.

Поєднані форми внутрішньоутробних інфекцій: патогенез акушерських і перинатальних ускладнень та їх профілактика (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
111 2557
Скачать документ

НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРIОБIОЛОГIЇ I КРIОМЕДИЦИНИ

КОФАНОВА ОЛЬГА ОЛЕКСІЇВНА

УДК 57.043:577.352.3:547.426

Модифiкацiя функціональноъ активностй СА2+-атфази i
мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитiв пiд впливом глiцерину та
крiоконсервування

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків–2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бабійчук Любов
Олександрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
завідувач відділу кріоцитології та кількісної морфології

Офіційні опоненти|:

Доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківська
державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії та
біохімії

Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Нікітченко Юрій
Вікторович, Науково-дослідний інститут біології Харківського
Національного Університету ім. В.Н. Каразіна МОН України, завідувач
відділу біофізики мембран

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет, кафедра біохімії, МОЗ
України, м.Харків

Захист відбудеться 03.07.2007р. о 13-30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України за адресою: вул. Переяславська, 23, м.Харків,
61015

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: вул. Переяславська,
23, м.Харків, 61015

Автореферат розісланий 01.06.2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України
А.М.Гольцев

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Існуючі на цей час концепції й гіпотези
кріопошкоджень по-різному трактують механізм дії фізико-хімічних
факторів і процесів у руйнуванні структур біооб’єкта при
заморожуванні-відігріванні [Meryman H.T. et al., 1971; Mazur P. et al.,
1975; Pegg D.E. et al., 1988]. Дослідження механізмів кріозахисту
базуються на уявленні про те, що кріобіологічні системи є надзвичайно
складними композиціями, у яких фізико-хімічні процеси тісно пов’язані з
біологічними, і закономірності їхньої кореляції вивчені недостатньо.
Останнім часом, з’явилася низка робіт, присвячених вивченню біологічної
стабілізації конформації білків та мембранних структур різними
кріопротекторами в умовах дегідратації при заморожуванні-відігріванні
або висушуванні. [Crowe J.H. et al, 1993; Xie G. et al., 1997]. Успішне
вирішення проблеми низькотемпературного консервування неможливе без
вивчення молекулярних механізмів модифікації різних клітинних структур
під впливом низьких температур і кріопротекторів різного типу дії.
Аналіз модифікації структурно-функціонального стану плазматичної
мембрани і цитоскелета еритроцитів під впливом гліцерину, що є
ефективним кріопротектором для даного типу клітин [Аграненко В.А. и др.,
1980], може сприяти більш глибокому розумінню ролі цих змін у регуляції
стійкості клітин до стресових факторів кріоконсервування. Особливе
значення у контролюванні біохімічних процесів у клітині в стресових
умовах мають іони кальція, месенджерна функція якого охоплює практично
усі фізіологічні системи [Левицкий Д.О., 1990].

В еритроцитах людини єдиним механізмом, що забезпечує підтримку низької
концентрації Са2+ у цитоплазмі, є Ca2+-АТФаза [Carafoli E. et al.,
1999]. Дослідження змін її функціональної активності в процесі
кріоконсервування є важливим моментом у розумінні механізмів виживання
клітин і збереженні ними структурної цілісності після
заморожування-відігрівання. У вітчизняних і закордонних дослідженнях
[Кузьмина Л.Н., 1991; Alves G.G. et al., 2001] приділялась певна увага
вивченню модифікації даної іонтранспортуючої системи під впливом
кріопротектора й низьких температур, однак, був відсутній системний
підхід до рішення даної проблеми. Зокрема регуляторний аспект активності
Са2+-АТФази і зміна рівня цитозольного Са2+ в умовах кріоконсервування
дотепер практично не вивчені.

Зміна структурних характеристик плазматичної мембрани, зокрема
трансмембранної асиметрії ліпідів під впливом кріопротекторів і низьких
температур, може бути важливим сигналом метаболічних перебудов, які
відбуваються в клітинах. Аналіз модифікуючого впливу фізико-хімічних
факторів на асиметрію ліпідного бішару показав, що фліп-флоп може
регулюватися зміною параметрів середовища [Cullis P.R. et al., 1986.].
Разом з тим, вплив кріопротекторів і процесів заморожування-відігрівання
біологічних об’єктів на розподіл фосфоліпідів у мембрані та динаміку
фліп-флоп досліджено недостатньо. У зв’язку із цим, вивчення асиметрії
ліпідного бішару й ролі Са2+-залежних процесів у регуляції даного
структурного параметра в умовах кріоконсервування може бути актуальним
напрямком кріобіологічних досліджень.

