.

Механізми взаємодії мишачих макрофагоподібних клітин лінії J774.2 з клітинами-мішенями (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
121 3615
Скачать документ

Національна Академія Наук УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

Кащак Наталія Іванівна

УДК 612.112.3.014:616-006-018

Механізми взаємодії мишачих макрофагоподібних клітин лінії J774.2 з
клітинами-мішенями

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України, м. Львів

Науковий керівник – член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин і апоптозу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Оболенська Марія Юріївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

відділ механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор медичних наук, професор

Ященко Антоніна Михайлівна,

Львівський національний медичний університет

імені Данила Галицького,

кафедра гістології, цитології та ембріології.

Захист відбудеться “ 7 ” листопада 2007 р. о 15.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН
України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини
НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано “ 5 ” жовтня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Убийвовк В. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Макрофаги присутні практично в усіх тканинах
організму, включаючи імунопривілейовані органи, де вони диференціюються
до різних за морфологією клітин, таких як альвеолярні макрофаги,
макрофаги селезінки, макрофаги стінки кишкового тракту, печінки
(Купферові клітини), шкіри, мікрогліальні клітини, остеокласти,
перитонеальні макрофаги, макрофаги нирок, макрофаги молока та ін. (Hume
A. et al, 2006). Ці клітини, реагуючи на зміни в мікрооточенні, беруть
участь у регуляції гемопоезу, системи зсідання крові, процесів репарації
та регенерації, гаметогенезу та цілої низки обмінних процесів в
організмі.

Макрофаги характеризуються значною фенотипічною гетерогенністю та
проявляють діаметрально протилежні за своєю природою прозапальну та
протизапальну, імуногенну та толерогенну, тканинодеструктивну та
репаративну активності.

Макрофаги є важливим компонентом системи вродженого імунітету, що
відрізняється від системи набутого імунітету значно меншою
різноманітністю специфічних рецепторів. Клітини системи специфічного
імунітету здатні розпізнати практично будь-який антиген. Існує близько
1014 та 1018 різноманітних соматично генерованих шляхом реаранжування
генів імуноглобулінових рецепторів та рецепторів Т-клітин відповідно.
Загальна ж кількість рецепторів, задіяних у системі розпізнавання
вродженого імунітету, складає, як вважають, сотні. Рецептори клітин
системи вродженого імунітету не здатні розпізнати будь-який антиген, а
лише обмежену кількість висококонсервативних структур, притаманних
різноманітним мікроорганізмам, а також певні структури клітин
організму-господаря – індикатори злоякісної трансформації, стресу,
смерті. Незважаючи на практично необмежені можливості генерації
рецепторів для специфічної відповіді клітинами системи набутого
імунітету, ініціація такої відповіді залежить від костимуляторних
сигналів антиген-презентуючих клітин з невеликою кількістю
паттернспецифічних рецепторів. Потенційно будь-який антиген може бути як
імуногеном, так толерогеном для клітин специфічного імунітету й це
залежить від сигналу клітин вродженого імунітету (Medzhitov R. et al,
2000, Frazer I. H. et al, 2001, Clark R. et al, 2005).

Макрофаги здатні розпізнавати і вбивати трансформовані клітини, хоча
механізми такого розпізнавання залишаються нез’ясованими (Krahenbuhl J.L
et al., 1974, Klostergaard J., 1993, Hicks A. M. et al., 2006). Крім
того, макрофаги можуть стимулювати ріст пухлин (Bingle L. et al, 2002).
Пухлина є гетерогенною структурою, що містить, крім трансформованих
клітин, нормальні клітини, компоненти строми. In vivo макрофаги
взаємодіють з різними типами клітин-мішеней одночасно. При цьому
генерація імунної відповіді до клітин, що містять змінені структури,
може спричиняти пошкодження т. з. клітин-свідків, у тому числі й за
участю системи специфічного імунітету. У свою чергу, нечутливі
клітини-мішені також можуть модулювати імунну відповідь щодо чутливих
клітин. Таким чином, важливо з’ясувати, які зміни відбуваються у
функціонуванні макрофагів, що взаємодіють з різними типами
клітин-мішеней одночасно.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках держбюджетних тем Інституту біології клітини
Національної Академії Наук України “Дослідження впливу цитотоксичних
білків і лектинів на пухлинні та імунокомпетентні клітини” №
держреєстрації 0100U000080 (2000-2002 рр.) та “Механізми індукції
антипроліферативної та цитотоксичної активності в нормальних і
трансформованих клітин” № держреєстрації 0103U001404 (2003-2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Головною метою роботи було дослідити зміни
в мишачих макрофагах лінії J774.2, що взаємодіють з клітинами-мішенями,
які є чутливими та нечутливими до їх цитотоксичної дії: мишачими
фібробластами ліній L929 та NIH 3T3.

Для досягнення поставленої мети в дисертаційній роботі вирішували такі
завдання:

Дослідити життєздатність клітин-мішеней та клітин-ефекторів у змішаних
культурах за такими критеріями як транслокація фосфатидилсерину на
зовнішній бік плазматичної мембрани, зниження трансмембранного
мітохондріального потенціалу, фрагментація ДНК та активація каспаз.

Дослідити вплив різних умов культивування на цитотоксичну активність
макрофагів щодо клітин-мішеней.

Дослідити продукцію макрофагами розчинних цитотоксичних медіаторів:
окису нітрогену та фактора некрозу пухлин.

Дослідити експресію генів цитокінів та генів, пов’язаних з трансдукцією
сигналів у макрофагів, виділених з кокультури з клітинами-мішенями за
допомогою ДНК-матриць та методом реакції зворотної транскрипції з
наступною ампліфікацією продуктів у ланцюговій полімеразній реакції.

Дослідити ДНК-зв’язувальну активність транскрипційного фактора NF-(B з
ядерних екстрактів макрофагів, виділених із кокультури з
клітинами-мішенями.

Об’єкт дослідження. Взаємодія макрофагів лінії J774.2 з
клітинами-мішенями, що характеризуються різною чутливістю до їх
цитотоксичної дії.

Предмет дослідження. Регуляторні системи, які забезпечують цитотоксичну
активність макрофагів та інгібування цієї активності нечутливими
клітинами-мішенями.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі було
вперше показано, що нормальні мишачі фібробласти лінії NIH 3T3,
нечутливі до дії мишачих макрофаги лінії J774.2, інгібують цитотоксичну
активність останніх щодо трансформованих мишачих фібробластів лінії
L929. У макрофагів, культивованих з чутливим клітинами-мішенями, зростає
ДНК-зв’язувальна активність транскрипційного фактора NF-(B, тоді як за
присутності NIH 3T3 фібробластів ця активність не змінюється.
Встановлено, що у макрофагів, які проявляли цитотоксичну дію, зростає
рівень експресії мРНК інтерлейкіну-1(, попередника NF-(B р105, антигена
СD5, GADD45, фактора, що індукується при зупинці клітинного циклу чи
пошкодженні ДНК, та знижується експресія мРНК (-ланцюга інгібіторного
білка I-(B. За присутності нормальних мишачих фібробластів лінії NIH 3T3
в кокультурі J774.2 макрофагів з трансформованими фібробластами лінії
L929 експресія мРНК вищезгаданих генів у макрофагів була приблизно на
тому ж рівні, що й при культивуванні останніх тільки з нечутливими
фібробластами лінії NIH 3T3.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені в
дисертаційній роботі, дозволяють краще зрозуміти механізми взаємодії
макрофагів з клітинами-мішенями та механізми нечутливості
трансформованих клітин до цитотоксичної дії макрофагів. Методичні
підходи, використані в роботі, можуть бути корисними для досліджень на
експериментальних моделях з гетерогенними клітинними популяціями.
Одержані результати й теоретичні узагальнення, що стосуються
особливостей модуляції взаємодії макрофагів з клітинами-мішенями,
використовуються при викладанні спецкурсу “Молекулярні механізми
регуляції проліферації та диференціації клітин” у Львівському
національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацювала літературу
за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальну частину та
статистично обробила отримані результати. Дослідження експресії генів у
макрофагів, культивованих з клітинами-мішенями, проведено за участю
Царика Р.В. Аналіз отриманих даних здійснено спільно з науковим
керівником, д.б.н., професором Стойкою Р.С.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблено
доповіді на конференції “Макрофаг 2000. Мононуклеарні фагоцити у
фундаментальній та клінічній імунології” (Краків, 21-22 вересня, 2000
р.), на Третій Парнасівській конференції “Механізми клітинного
сигналювання та комунікації” (Львів, 14-18 жовтня, 2000 р.), Першому
(Установчому) Українському з’їзді клітинних біологів (Львів, 25-28
квітня, 2004 р.), 29 з’їзді Федерації європейських біохімічних товариств
(Варшава, 26 червня-1 липня, 2004 р.), на конференції “Гістологія на
сучасному етапі розвитку науки” (Тернопіль, 12-13 жовтня, 2004 р.), на
ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 24-27 жовтня, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з
них 6 – у фахових періодичних виданнях і 6 – у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 137 сторінках
комп’ютерного набору, побудована за традиційної схемою та складається зі
вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4-х
розділів, де викладено отримані результати, проведено їх аналіз та
узагальнення, а також із висновків і списку використаної літератури.
Робота містить 36 рисунків. Бібліографічний список налічує 220 джерел..

