICN” (СШA).

Рівень імуноглобулінів (IgG, IgМ і IgА) та сироваткових цитокінів (
IL-2, IFN-( і TNF-(, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-12, IL-16, IL-18 та
sIL-2R) також визначали за допомогою твердофазного імуноферментного
аналізу (ELISA). Для визначення концентрації цитокінів використовували
методики та комерційні набори тест-систем фірм “Immunotech” і “Diaclone”
(Франція).

Для визначення спонтанної та індукованої продукції цитокінів
мононуклеарами периферичної крові in vitro використовувалося
культуральне середовище RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої
сироватки, 40 мкг/мл гентаміцина, 5х10 М 2-меркаптоетанола та 3%
L-глютамін. Клітинну суспензію в концентрації 1,5х10 кл/мл інкубували 24
години в СО2-інкубаторі при 37єС без стимулюючого агента, а також у
присутності мітогенів. По закінченні строку інкубації клітини осаджували
центрифугуванням при 1600 об/хв. протягом 10 хвилин, збирали
супернатанти та зберігали до тестування при -20єС. Вміст цитокінів
(IL-1, TNF-(, IL-12, IL-2, IFN-(, IL-4. IL-5, IL-10 та TGF-() у
супернатантах визначали за допомогою методу імуноферментного аналізу,
згідно методики запропонованої фірмами-виробниками:“Immunotech” і
“Diaclone” (Франція).

Антигени HLA визначали за допомогою стандартного
мікролімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі з використанням
спеціальної панелі анти-HLA сироваток, за допомогою якої можна визначити
більше 20 антигенів локусу А, близько 30 – локусу В и 20 антигенів
локусу DR. Лімфоцити, необхідні для проведення типування, виділяли з
гепаринізованої периферичної крові шляхом центрифугування на градієнті
щільності фікол-верографіна.

Вірогідність різниці в частоті визначення порівнюваних HLA-антигенів
оцінювали за допомогою критерію хі-квадрат. У випадках, коли один з
показників був менше 10, для оцінки вірогідності різниці використовували
метод Фішера. Величину відносного ризику захворювання (RR) визначали за
коефіцієнтом: RR = аб/вг, де а – кількість хворих, позитивних по даному
антигену, б – кількість осіб у контролі, негативних по даному антигену,
в – кількість хворих, негативних по даному антигену, г – кількість осіб
у контролі, позитивних по даному антигену. При цьому вірогідно значимими
вважали показники RR>2,0.

Визначення імунотипових властивостей та кількісних співвідношень клітин
мононуклеарної фракції периферичної крові здійснювали за допомогою
метода лазерної проточної цитофлуорометрії. Виділені мононуклеарні
клітки периферичної крові хворих на АД і здорових донорів фарбували за
допомогою прямого одно- і двокольорового імунофлуоресцентного метода. У
дослідженні використовували різні панелі моноклональних антитіл, мічених
як флюоресцєїном, так і фікоерітрином. Список застосованих в дослідженні
мкАТ приведений в табл. 1.

Імунофенотипічний профіль клітин вивчали на проточному лазерному
цитофлуориметрі FACScan фірми “Becton Dickinson” (CШA). Збір даних і
статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою
програмного забезпечення LYSYS-II Ver.I.I. (Becton Dickinson), Win MDI
2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, LA Jolla, CA, USA) та Microsoft
Excel 2000 з пакета Microsoft Office 2000.

З метою встановлення остаточного діагнозу АД та диференційної
діагностики АД та Т-клітинної лімфоми шкіри у 33 хворих було проведено
гістологічне та імуногістохімічне дослідження біоптатів ураженої шкіри.
Досліджувалися біоптати шкіри, діаметром 3мм. Біоптичний матеріал брався
після письмової згоди пацієнтів. Контролем служили біоптати шкіри,
одержані при косметологічних операціях. Біоптати після узяття
заморожували в рідкому азоті або безпосередньо в кріостаті. В умовах
кріостата одержували послідовні серійні зрізи завтовшки 10 мікрон.
Одержані серійні кріостатні зрізи наносили на стекла, покриті поли
L-лізином, підсушували на повітрі протягом 1 години і фіксували 5 мін в
ацетоні при температурі 3°С. У дослідженні було застосовано стандартний
метод біотін-стрептавідін імунопероксидазного фарбування (Strept
ABComplex/HRP) виробництва фірми “DAKO”(Данія) з використанням як
хромогенного субстрату 3-амино-9-этилкарбозола (АЕС) або ж 3,3’
діамінобензідіна солянокислого (DAB). Фонове фарбування проводили за
допомогою гематоксиліна. У дослідженні використовували панель
моноклональних антитіл різної антигенної спрямованості (список антитіл
приведений в табл. 1).