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано інформацію щодо функціонування
макрофагів, їх взаємодії з клітинами-мішенями та імуномодулюючої дії
пухлинної строми.

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовували мишачі
макрофаги лінії J774.2, отримані з Інституту Вільяма Гарвея (Лондон,
Велика Британія), нормальні мишачі фібробласти лінії NIH 3T3 та
нормальні кератиноцити людини лінії HaCaT, отримані з Людвігівського
інституту ракових досліджень (Уппсала, Швеція), трансформовані мишачі
фібробласти лінії L929, нормальні мишачі фібробласти лінії BALB 3T3 та
клітини епідермоїдної карциноми гортані людини лінії HEp-2, отримані з
Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Є.
Кавецького (Київ, Україна), а також клітини аденокарциноми легені людини
лінії А549, отримані з Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Росія).
Клітини вирощували в середовищі Ігла в модифікації Дульбекко (Sigma,
США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів корів (Sigma, США) у
СО2-інкубаторі при температурі 37(С, 5% концентрації СО2 та 100%
відносній вологості.

Макрофаги та клітини-мішені розділяли зі змішаних культур за допомогою
магнітних кульок, кон’югованих з антитілами до CD11b (Miltenyi Biotech),
що виявляється на поверхні макрофагів.

Для визначення життєздатності клітин in situ в змішаних культурах
макрофагів і клітин-мішеней використовували попереднє мічення клітин
ліпофільними барвниками PKH26 та PKH67. Життєздатність клітин визначали
за зміною проникності плазматичної мембрани, що проявлялася в
накопиченні барвника DAPI в ядрі, екстерналізацією фосфатидилсерину,
який зв’язується з анексином V, кон’югованим з
флуоресцеїнізотіоціанатом, падінням мітохондріального потенціалу, що
призводить до втрати гранулярного свічення родаміну 123. Фрагментацію
ДНК визначали методом, що базується на міченні 3′-OH-кінців фрагментів
ДНК нуклеотидом dUTP, кон’югованим із тетраметилродаміном, у реакції з
використанням екзогенної термінальної дезоксинуклеотидтрансферази. У
роботі використовували набір фірми Roche для визначення TUNEL (Terminal
Transferase dUTP Nick End Labeling). Крім того, розриви ДНК детектували
імуноензимним методом (набір фірми Roche), виявляючи фрагменти ДНК,
асоційовані з гістонами, а також за допомогою електрофоретичного аналізу
олігонуклеосомних фрагментів ДНК, ізольованої з клітин.

Вміст білків у лізатах клітин визначали методом Вестерн-блот-аналізу з
використанням антитіл до розщепленої форми каспази-3 та каспази-7 (Cell
Signaling, США), а також до в-актину (Sigma, США). Активність каспаз у
клітинних лізатах вимірювали за допомогою наборів для колориметричного
визначення Caspase-3/CPP32, FLICE/Caspase-8 та Caspase-9/Mch6
(BioVision, США). Метод ґрунтується на спектрофотометричній детекції
хромофора п-нітроаніліду після його відщеплення від міченого субстрату,
що містить специфічну амінокислотну послідовність.

Експресію генів у макрофагів, ізольованих з кокультур з
клітинами-мішенями, визначали за допомогою матриць, на які нанесено
фрагменти днк генів цитокінів та генів, пов’язаних із трансдукцією
сигналів у клітині (SuperArray, США). мРНК виділяли за допомогою
Trizol-реагенту (Gibco, США). Отриману в реакції зворотної транскрипції
радіоактивномічену кднк гібридизували із генспецифічними фрагментами
ДНК, нанесеними на мембрану. Після відмивання матриці експонували до
екрану фосфоріміджера (BioRad) 48 год. Отримані зображення аналізували
програмою Quantity One (BioRad) і GEArray Analyser (SuperArray).
Нормалізацію проводили відносно мРНК в-актину. Для підтвердження
результатів, отриманих цим методом, рівень мРНК визначали також за
допомогою електрофоретичного аналізу ампліфікованих продуктів реакції
зворотної транскрипції.

ДНК-зв’язувальну активність транскрипційного фактора NF-(B визначали за
сповільненням електрофоретичної рухливості специфічного фрагменту ДНК
при зв’язуванні з білком з екстрактів ядер клітин.

Вміст фактора некрозу пухлин-б визначали імуноензимним методом.

Концентрацію нітрит-іонів у середовищі культивування визначали методом
Гріса в модифікації Гріна (Green L. C. et al, 1982). Активність
NO-синтази визначали за окисненням Fe2+-міоглобіну в присутності та
відсутності інгібітора NO-синтази (Gross S. S., 1996).

Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили з
використанням критерію Стьюдента за допомогою комп’ютерної програми
Microsoft Excel 2003.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження здатності мишачих макрофагоподібних клітин лінії J774.2 до
фагоцитозу мікроорганізмів та продукції оксиду нітрогену (ІІ). Мишачі
макрофагоподібні клітини лінії J774.2 проявляють високу фагоцитарну
активність щодо дріжджів виду Debarіomyces hansenii (ВКМ Y-102). При
інкубації макрофагів з клітинами дріжджів у співвідношенні 1:5 вже через
30 хв спостерігається практично повне поглинання живих неопсонізованих
дріжджових клітин, а через 3 год – поглинання й у співвідношенні 1:50.
При цьому J774.2 макрофаги вбивають поглинуті дріжджові клітини, про що
свідчить зміщення максимуму емісії акридинового оранжевого із зеленої
області спектру в червону. У відповідь на стимуляцію ліпополісахаридом
(ЛПС), основним компонентом зовнішньої мембрани Грам-негативних
бактерій, J774.2 макрофаги продукують цитотоксичний агент окис
нітрогену, що було продемонстровано опосередковано через окиснення
Fe2+-міоглобіну в присутності та відсутності інгібітора NO-синтази та
накопичення в середовищі культивуваня нітрит-іонів, продуктів окиснення
короткоживучої сполуки окису нітрогену. Було виявлено, що преінкубація
протягом 4 год з бактеріальним ліпополісахаридом призводить до індукції
активності NO-синтази в макрофагів лінії J774.2. Інші речовини, зокрема,
зимозан А (компонент клітинної стінки дріжджів), аглютинін-1 з омели,
аглютинін зародків пшениці, трансформуючий фактор росту (-типу не мали
впливу на активність NO-синтази. Було виявлено зростання в 5,7 раза в
порівнянні з контролем концентрації нітритів у середовищі макрофагів,
культивованих протягом 24 год у присутності ЛПС у концентрації 10
мкг/мл. У 2,3 раза зросла концентрація нітритів у культуральному
середовищі макрофагів при дії (-амілоїдного пептиду в концентрації 0,5
мкг/мл. Не виявлено впливу на продукцію нітрит-іонів макрофагами інших
імуномодулюючих речовин, зокрема, форміл-Мет-Лей-Фен, брадикініну та
аглютиніну зародків пшениці.

Цитоморфологічна оцінка взаємодії макрофагів лінії J774.2 з
клітинами-мішенями. Kрім мікроорганізмів, як клітини-мішені для
макрофагів були використані й клітини ссавців. При дослідженні взаємодії
мишачих макрофагоподібних клітин лінії J774.2 з клітинами-мішенями
різного походження, що морфологічно відрізнялися від макрофагів, було
виявлено, що через 36 год спільного культивування макрофагів із
трансформованими мишачими фібробластами лінії L929, клітинами карциноми
гортані людини лінії HEp-2 та клітинами аденокарциноми легені людини
лінії A549 залишалася лише незначна кількість клітин-мішеней з
характерною для них морфологією. Виглядали неушкодженими після 36 год
кокультивування з макрофагами нормальні мишачі фібробласти ліній NIH 3T3
та BALB 3T3, а також нормальні людські кератиноцити лінії HaCaT. При
подальшому культивуванні ці клітини зберігали проліферативну активність,
що свідчить про їх нечутливість до цитотоксичної дії макрофагів.

Для з’ясування питання, який вплив на клітини-мішені матиме присутність
у кокультурі клітин з іншою чутливістю до цитотоксичної дії макрофагів,
як клітини-мішені для макрофагів лінії J774.2 були використані
трасформовані мишачі фібробласти лінії L929 та нормальні мишачі
фібробласти лінії NIH 3Т3. Усі три типи клітин відрізнялися за
морфологічними ознаками при фарбуванні акридиновим оранжевим та
флуоресцентноміченим фалоїдином, що зв’язується з F-актиновими
філаментами. Після 24 год кокультивування макрофагів з
клітинами-мішенями останні зберігали властиву їм морфологію. Через 36
год у змішаній культурі макрофагів із трасформованими мишачими
фібробластами лінії L929 практично не ідентифікувалися клітини з
фібробластоподібною морфологією. Були помітні об’єкти з порушенням
цілісності клітинної мембрани. Виглядали незміненими та неушкодженими
нормальні мишачі фібробласти лінії NIH 3Т3 в кокультурі з макрофагами.
При культивуванні макрофагів з обома типами клітин-мішеней усі клітини
зберігали інтактну морфологію. Ці дані можуть свідчити, що за
присутності в кокультурі нормальних мишачих фібробластів лінії NIH 3T3
макрофаги лінії J774.2 не проявляють цитотоксичної дії щодо
трансформованих мишачих фібробластів лінії L929.

Визначення життєздатності клітин у змішаних культурах макрофагів та
клітин-мішеней. Для з’ясування питання, чи макрофаги вбивають чутливі
клітини-мішені і чи морфологічно незмінені клітини дійсно залишаються
живими, було оцінено життєздатність клітин за специфічними параметрами,
розділяючи клітини із змішаних культур за допомогою імуномагнітних
кульок та дискримінуючи різні типи клітин у кокультурі з використанням
ліпофільних міток PKH 26 та PKH 67, які стабільно інтегруються в
мембрану, не впливаючи на клітинні функції та експресію поверхневих
маркерів і не перетікають спонтанно в інші клітини через щілинні
контакти. Це дозволяє тривалий час культивувати клітини, мічені цими
барвниками. Життєздатність клітин визначали за такими показниками як
проникність плазматичної мембрани та транслокація фосфатидилсерину на її
зовнішній бік, зміна мітохондріального потенціалу, фрагментація ДНК та
активація каспаз.

Використовуючи мічений флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) анексин V, який
зв’язується з фосфатидилсерином, та DAPI, що проникає в клітини з
пермеабілізованою мембраною і зв’язується з ДНК, ми визначали за
допомогою мікроскопа життєздатність клітин у змішаних культурах,
попередньо помітивши клітини одного типу барвником PKH 26. Співставляючи
флуоресценцію PKH 26 із флуоресценцією FITC та DAPI ми підраховували
кількість попередньо мічених клітин за певним розподілом флуоресценції
вищезгаданих барвників (Рис. 1).

Через 24 год спільного культивування макрофагів із трансформованими L929
фібробластами, 83% клітин-мішеней було зв’язано лише з анексином V, а
11% клітин лінії L929 мали ушкоджену мембрану, про що свідчить
проникнення в клітину барвника DAPI. Зв’язування з анексином V без зміни
проникності мембрани свідчить про екстерналізацію фосфатидилсерину, що є
характерною ознакою апоптозу. У фібробластів лінії NIH 3T3,
культивованих з макрофагами не виявлено транслокації фосфатидилсерину на
зовнішній бік мембрани, як і зміни її проникності. У спільній культурі
нормальних та трансформованих фібробластів із макрофагами не виявлено
суттєвого зростання кількості анексин V- та DAPI-позитивних клітин.

Іншим критерієм життєздатності клітин може бути гранулярне свічення
родаміну 123, продукту окиснення дигідрородаміну 123 в інтактних
мітохондріях. Слабе дифузне свічення родаміну 123 може бути наслідком
втрати мітохондріального потенціалу.

Через 24 год спільного культивування макрофагів із трансформованими
фібробластами лінії L929 спостерігалося зниження характерного
гранулярного флуоресцентного свічення родаміну 123 в цитоплазмі 81%
клітин-мішеней, що може свідчити про зниження мітохондріального
потенціалу й загибель клітин.

У кокультурі макрофагів з нормальними фібробластами та з обома типами
клітин-мішеней одночасно не виявлено суттєвого зменшення гранулярного
свічення родаміну 123.

Розриви ДНК у клітинах виявляли за флуоресценцією тетраметилродаміну,
кон’югованого з dUTP, який приєднується до вільних 3′-OH-кінців
фрагментів ДНК. Після 24 год кокультивування макрофагів лінії J774.2 з
клітинами-мішенями не спостерігалося включення міченого нуклеотиду в
реакції TUNEL, що свідчить про відсутність вільних OH’-кінців фрагментів
ДНК клітин-мішеней та клітин-ефекторів, тоді як на 30 год
кокультивування з макрофагами фрагментація ДНК спостерігалася в 75%
клітин лінії L929. За присутності нормальних фібробластів у кокультурі з
макрофагами кількість клітин лінії L929 з фрагментованою ДНК суттєво не
змінювалася порівняно з контролем.

Після певного часу культивування макрофагів лінії J774.2 з
клітинами-мішенями з кокультури виділяли макрофаги за допомогою
магнітних кульок, кон’югованих з антитілами до CD11b, і в лізатах
CD11b-позитивних та CD11b-негативних клітин детектували фрагментацію ДНК
та активацію каспаз-3, -7, -8, -9, цистеїнових протеаз, які відіграють
ключову роль в апоптичних процесах.

За допомогою імуноензимного аналізу не було виявлено характерних для
апоптозу асоційованих з гістонами фрагментів ДНК ні в макрофагів, ні у
фракціях клітин-мішеней після їх спільного культивування протягом 24
год. Використовуючи метод електрофоретичного аналізу фрагментів ДНК, ми
не виявили міжнуклеосомної фрагментації ДНК ні у виділених з кокультури
J774.2 макрофагів, ні у фібробластів ліній L929 та NIH 3T3. Після 30 год
кокультивування з макрофагами фрагментація ДНК виявлялася у фібробластів
лінії L929.