Таблиця 1

Моноклональні антитіла, використані у дослідженнях

CD Маркер Фірма-Виробник

CD1a Дендритні клітини, клітини Лангерганса DAKO

CD3 Pan Т-лімфоцити DAKO

CD4 Т-лімфоцити хелпери DAKO

CD8 Т-лімфоцити кілери/супресори DAKO

CD14 Моноцити/макрофаги Beсton Dickinson

CD16 NK-клітини Beсton Dickinson

CD19 Pan В-лімфоцити Beсton Dickinson

CD22 Pan В-лімфоцити DAKO

CD25 Клітини, що несуть IL-2R, T-reg Beсton Dickinson

CD56 NK-клітини DAKO

CD80 Молекули ко-стимуляції (В7.1) Beсton Dickinson

CD86 Молекули ко-стимуляції (В7.2) Beсton Dickinson

HLA-DR Антиген головного комплексу гістосумісності II класу DAKO

CLA Шкірний лімфоцитарний антиген Beсton Dickinson

CD54 Адгезивні молекули ICAM-1 Beсton Dickinson

Fc(RI Високоафінний рецептор IgE Hoffmann-La Roche

Fc(RII/23 Низькоафінний рецептор IgE Beсton Dickinson

CD119 Рецептор до ІFN-( Caltag laboratories

CD45RO Т-лімфоцити пам’яті/ефекторні клітини Beсton Dickinson

CD45RA “Наївні” Т-лімфоцити Beсton Dickinson

CD7 Адгезивна молекула Beсton Dickinson

Отримані результати оброблені статистично на персональному комп’ютері за
допомогою пакета програм “SPSS for Windows. Версія 11” і “MedStat”.
Математична обробка отриманих результатів проводилася з урахуванням
перевірки показників на нормальний розподіл і порівняння груп за
ознаками статі й віку з використанням тесту Колмогорова-Смирнова і
критерію хi-квадрат [Славин М.Б., 1989]. Для статистичної обробки
використовувалися параметричні критерії статистики – тест Ст’юдента або
метод Шефе та непараметричні – критерій Уілкоксона, аналіз
Крускала-Уолліса [Пилипенко М.І., 2000]. Для порівняння залежних вибірок
використовували критерії Ст’юдента і Уілкоксона. Достовірною вважали
різницю при р †?ue2 ?   ? O h?\(@? ??? h?\(@? h?\(@? h?\(@? 8 8 8 8 8 8 ?? 8 ? ? ? ? ????копичення CD1a+ дендритних клітин, що мігрують з епідермісу через дерму в лімфатичні вузли. Значно менше містилося CD8+Т-лімфоцитів та CD45RA+ “наївних” Т-лімфоцитів. У зіставленні показників клітинного складу інфільтратів шкіри при IgE-залежній та IgE-незалежній формі АД виявлені незначні відмінності, пов’язані з дещо великими величинами характерними для IgE-залежної форми АД. Вагомі відмінності в клітинному складі інфільтратів між різними клінічними формами АД виявилися в кількості клітин що несуть маркери активації HLA-DR і CD25 (IgE-залежна форма – 69.8% HLA-DR+клітин та –67.3% CD25+ клітин); При IgE-незалежній формі вміст цих клітин склав – 10% HLA-DR+клітин та – 8% CD25+ клітин відповідно. Все це вказує на високу напруженість місцевого імунологічного процесу в умовах хронічного перебігу IgE-залежної форми АД. У контексті певних властивостей шкірного бар'єру, його участі у формуванні локального запалення, представляв інтерес з вивчення імунологічних властивостей епідермісу запаленої шкіри хворих з хронічним перебігом АД. Вивчали імунологічні властивості й вміст в епідермісі клітин Лангергансу (CD1а+, HLA-DR+ та CD80+, CD86+ клітини), імунологічні властивості кератиноцитів (експресія HLA-DR антигену та молекул ICAM-1, CD119), а також присутність клітин лімфоїдного ряду (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ та CD45RO+клітини). Необхідно відзначити, що лімфоцити в епідермісі у зоні запалення зустрічали рідко в одиничному числі, а CD22+ В-лімфоцитів зовсім не спостерігали. У співвідношенні до чисельності кератиноцитів число CD1а+ клітин Лангерганса в епідермісі