За допомогою антитіл, специфічних до активної форми каспази-3 та
каспази-7, показано експресію цих білків у трансформованих мишачих
фібробластах лінії L929, виділених з кокультури з J774.2 макрофагами
після 24 год спільного культивування (Рис. 2.). У нормальних мишачих
фібробластів лінії NIH 3T3, культивованих з макрофагами, не виявлено
активної форми каспази-3 та каспази-7. Активні форми цих білків не
виявлялися також у лізатах сумарної фракції клітин фібробластів ліній
L929 та NIH 3T3, виділеної з кокультури з J774.2 макрофагами.

Рис. 2. Експресія активної форми каспази-3 та каспази-7 у
клітинах-мішенях і макрофагах після 24 год культивування: 1 – макрофаги
лінії J774.2, культивовані окремо; 2 – фібробласти лінії L929,
культивовані окремо; 3 – фібробласти лінії NIH 3T3, культивовані окремо;
4 – макрофаги лінії J774.2, виділені з кокультури з фібробластами лінії
L929; 5 – макрофаги лінії J774.2, виділені з ко-культури з фібробластами
лінії NIH 3T3; 6 – макрофаги лінії J774.2, виділені з кокультури з
фібробластами ліній L929 та NIH 3T3; 7 – фібробласти лінії L929,
виділені з кокультури з макрофагами лінії J774.2; 8 – фібробласти лінії
NIH 3T3, виділені з ко-культури з макрофагами лінії J774.2; 9 –
фібробласти ліній L929 та NIH 3T3, виділені з кокультури з макрофагами
лінії J774.2.

Активація ефекторних каспаз -3 та -7 свідчить про індукцію макрофагами
апоптичних процесів у трансформованих мишачих фібробластів лінії L929.

Для з’ясування можливих механізмів індукції апоптозу ми визначали також
активність ініціаторних каспаз 8 і 9 та ефекторної каспази 3 за
екстинкцією хромофора, який відщеплюється від специфічних субстратів
активованими ензимами з лізатів клітин, виділених з кокультури.
Встановлено, що в трансформованих мишачих фібробластів лінії L929,
культивованих протягом 24 год з макрофагами, зростає активність каспаз
-3, -8, -9. У фібробластів лінії NIH 3T3, виділених з кокультури з
макрофагами, зростання активності каспаз не виявлено. У сумарній фракції
фібробластів ліній L929 та NIH 3T3, отриманій після ізолювання з
кокультури макрофагів, активність каспаз також не зростає. Як видно з
рис. 3, у фібробластів лінії L929 значне зростання активності каспази-8
та каспази-3

спостерігалося через 18 год кокультивування з макрофагами, в той час як
каспаза-9 ще не була активована. Ці дані можуть свідчити про
рецептор-опосередковану індукцію апоптозу макрофагами у фібробластів
лінії L929, оскільки виявлено, що спочатку активується каспаза-8.
Зростання активності каспази-9, яке спостерігається на 24 год, ймовірно
є наслідком активації каспаз -8 і -3.

Важливим підтвердженням життєздатності клітин, в яких не виявлено
маркерів апоптозу, є їх проліферативна активність. Клітини, які
перебували у змішаній культурі, розділяли за допомогою імуномагнітних
кульок, засівали на культуральний планшет і через певні проміжки часу
підраховували їх кількість. Кінетика росту свідчила про життєздатність
J774.2 макрофагів, виділених з усіх варіантів кокультур з
клітинами-мішенями, а також фібробластів лінії NIH 3T3 після
культивування з макрофагами. L929 фібробласти втрачають здатність до
проліферації через 24 год перебування в кокультурі з макрофагами. При
цьому зростає кількість клітин, які накопичують трипановий синій. Через
6 год кокультивування з макрофагами фібробласти лінії L929 ще зберігають
проліферативну активність, якщо їх виділити з кокультури. Це може
свідчити про те, що для індукції апоптичних процесів макрофагами у
клітин-мішеней потрібен тривалий час спільного культивування.
Проліферативна активність сумарної фракції фібробластів ліній L929 та
NIH 3T3, виділених з кокультури з макрофагами, дозволяє припускати, що
після кокультивування з макрофагами здатність до проліферації зберігають
клітини фібробластів двох ліній.

Вплив різних умов культивування на взаємодію макрофагів лінії J774.2 з
клітинами-мішенями. Виявлено, що висока цитотоксична активність мишачих
макрофагів лінії J774.2 проявляється вже при співвідношенні з
клітинами-мішенями як 1:2. При цьому лише близько 20 % клітин лінії
L929, культивованих протягом 36 год з макрофагами, мали властиву їм
фібробластоподібну морфологію. Навіть при співвідношенні макрофагів і
клітин лінії L929 як 1:4 та 1:8 макрофаги викликають пошкодження 52% та
30% клітин-мішеней відповідно. За присутності нормальних мишачих
фібробластів лінії NIH 3T3 в кокультурі трансформованих фібробластів
лінії L929 та макрофагів клітини-мішені були неушкодженими навіть при
кількісній перевазі макрофагів у кокультурі. При співвідношенні
макрофагів, L929 фібробластів та NIH 3T3 фібробластів як 8:2:1 лише 50%
клітин лінії L929 зберігають інтактну морфологію.

Для з’ясування ролі міжклітинних контактних взаємодій в індукції та
реалізації цитотоксичної відповіді макрофагів клітини в кокультурі
вирощували з використанням спеціальних мембран з діаметром пор 0,4 мкм,
що забезпечують обмін розчинними медіаторами, але не допускають
безпосереднього контакту між клітинами. Було виявлено, що J774. 2
макрофаги не проявляли цитотоксичний ефект на клітини лінії L929,
вирощені на мікропористій мембрані, тоді як при забезпеченні
безпосереднього контакту між макрофагами й L929 фібробластами, останні
зазнавали цитотоксичної дії макрофагів (Рис. 4.). Клітини лінії L929,
розділені мембраною від макрофагів, що перебувають у безпосередньому
контакті з тими ж L929 фібробластами, зазнавали цитотоксичного впливу
макрофагів, але меншою мірою, ніж при безпосередньому контакті. Це може
свідчити, що для індукції цитотоксичної відповіді макрофагів лінії
J774.2 щодо L929 фібробластів потрібний безпосередній контакт з
клітинами-мішенями, але принаймні частково цитотоксична дія J774. 2
макрофагів реалізується за участю розчинних медіаторів Нормальні мишачі
фібробласти лінії NIH 3T3, відділені мікропористою мембраною від J774.2
макрофагів, які безпосередньо контактують з клітинами лінії L929, не
мали впливу на цитотоксичну дію макрофагів щодо L929 фібробластів. За
наявності безпосереднього контакту NIH 3T3 фібробластів з макрофагами та
клітинами лінії L929 цитотоксична дія макрофагів не проявлялася (Рис.
4).

?

?

o

6p3/44

6

8

O

///eeeaNI1/4eeee°eeeee

`„

?????th????

???th??

?????th????

oooeeeoooaeaooooaoUooOAE

L774.2 в кокультурі з фібробластами лінії L929 із безпосереднім
контактом; 3 – макрофаги лінії J774.2 в кокультурі з фібробластами лінії
L929 за відсутності безпосереднього контакту; 4 – кокультура
фібробластів лінії L929 (на рис. представлена їх кількість), вирощених
на мікропористій мембрані, та макрофагів лінії J774.2, що безпосередньо
контактують з фібробластами лінії L929; 5 – кокультура фібробластів
лінії L929, що перебувають у безпосередньому контакті з макрофагами
лінії J774.2, та фібробластів лінії NIH 3T3, вирощених на мікропористій
мембрані; 6 – мікропористою мембраною розділені макрофаги лінії J774.2,
що перебувають у безпосередньому контакті з фібробластами лінії L929, та
макрофаги лінії J774.2, що безпосередньо контактують з фібробластами
лінії NIH 3T3; 7 – макрофаги лінії J774.2 у безпосередньому контакті з
фібробластами ліній L929 та NIH 3T3.

* – p(0,05, ** – p(0,001 відносно контролю.

Макрофаги можуть впізнавати змінений паттерн глікозилювання на поверхні
клітин-мішеней. Так макрофаги можуть здійснювати лізис пухлинних клітин,
впізнаючи їх за допомогою лектиноподібних рецепторів. Для з’ясування
можливих механізмів впізнавання клітин-мішеней мишачими
макрофагоподібними клітинами лінії J774.2 ми досліжували здатність
вуглеводів блокувати взаємодію макрофагів з клітинами-мішенями. Не
виявлено змін цитотоксичної активності макрофагів при додаванні
б-метил-D-манопіранозиду, 4-О-(б- D-галактопіранозил)-D-глюкопіранози та
N-ацетилгалактозаміну. Додавання б-D-манози в концентрації 10 мМ у
середовище культивування частково блокувало цитотоксичну дію J774.2
макрофагів щодо трансформованих мишачих фібробластів лінії L929, що
призводило до виживання 48% клітин в кокультурі з макрофагами порівняно
з 20% за відсутності б-D-манози. Збільшення концентрації б-D-манози в
середовищі до 100 мМ не впливало суттєво на цей показник.

Не спостерігалося змін у накопиченні нітрит-іонів, продуктів окиснення
оксиду нітрогену (ІІ), у середовищах культивування макрофагів і
клітин-мішеней. N(-нітро-L-аргінін, інгібітор NO-синтази, не мав впливу
на цитоксичну дію J774.2 макрофагів щодо трансформованих мишачих
фібробластів лінії L929. Рівень розчинного фактора некрозу пухлин б-типу
не змінюється в жодному з варіантів кокультур макрофагів з фібробластами
ліній L929 та NIH 3T3 і знаходився на межі чутливості детекції.

Експресія генів цитокінів та генів, пов’язаних із трансдукцією сигналів,
у макрофагів, ізольованих з кокультури з клітинами-мішенями. Для
виявлення можливих змін у клітинах після кокультивування ми
використовували метод ДНК-матриць, який дозволяє оцінити рівень мРНК
багатьох генів одночасно. У макрофагах лінії J774.2, які були виділені з
кокультури з клітинами-мішенями, було досліджено експресію генів
цитокінів та генів, пов’язаних із трансдукцією регуляторних сигналів у
клітині (Рис. 5).

Рис. 5. Профілі експресії генів цитокінів (А) та генів, пов’язаних з
шляхами трансдукції сигналів (Б): 1 – мишачі макрофаги лінії J774.2; 2 –
мишачі макрофаги лінії J774.2, виділені з кокультури з трансформованими
мишачими фібробластами лінії L929; 3 – мишачі макрофаги лінії J774.2,
виділені з кокультури з нормальними мишачими фібробластами лінії NIH
3T3; 4 – мишачі макрофаги лінії J774.2, виділені з кокультури з
клітинами ліній NIH 3T3 та L929.

Макрофаги кокультивували з трансформованими мишачими фібробластами лінії
L929 та нормальними мишачими фібробластами лінії NIH 3T3 протягом 24
год, після чого клітини розділяли за допомогою імуномагнітних кульок.
Дослідження паттерну експресії мРНК проводили у фракції клітин, що
зв’язалися з імуномагнітними кульками.

У роботі аналізувалися гени, рівень експресії мРНК яких змінювався в 2 і
більше разів. Серед генів цитокінів найбільш виражені зміни відбувалися
в експресії мРНК інтерлейкіну-1( (IL-1() (Рис. 6 A). Кокультивування з
трансформованими мишачими фібробластами лінії L929 призводило до
значного зростання експресії мРНК IL-1( у J774.2 макрофагів. У
культивованих окремо макрофагів мРНК IL-1( не виявлено. У макрофагів,
виділених з кокультури з нормальними мишачими фібробластами лінії NIH
3T3, експресія мРНК IL-1( була нижча в 2 рази порівняно з макрофагами,
культивованими з фібробластами лінії L929. В кокультурі з обома типами
клітин-мішеней рівень експресії мРНК IL-1( в макрофагів був у 2,6 раза
нижчий, ніж в кокультурі лише з L929 фібробластами.

IL-1( – це прозапальний цитокін, який продукується активованими
макрофагами, для нього була показана цитотоксична та цитостатична дії.
Він також діє синергічно та аддитивно з фактором некрозу пухлин-( в
кілінгу пухлинних клітин. Експресія гена цього цитокіна є зниженою в
пухлиноасоційованих макрофагів, які сприяють пухлинному росту. Ефект
IL-1( на ріст пухлин in vivo є неоднозначним. Залежно від концентрації
та мікрооточення IL-1( може сприяти васкуляризації пухлин та їх
метастазуванню, з іншого боку, він володіє високою цитотоксичною
активністю (Akira S. et al, 1990). Ймовірно, що цитотоксична дія
макрофагів на клітини лінії L929 опосередковується серед інших можливих
факторів IL-1(.

Значні зміни було виявлено в експресії мРНК р105, попередника
транскрипційного фактора NF(B, який регулює експресію генів прозапальних
білків. При кокультивуванні з клітинами лінії L929 виявлено зростання
рівня мРНК р105 в макрофагів у 2,6 раза і при кокультивуванні з NIH 3T3
фібробластами – в 1,6 раза порівняно з контролем. У культурі з обома
типами мішеней спостерігалося незначне зниження експресії цієї мРНК (в
1,25 раза порівняно з контролем), цей рівень був у 3,3 раза меншим, ніж
в макрофагів у кокультурі лише з L929 фібробластами (Рис. 6 Б). NF-(B у
цитоплазмі клітин перебуває в неактивній формі та зв’язаний з
інгібіторним білком I(B (Hayden M. et al, 2006). Окрім збільшення рівня
експресії мРНК р105 в макрофагах при кокультивуванні з клітинами лінії
L929, було виявлено практично повну відсутність експресії мРНК б-ланцюга
інгібіторного білка I(B у макрофагів в кокультурі з L929 фібробластами
та зростання його експресії в кокультурі з клітинами лінії NIH 3T3 (в
4,4 раза порівняно з контролем) і в кокультурі з обома типами
клітин-мішеней (в 2,3 раза) (рис. 6 В). Можливо, такі зміни в експресії
прозапального транскрипційного фактора NF-(B та білка, що регулює його
активність, впливають на цитотоксичну активність макрофагів.

У кокультурі з клітинами лінії L929 спостерігали зниження експресії
макрофагами мРНК СD5-антигена в 6 разів порівняно з контролем, а при
кокультивуванні з NIH 3T3 фібробластами та з двома типами клітин-мішеней
одночасно рівень експресії цього гена не змінювався вірогідно порівняно
з контролем (Рис. 6 Г). CD5-антиген характерний, в основному, для
Т-лімфоцитів і виявлений також в одній із субпопуляцій В-клітин і в
макрофагах. Вважається, що з СD5+ В-клітин може походити
лінія клітин з рецепторами, характерними для макрофагів (Takahashi K.
еt al, 1998).

Виявлено зростання експресії мРНК gadd45 у макрофагів, кокультивованих з
фібробластами лінії L929, в 11 разів порівняно з контролем, тоді як у
випадку кокультивування макрофагів з клітинами лінії NIH 3T3 або з NIH
3T3 та L929 фібробластами одночасно рівень цього транскрипту практично
не змінювався (Рис. 6 Д). Gadd45 – це білок, експресія якого індукується
під впливом пошкоджень ДНК та зупинки клітинного росту р53-залежним або
незалежним шляхами (Jackson J. et al, 2006).