зростало щодо контролю (7.1±0.025%) як при IgE-залежній (23.1±3.2%), так і при IgE-незалежній (13.3±1.3%) формі АД. Такі ж кількісні співвідношення клітин Лангерганса виявилися й в експресії HLA-DR антигенів. Все це вказує на функціональну зрілість клітин Лангерганса їх здатності до міграції та презентації антигену. Представляє інтерес вивчення особливості експресії в епідермісі CD80 і CD86 молекул, яка була характерна тільки для клітин з морфологією дендритних клітин. Звичайно такої експресії не спостерігається в незміненому епідермісі (контрольне дослідження). На відміну від норми у чисельності CD80+ та CD86+ клітин при різних формах АД були знайдені певні відмінності. Для IgE-залежного АД число CD80+ і CD86+ клітин складало –9.7±0.11% та –16.3±1.3% відповідно. Менша чисельність CD80+ і CD86+ клітин була відмічена в епідермісі хворих на IgE-незалежну форму АД (CD80+ клітин –5.3±0.11%; CD86+ клітин –8.4±0.13%). Експресія клітинами Лангерганса ко-стімуляторних молекул CD80 і CD86 вказує на високий рівень зрілості цих клітин, що створює умови для презентації антигена зразу ж після виходу клітин за межі епідермісу. Оскільки представлення антигена відбувається в лімфоїдній тканині, прояв таких властивостей в межах запаленої дерми визначатиме вплив на напруженість локального запального процесу. Кератиноцити нормальної шкіри конституційно не експресують молекулу міжклітинної адгезії ICAM-1. Проте в умовах хронічного перебігу АД експресія цієї молекули виявлялася в кератиноцитах базального відділу епідермісу. Прояв ICAM-1 позитивності клітин топічно співпадав з прилеглими запальними інфільтратами дерми і проявлялася локусами, складеними з ICAM-1+ кератиноцитів. Відмічені відмінності між IgE-залежною та IgE-незалежною формою АД в чисельній кількості в епідермісі ICAM-1+ кератиноцитів: клітинні скупчення у вигляді локусів із вмістом до 30 ICAM-1+ кератіноцитов при IgE-залежному АД та клітинні скупчення із вмістом до 10 ICAM-1+ кератіноцитов при IgE-незалежному АД. Відміченими властивостями кератиноцити привертають лейкоцити в зону ураження шкіри і запалений епідерміс. Кератіноцити нормальної шкіри не експресують також рецептора до IFN-г (CD119 молекула), проте відомо, що секреція Т-лімфоцитами IFN-г може, через таке посередництво, активувати кератиноцити, індукуючи експресію ними HLA-DR антигенів. Було проведено дослідження епідермісу зони запалення в хронічному періоді IgE-залежного і IgE-незалежного АД. В епідермісі експресія CD119 виявлялася в групах кератиноцитів по 5-15 клітин, з переважною локалізацією в базальних і парабазальних відділах епідермісу, безпосередньо над дермальними запальними інфільтратами. При зіставленні кількості клітин що єкспресують CD119 в різних формах АД відмічено приблизно рівний кількісний склад у вмісті CD119+ кератиноцитів в клітинних локусах по 10-15 клітин при IgE-залежній формі АД і до 10 клітин епідермісу при IgE-незалежній формі АД. З метою з'ясування проліферативних властивостей лімфоцитарного компоненту клітинних інфільтратів запаленої шкіри хворих на хронічний IgE-залежний АД подрібнений біоптат шкіри інкубувався в культуральному середовищі з додаванням IL-2 та IL-4. Після шестиденної інкубації виділені з культурального середовища мононуклеарні клітини вивчали за допомогою проточного лазерного цитофлуоріметра з використанням мічених моноклонарних антитіл в одно (CD3, CD4, CD8, CD56, CD19) та двобарвному (CD3+HLA-DR+, CD4+CD45RO+, CD4+ CD45RA+) імунофлюресцентному тесті. Паралельно досліджувалися реактогенні властивості мононуклеарної фракції периферичної крові тих же хворих. У зіставленні показників визначали реактогенно-проліфератівні відмінності між клітинами вогнища запалення АД і клітинами що циркулюють у крові. Аналіз показав високу проліферативну активність CD3+, CD4+, CD8+ клітин запаленої шкіри із співвідношенням CD4:CD8=3.17:1 що співпадає з якісними особливостями проліферації клітин крові (CD4:CD8=3.26:1). Проте CD56+клетки, що виділені із запаленої шкіри мали меншу реактивність і склали 4.8% проліферуючої маси клітин (CD56+клітини периферичної крові – 9.5%). Більшість проліферуючих in vitro CD3+ Т-лімфоцитів (71.3%), виділених з шкіри, була в активованому стані і експресувала HLA-DR антиген. Виділені з крові і проліферуючі in vitro CD3+клітини були менше активовані і лише 3% з них експресували HLA-DR антиген. Необхідно відзначити відсутність в проліферуючій масі клітин, виділених зі шкіри, CD19+ В-лімфоцитів, що в цілому було характерно для запаленої шкіри АД. У масі проліферуючих CD4+ Т-лімфоцитів виділених із запаленої шкіри та одержаних після активації, 73.4% володіли фенотипом CD4+CD45RO+ клітин пам'яті за відсутності “наївних” CD4+CD45RA+ Т-лімфоцитів. У масі проліферуючих CD4+Т-лімфоцитів, виділених з крові, тільки 35% мали фенотип CD4+CD45RO+ Т-клітин пам'яті. У контексті відомих даних про участь стафілококових токсинів (суперантигенів) у формуванні імунної відповіді при АД було проведено дослідження проліферативної активності лімфоцитів, виділених в умовах культивування біоптатів запаленої шкіри хворих на АД. Культивування проводилося з додаванням зростаючих доз стафілококового токсину-1 токсичного шоку (TSST-1) або ж стафілококового ентеротоксину В (SEB). Зіставлення індексів активацї показало підвищення проліферативної активності клітин при дії TSST-1 як в IgE-залежному АД, так і в IgE- незалежному АД. Для IgE-залежної форми АД відзначили триразове підвищення, щодо норми, проліферативної активності клітин, а для IgE-незалежної форми АД підвищення було двократне. Проте для IgE-незалежної форми АД зберігалася чутливість до підвищення доз токсину, чого не було відмічено в IgE-залежній формі АД, де високий рівень проліферації не залежав від дози токсину. Цікаво, що в обох формах АД відзначили, у протилежність ефекту TSST-1, зниження проліферативної активності у присутності SEB з більшою виваженістю в IgE-незалежній формі АД. Одержані результати вказують на те, що мікробні суперантигени в зоні запалення виконують важливу роль, проявляючи стимулюючий (TSST-1) або ж подавляючий (SEB) ефект, впливаючи на лімфоцитарний компонент запалення. При цьому велика чутливість клітин до дії TSST-1 виявляється в лімфоцитах хворих на IgE-залежну форму АД. Представляв інтерес з'ясувати якою мірою спостережувані відмінності клітинного складу системи імунітету при IgE-залежній і IgE-незалежній формі АД асоційовані з генетичними особливостями індивіда, з його фенотипом антигенів гистосумісності (HLA). Відомі дані про асоціацію HLA-фенотипу з порушеннями імунної відповіді при АД, проте в наведених дослідженнях немає розмежувань між різними клінічними формами АД. Нами був проведений аналіз розподілу HLA-A (А24), HLA-B (В5,В7, В8, В9, В22, В27) та HLA-DR (DR2, DR3, DR7) антигенів в двох формах АД. Результати дослідження підтверджують дані