Для підтвердження результатів, отриманих методом ДНК-матриць, нами було
використано інший метод. РНК, виділена з тих же зразків, піддавалась
реакції зворотної транскрипції з використанням оліго-dT-праймерів.
Отримані з допомогою цієї реакції кднк ампліфікували з використанням
специфічних праймерів у ланцюговій полімеразній реакції. Продукти
реакції піддавались електрофоретичному аналізу, що дозволяло оцінити
довжину транскрипту та його відносну кількість за допомогою
денситометричного аналізу електрофоретичних смуг та нормалізації
отриманих результатів до рівня транскрипції гена в-актину. Було виявлено
незначний рівень експресії мРНК IL-1( в макрофагів лінії J774.2,
культивованих окремо, в той час як методом ДНК-матриць цей транскрипт не
детектувався в даному зразку. Високий рівень експресії IL-1(
спостерігався в макрофагів, ізольованих з кокультури з трансформованими
мишачими фібробластами лінії L929. Він був у 2,5 раза вищий, ніж у
макрофагів, культивованих з нормальними мишачими фібробластами лінії NIH
3T3, та у 3,7 раза вищий, ніж у макрофагів, кокультивованих одночасно з
фібробластами ліній NIH 3T3 і L929. Рівень мРНК
р105-попередника транскрипційного фактора NF(B у макрофагів, виділених з
кокультури з фібробластами лінії L929, був у 2,1 раза вищий, ніж у
макрофагів, культивованих окремо, та не змінювався суттєво порівняно з
контролем у макрофагів, культивованих з фібробластами лінії NIH 3T3 та з
обома типами клітин мішеней одночасно. Рівень мРНК б-ланцюга
інгібіторного білка I(B у макрофагів, культивованих з фібробластами
лінії L929, був у 3,3 раза нижчий, ніж у макрофагів, культивованих
окремо. У макрофагів, ізольованих з кокультури з фібробластами лінії NIH
3T3 та обома типами клітин-мішеней, експресія б-ланцюга I(B зростала в 4
та 2,8 раза відповідно порівняно з контролем (макрофаги, культивовані
окремо).

У 5 разів порівняно з контролем знижувався рівень мРНК СD5-антигена в
макрофагів, культивованих з фібробластами лінії L929, та істотно не
змінювався в інших варіантах кокультур макрофагів з клітинами-мішенями.

У макрофагів, культивованих з трансформованими фібробластами лінії L929,
рівень мРНК GADD45 зростав у 9 разів, порівняно з контролем і не
змінювався суттєво в макрофагів, виділених з кокультури з NIH 3T3
фібробластами та з кокультури з обома типами клітин-мішеней одночасно.

Таким чином, результати отримані методом ДНК-матриць, в цілому
узгоджуються з результатами електрофоретичного аналізу продуктів
ланцюгової полімеразної реакції. Для гібридизації з генспецифічними
фрагментами ДНК, нанесеними на матриці, використовувалися не
ампліфіковані транскрипти. Цим, можливо, й пояснюється те, що на
ДНК-матрицях у деяких зразках взагалі не детектувалися мРНК IL-1( та
б-ланцюга I(B, тоді як невисокий рівень цих транскриптів виявлявся на
електрофореграмах ампліфікованих продуктів реакції зворотної
транскрипції. Отже, зміни в експресії генів у 2 і більше разів, які
виявлялися методом ДНК-матриць, були підтверджені й за допомогою
зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції з наступним
електрофоретичним аналізом продуктів.

ДНК-зв’язувальна активність транскрипційного фактора NF-(B у макрофагів,
ізольованих з кокультури з клітинами-мішенями. Транскрипційний фактор
NF-(B є потужним медіатором імунної відповіді. У цитоплазмі димери NF-(B
зв’язані з інгібіторним білком I(B, який при стимуляції клітин певними
сигналами піддається фосфорилюванню й наступному убіквітинілюванню й
деградації в протеасомах. Активний, незв’язаний з інгібіторним білком

NF-(B транслокується в ядро, де він регулює експресію специфічних генів.
Ймовірно, його активація в макрофагів може мати місце при їх взаємодії з
клітинами-мішенями. За допомогою тесту сповільнення електрофоретичної
рухливості специфічного дволанцюгового фрагменту ДНК при зв’язуванні з
NF-(B із екстрактів ядер макрофагів було виявлено значне зростання
ДНК-зв’язувальної активності NF(B у макрофагів, культивованих з
клітинами лінії L929, щодо яких вони проявляли цитотоксичну дію. У
макрофагів, ізольованих із кокультури з нормальними мишачими
фібробластами лінії NIH 3T3, не спостерігалося суттєвого підвищення
ДНК-зв’язувальної активності NF-(B (Рис. 7). Такий же рівень зв’язування
з ДНК був у цього транскрипційного фактора в ядерних екстрактах
макрофагів, культивованих одночасно з фібробластами ліній L929 та NIH
3T3.

Результати експериментів із додаванням радіоактивноміченого
олігонуклеотиду з точковою мутацією, а також 50-кратного надлишку
неміченого консенсусного та мутантного олігонуклеотидів свідчать про
високу специфічність ДНК-зв’язувальної реакції саме для NF-(B (Рис. 7).

Транскрипційний фактор NF-(B – це білковий димер, який складається з
кількох субодиниць, серед яких p65 та p50. Для встановлення складу
димерів було використано антитіла до субодиниць p65 та p50, які додавали
до ядерних екстрактів та специфічного олігонуклеотиду. Антитіла до p50
сповільнювали електрофоретичну рухливість комплексів, які відповідають
верхній та нижній електрофоретичним смугам (Рис. 7). Антитіла до p65
сповільнювали рухливість лише комплексу з верхньої смуги. Це дозволяє
стверджувати, що комплекс, який відповідає верхній електрофоретичній
смузі – це гетеродимер p65/p50, а комплекс із нижньої смуги – це
гомодимер p50/p50.

Отже, активація NF-(B відбувається у J774.2 макрофагів, культивованих з
клітинами-мішенями, до яких вони проявляють цитотоксичну дію.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведено дослідження взаємодії макрофагів лінії
J774.2 з клітинами-мішенями різного походження. Показано інгібувальний
вплив нечутливих клітин-мішеней на цитотоксичну дію макрофагів.
Досліджено експресію генів у макрофагів, ізольованих із кокультури з
клітинами-мішенями, чутливими та нечутливими до їх цитотоксичної дії.

Показано цитотоксичну дію макрофагів лінії J774.2 щодо трансформованих
фібробластів лінії L929, що проявляється в транслокації фосфатидилсерину
на зовнішній бік плазматичної мембрани, падінні мітохондріального
потенціалу, фрагментації ДНК, активації каспаз -3, -7, -8, -9.

Виявлено інгібувальний вплив нормальних мишачих фібробластів NIH 3T3 на
цитотоксичну дію мишачих макрофагоподібних клітин лінії J774.2 щодо
трансформованих мишачих фібробластів лінії L929.

Встановлено, що цитотоксична дія макрофагів щодо клітин лінії L929
індукується при безпосередньому контакті клітин-мішеней та ефекторів, а
реалізується цитотоксичний ефект через розчинні медіатори та при
безпосередньому контакті клітин.

Показано, що макрофаги лінії J774.2 індукують апоптоз у трансформованих
мишачих фібробластів лінії L929 за рецептор-залежним механізмом, що
призводить до активації каспази-8.

Виявлено індукцію експресії мРНК інтерлейкіну-1в в макрофагах, виділених
з кокультур з клітинами-мішенями, причому в макрофагів, культивованих з
клітинами лінії L929, рівень мРНК інтерлейкіну-1в був у 2 рази вищий,
ніж у макрофагів, культивованих з клітинами лінії NIH 3T3, і у 2,6 раза
вищий, ніж при культивуванні з двома типами клітин-мішеней одночасно.

Рівень мРНК р105, попередника транскрипційного фактора NF-кB, зростав у
2,6 раза порівняно з контролем у макрофагах, культивованих з L929
фібробластами, в 1,6 раза при культивуванні з NIH 3T3 фібробластами і
практично не змінювався в макрофагах, культивованих з обома типами
клітин-мішеней. Рівень мРНК б-ланцюга IкB зростав у макрофагів у
кокультурі з клітинами лінії NIH 3T3 (в 4,4 раза порівняно з контролем)
і в кокультурі з обома мішенями (в 2,3 раза) та практично не виявлявся в
макрофагів, культивованих з клітинами лінії L929.

Показано зростання рівня мРНК gadd45 у макрофагах, культивованих з L929
фібробластами, в 11 разів порівняно з контролем. Рівень мРНК цього гена
практично не змінювався в макрофагах, культивованих з NIH 3T3
фібробластами та з двома типами клітин-мішеней. У макрофагів лінії
J774.2 при культивуванні з фібробластами лінії L929 у 6 разів порівняно
з контролем знижувався рівень мРНК СD5-антигена, який практично не
змінювався в інших варіантах кокультур.

Зміни в експресії вищезгаданих генів, які виявлялися методом ДНК-

матриць, були підтверджені й за допомогою зворотної транскрипції
та полімеразної

ланцюгової реакції з наступним електрофоретичним аналізом
продуктів.

У макрофагів, культивованих з клітинами-мішенями, чутливими до їх
цитотоксичної дії, зростає ДНК-зв’язувальна активність транскрипційного
фактора NF-(B.

Публікації

Кащак Н.І., Ключівська О.Ю., Стойка Р.С. Індукція лектинами омели
цитотоксичності у макрофагів щодо пухлинних клітин // Експер. клін.
фізіол. біохім. – 2001. – No 1. – C. 22-24. (Дисертант провела
експериментальні дослідження, проаналізувала результати та літературні
дані, брала участь в оформленні результатів та написанні статті)

HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&T
ermToSearch=11433191&ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pub
med_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum” Stoika R., Kashchak N.,
Lutsik-Kordovsky M., Boyko M., Tsyrulnyk A. In vitro response of
phagocytic cells to immunomodulating agents // Med. Sci. Monit. – 2001.
– Vol. 7, No 4. – P. 652-658. (Дисертант провела дослідження впливу
імуномодулюючих агентів на активність NO-синтази в макрофагів лінії
J774.2, провела пошук та аналіз даних літератури, брала участь в аналізі
результатів та написанні статті).

HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&T
ermToSearch=12512702&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pub
med_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum” Stoika R.S, Lutsik M.D, Barska M.L,
Tsyrulnyk A.A, Kashchak N.I. In vitro studies of activation of
phagocytic cells by bioactive peptides // J. Physiol. Pharmacol. – 2002.
– Vol. 53, No 4. – P. 675-688. (Дисертант провела дослідження впливу
біологічно активних пептидів на продукцію нітрит-іонів макрофагами лінії
J774.2, провела пошук та аналіз даних літератури, брала участь в аналізі
результатів та написанні статті).

HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&T
ermToSearch=15763498&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pub
med_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum” Kashchak N., Tsaryk R., Stoika R.
Bystander effect of normal fibroblasts for macrophages co-cultured with
susceptible transformed target cells // Cell Biol. Int. – 2005. – Vol.
29, No 1. – P. 41-50. (Дисертант провела експериментальні дослідження та
їх статистичну обробку, проаналізувала результати та літературні дані,
оформила результати досліджень та брала участь у написанні статті )

Кащак Н.І., Стойка Р.С. Дослідження міжклітинних взаємодій у змішаних
культурах макрофагів лінії J774.2 та фібробластів ліній L929 та NIH3T3:
оцінка життєздатності клітин in situ за допомогою флуоресцентної
мікроскопії // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. –
2007. – Т. 43. – С. 106-110. (Дисертант провела експериментальні
дослідження та їх статистичну обробку, проаналізувала результати та дані
літератури, підготувала статтю до друку).

Кащак Н.І., Стойка Р.С. ДНК-зв’язувальна активність транскрипційного
фактора NF-(B у макрофагів лінії J774.2, культивованих з
клітинами-мішенями, чутливими та нечутливими до їх цитотоксичної дії //
Клін. експ. патол. – 2007. – Т. 6, No 1. – С. 143-145. (Дисертант
провела експериментальні дослідження та їх статистичну обробку,
проаналізувала результати та літературні дані, підготувала статтю до
друку).

Kashchak N., Klyuchivska O. Induction of macrophage cytotoxicity against
tumour cells by mistletoe lectins // Proc. of conf. “The macrophage
2000. Mononuclear phagocytes in basic and clinical immunology”. –
Krakow, Poland – 21-22 september, 2000. – C. 43.

Kashchak N., Klyuchivska O., Stoika R. Mistletoe lectins and bacterial
lipopolisaсcharides induce cytotoxic action of macrophages towards
co-cultured tumour cells // Proc. of 3rd Parnas Conf. Mechanisms of
cellular signal transduction and communication. – Lviv. – 14-16 October,
2000. – P. 140.

Kashchak N., Tsaryk R., Stoika R. Effect of bystander cells on the
expression of genes coding for cytokines and signal transduction
elements in macrophages co-cultured with susceptible transformed target
cells // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної
біології. – Львів. – 25-28 квітня, 2004. – С. 357.

Stoika R.S., Kashchak N.I. Approaches for study of macrophage-target
cell interactions // Proc. of 29th FEBS Meeting. – Warsaw. – 26 June-1
July, 2004. – P. 83.

Стойка Р.С., Кащак Н.І. Вплив фібробластів на цитотоксичну дію
макрофагів щодо трансформованих клітин: цитоморфологічне і
молекулярно-біологічне дослідження // Матеріали науково-практичної
конференції “Гістологія на сучасному етапі розвитку науки”, Тернопіль. –
12-13 жовтня, 2004. – C. 64.

Kashchak N.I., Tsaryk R.V. Bystander effect of normal fibroblasts for
macrophages co-cultured with susceptible transformed target cells //
Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків. – 24-27 жовтня,
– 2006. – C. 63.

анотація

Кащак Н.І. Механізми взаємодії мишачих макрофагоподібних клітин лінії
J774.2 з клітинами-мішенями. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. –
Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертація присвячена вивченню механізмів взаємодії макрофагів лінії
J774.2 з клітинами-мішенями різного походження.

Показано цитотоксичну дію макрофагів лінії J774.2 щодо трансформованих
фібробластів лінії L929, що проявляється в транслокації фосфатидилсерину
на зовнішній бік плазматичної мембрани, падінні мітохондріального
потенціалу, фрагментації ДНК, активації каспаз -3, -7, -8, -9.

Нормальні мишачі фібробласти NIH 3T3 нечутливі до дії макрофагів і
блокують цитотоксичний ефект останніх щодо фібробластів лінії L929.

За допомогою ДНК-матриць та методу електрофоретичного аналізу
ампліфікованих продуктів реакції зворотної транскрипції досліджено
експресію генів цитокінів та генів, пов’язаних із трансдукцією сигналів
у клітині. Виявлено зміни рівня мРНК інтерлейкіну-1в, p105-попередника
транскрипційного фактора NF-кB, GADD45, транскрипту, що індукується у
відповідь на пошкодження ДНК та зупинку клітинного циклу, та зниження
рівня мРНК інгібіторного білка IкB, що зв’язуються з NF-кB, та антигена
CD5 у макрофагів лінії J774.2, виділених з кокультури з трансформованими
фібробластами ліні L929, порівняно з макрофагами, культивованими окремо,
а також з нормальними мишачими фібробластами лінії NIH 3T3 та з обома
типами клітин-мішеней одночасно.