про асоціацію IgE-залежного АД з носійством HLA-B7 антигену. Результати дослідження показують, що антиген А24 можна вважати маркером ризику по локусу HLA-А схильності до виникнення IgE-залежної форми АД. Дослідження локусу В показало наявність атрибутивного ризику розвитку IgE-залежного АД тільки для індивідів з антигенами В7, В22, В27. На нашу думку особливе значення має частота HLA-В7 антигену, що зустрічається у хворих з IgE-залежною формою (RR1=2.8). Це підтверджує дані літератури про спадкову схильність до формування IgE-опосередкованої відповіді у хворих з атопічними захворюваннями, що мають носійство HLA-В7 антигену. Нами відмічений той факт підвищення частоти HLA-В22 антигену при IgE-залежній формі АД, що підтверджує провокаційну роль HLA-В22 антигену в розвитку IgE-залежного АД. Аналіз розподілу антигенів HLA-DR показав, що у хворих часто зустрічається експресія HLA-DR2 (18.2%), HLA-DR3 (11.4%) та HLA-DR7 (8.4%) антигенів. У хворих на IgE-незалежну форму АД асоціативного зв'язку з носійством HLA-А24, HLA-В7, HLA-В22, HLA-В27 та HLA-DR2 не виявлено. Це свідчить про многофакторність генезу шкірного синдрому АД у хворих на IgE-незалежну форму АД та відсутність чіткого зв'язку з HLA-фенотипом. По результатах дослідження були проведені більш поглиблені вивчення зв'язку продукції in vitro клітинами крові IFN-г та TGF-в з HLA-фенотипом у хворих на IgE-залежну форму АД. Аналіз даних показав, що продукція TGF-в мононуклеарними клітинами була нижчою у носіїв антигенів ризику HLA-A24, HLA-В7 і HLA-DR2. Можна припускати, що HLA-фенотип і низький рівень продукції клітинами TGF-в лежать в основі розвитку IgE-залежної форми АД. Метою першого дослідження було вивчення впливу препарату Ербісол на здатність імунокомпетентних клітин in vitro до продукції цитокінів IFN-(, IL-4 та TGF-( у хворих з IgЕ-залежною формою АД для обґрунтування можливості застосування даного препарату при цій формі захворювання. Результати дослідження спонтанної і індукованої препаратом Ербісол продукції IFN-(, IL-4 та TGF-( у здорових донорів і хворих IgЕ-залежною формою АД приведені в табл. 5. Таблиця 5 Показники спонтанної та індукованої продукції цитокінів in vitro здорових донорів і хворих IgЕ-залежною формою АД під впливом мітогенів та препарату Ербісол. Цитокіни Спонтанна продукція Індукована продукція Ербісол Здорові (n=30) IgЕ-залежний АД (n=33) Здорові (n=30) IgЕ-залежний АД (n=33) Здорові (n=30) IgЕ-залежний АД (n=33) IFN-( pg/ml 15,9±0,4 10,3±3,1* 42,5±5,2 30,4±6,3* 46,1±1,7 77,2±7,5* IL-4 pg/ml 39,4±7,1 72,5±1,2* 78,6±7,3 138,6±4,3* 22,1±5,4 33,4±4,6* TGF-( pg/ml 85,3±3,3 87,5±3,5* 118,6±2,2 105,3±11,2* 147,9±3,2 233,6±7,2* Примітка:*- достовірна відмінність щодо показників у здорових донорів (p ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА СКОРОЧЕНЬ АД - атопічний дерматит мкАТ - моноклональні антитіла CD - кластери диференціювання CLA - шкірний лімфоцит-асоційований антиген ELISA - твердофазний імуноферментний аналіз ICAM-1 - міжклітинна молекул адгезії-1 IL - інтерлейкін IFN-г - інтерферон-г HLA - антигени гістосумісності FcеRI - високоафінні рецептори до IgE FcеRII - низькоафінні рецептори до IgE SEB - ентеротоксин В Th - Т -хелпери TGF-в - трансформуючий фактор росту-в TNF-б - фактор некрозу пухлин-б TSST-1 - стафілококовий токсин токсичного шоку -1 PAGE 1 50-55р 40-49р 30-39р 20-29р 16-19р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020