У макрофагів, культивованих з клітинами-мішенями, чутливими до їх
цитотоксичної дії виявлено зростання ДНК-зв’язувальної активності
транскрипційного фактора NF-(B.

Ключові слова: макрофаги, клітини-мішені, апоптоз, каспази, ДНК-матриці,
NF-кB, IкB, IL-1в, GADD45, CD5.

Аннотация

Кащак Н.И. Механизмы взаимодействия мышиных макрофагоподобных клеток
линии J774.2 с клетками-мишенями. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук
по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. –
Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.

Диссертация посвящена изучению механизмов взаимодействия макрофагов
линии J774.2 с клетками-мишенями разного происхождения.

Показано цитотоксическое действие макрофагов на трансформированные
мышиные фибробласты линии L929, которое проявляется в транслокации
фосфатидилсерина на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны, падении
митохондриального потенциала, фрагментации ДНК, активации каспаз 3, 7,
8, 9.

Нормальные мышиные фибробласты линии NIH 3T3 нечувствительны к действию
макрофагов и блокируют цитотоксический эффект последних к фибробластам
линии L929.

С помощью ДНК-матриц и метода электрофоретического анализа
амплифицированных продуктов реакции обратной транскрипции исследовано
экспрессию генов цитокинов и генов, связанных с трансдукцией сигналов в
клетке. Выявлено изменения уровня мРНК интерлейкина-1в,
транскрипционного фактора NF-кB, ингибиторного белка кB, который
связывается с NF-кB, GADD45, транскрипта, который индуцируется в ответ
на повреждение ДНК или остановку клеточного цикла и CD5-антигена у
макрофагов, выделенных из кокультуры с трансформированными фибробластами
линии L929, по сравнению с макрофагами, культивированными отдельно, а
также с нормальними мышиными фибробластами линии NIH 3T3 и с двумя
типами клеток-мишеней одновременно.

У макрофагов, культивированных с клетками-мишенями, чувствительными к их
цитотоксическому действию, виявлено увеличение ДНК-связывающей
активности NF(B.

Ключевые слова: макрофаги, клетки-мишени, апоптоз, каспазы,
ДНК-матрицы, NF-кB, IкB, IL-1в, GADD45, CD5.

Summary

Kashchak N.I. Mechanisms of murine macrophage like cell line J774.2
interaction with target cells. – Manuscript.

Thesis for Ph. D. scientific degree on cytology, cell biology,
histology 03.00.11, Institute of Cell Biology of the NAS of Ukraine,
Lviv, 2007.

Dissertation is devoted to a study of the mechanisms of J774.2
macrophages interaction with target cells of different origin.

Murine macrophage cells (J774.2 line) were shown to exert significant
cytoxicity towards cocultured transformed murine fibroblast cell line
L929, human lung adenocarcinoma cell line A549 and human larynx
carcinoma cell line HEp-2, but not against normal mouse fibroblasts (NIH
3T3 and BALB 3T3 lines) or normal human keratinocyte cell line HaCaT. We
have shown that bystander fibroblasts NIH 3T3 were not only resistant to
murine macrophages J774.2 but also blocked their killing action towards
murine transformed fibroblasts L929.

Using PKH membrane dyes for discrimination of different cell types, we
have estimated cell viability in mixed cultures of J774.2 macrophages
and fibroblast cell lines L929 and NIH 3T3 by means of fluorescent dyes
which allow to detect membrane integrity, phosphatidyl serine
externalization, decrease in mitochondrial potential and DNA
fragmentation.

Activation of caspase-8 and caspase-3 before activation of caspase-9
allows to suggest receptor-mediated induction of apoptosis in target
cells by macrophages.

Macrophages were isolated from mixed cultures by means of CD11b specific
immunomagnetic beads. DNA array technology was applied as a tool to
search for candidate genes (coding for cytokines and for signal
transduction pathway elements) whose expression in macrophages may be
modulated by the target cells.

It was found that in macrophages cocultured with susceptible
transformed target cells a significant increase in mRNA coding for
IL-1(, NF-(B, and growth arrest and DNA damage inducible transcript
(GADD45) occurred, while a decrease in I(B and CD5 mRNA levels was
observed. Bystander NIH 3T3 fibroblasts abolished these changes in the
J774.2 macrophages, and the level of expression of the above mentioned
genes was close to the level seen in the macrophages which did not exert
cytotoxicity towards the target fibroblasts. These data were also
verified using RT-PCR method.

Electrophoretic mobility shift assay has been used to show that
DNA-binding activity of transcriptional factor NF-(B increases in J774.2
macrophages cocultured with transformed fibroblast cell line L929
towards which macrophages exert cytotoxic action. In the presence of
normal NIH 3T3 fibroblasts, macrophages do not express cytotoxicity and
significant changes in DNA-binding activity of NF-(B.

Key words: macrophages, target cells, apoptosis, caspases, DNA arrays,
NF-(B, ІкB, IL-1в, GADD45, CD5.

Підписано до друку 4.10.2007

Формат 60х90/16. Папір офсетний. Ум. друк. арк. 1,0

Наклад 100 прим. Зам. № 43

м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16 к. 3

ПП. “Арк-сервіс”, тел. 261 13 80

Рис. 1. Розподіл клітин, мічених PKH 26, за флуоресценцією, зумовленою
анексином V-FITC та DAPI:

1 – анексин V (–), DAPI (–);

2 – анексин V (+), DAPI (–);

3 – анексин V (+), DAPI (+).

Рис. 3. Спектрофотометричне визначення активності каспаз у лізатах
фібробластів лінії L929, виділених з кокультури з макрофагами лінії
J774.2. * –p(0,05 (відносно контролю (0 год)).

Рис. 6. Експресія генів, рівень мРНК яких змінювався більше ніж удвічі:1
– мишачі макрофаги лінії J774.2; 2 – мишачі макрофаги лінії J774.2,
виділені з кокультури з трансформованими мишачими фібробластами лінії
L929; 3 – мишачі макрофаги лінії J774.2, виділені з кокультури з
нормальними мишачими фібробластами лінії NIH 3T3; 4 – мишачі макрофаги
лінії J774.2, виділені з кокультури з клітинами ліній NIH 3T3 та L929.

Рис. 7. Комплекси NF(B-специфічного фрагменту ДНК з ядерними білковими
екстрактами макрофагів лінії J774.2, культивованих з клітинами-мішенями:
I – макрофаги лінії J774.2, культивовані окремо; II– макрофаги лінії
J774.2 в кокультурі з клітинами лінії L929; III– макрофаги лінії J774.2
в кокультурі з клітинами лінії NIH3T3; IV– макрофаги лінії J774.2 в
кокультурі з клітинами ліній L929 та NIH3T3; 1 – реакційна суміш без
антитіл; 2 – до реакційної суміші додано антитіла до р50; 3 – до
реакційної суміші додано антитіла до p65; 4 – до реакційної суміші
додано неспецифічний IgG; 5, 6, 7, 8 – контролі специфічності реакції
зв’язування ДНК із білками з ядерного екстракту макрофагів, ізольованих
із кокультури з клітинами лінії L929: 5 – мічений консенсусний
олігонуклеотид; 6 – мічений консенсусний олігонуклеотид та 50-кратний
надлишок неміченого консенсусного олігонуклеотиду; 7 – мічений
консенсусний олігонуклеотид та 50-кратний надлишок неміченого мутантного
олігонуклеотиду; 8 – мічений мутантний олігонуклеотид.

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020