Останнім часом усе більше уваги приділяється дослідженню змін структур
цитоскелету, індукованих кріопротекторами і різними фізико-хімічними
факторами, що супроводжують заморожування-відігрівання клітин [Бабийчук
Л.А. и др., 1994; Westh P., 2004]. Модифікація білок-білкових взаємодій
у цитоскелетній сітці, а також взаємодій цитоскелета з плазматичною
мембраною під впливом кріопротекторів можуть бути вирішальними
факторами, які впливають на стабільність клітин у стресових умовах, у
тому числі в процесі кріоконсервування [Chang B.S. et al., 1996;
Singbartl K. et al., 1998]. Тому, вивчення особливостей змін у
мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів під впливом гліцерину і
низьких температур, а також визначення ролі Са2+ у цих процесах можуть
бути істотним внеском у розуміння механізмів трансформації даних
структур при зміні параметрів зовнішнього середовища та сприяти розробці
й удосконаленню методів довгострокового зберігання крові.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі кріоцитології і
кількісної морфології в рамках теми №2.2.6.14 “Вивчення молекулярних
механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і
цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом
температурно-осмотичних ефектів і кріопротекторів різного механізму
дії”, № держреєстрації 0104UО06436.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – оцінити модифікацію
фукціональної активності Ca2+-АТФази і рівень вільного цитозольного Са2+
в еритроцитах людини під впливом гліцерину і низьких температур, а також
оцінити Са2+-залежні перебудови трансмембранного розподілу
фосфатидилсерину в ліпідному бішарі та білок-білкових взаємодій у
мембрано-цитоскелетному комплексі, що індуковані даним кріопротектором і
кріоконсервуванням.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Вивчити зміни функціональної активності Са2+-насосу еритроцитів на
різних експериментальних моделях (сапонін-перфорованих клітинах та
ізольованих мембранних фракціях) під впливом наростаючих концентрацій
гліцерину та оцінити роль кальмодуліну в регуляції каталітичної реакції
в даних умовах.

2. Дослідити вплив кріоконсервування і розчинів з високою іонною силою
на роботу Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах – моделі
найбільш близької до нативної клітини.

3. Оцінити зміни рівня вільного цитозольного Са2+ в еритроцитах під
впливом гліцерину і низькотемпературного консервування клітин.

4. Дослідити роль позаклітинного Са2+ і АТФ-азних реакцій у модифікації
асиметричного розподілу фосфатидилсерину під впливом гліцерину і низьких
температур.

5. Вивчити Са2+-залежні перебудови білок-білкових взаємодій
мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину і
низьких температур.

Об’єкт дослідження. Процеси Са2+-залежної модифікації
структурно-функціональних параметрів плазматичної мембрани та
цитоскелета еритроцитів людини в умовах кріоконсервування з
використанням гліцерину.

Предмет дослідження. Модифікація каталітичної активності Са2+-насоса,
білків мембрано-цитоскелетного комплексу і трансмембранного розподілу
фосфатидилсерину в еритроцитах під впливом гліцерину і
кріоконсервування.

Методи дослідження: біохімічні, спектрофотометричні, а також методи
флуоресцентної мікроскопії, проточної цитофлуориметрії та електрофорезу
в поліакриламідному гелі (ПААГ).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показано, що модифікація
активності Са2+-АТФази сапонін-перфорованих еритроцитів під впливом
наростаючих концентрацій гліцерину має біфазний характер. Аналіз ролі
ендогенних модуляторів з використанням інгібітора кальмодулін-залежних
реакцій показав, що активація Са2+-АТФази, яка відмічається в
присутності 10%-го гліцерину, реалізується тільки у присутності
кальмодуліну. Також уперше було відзначено, що активність даного
ферменту в еритроцитах, кріоконсервованих під захистом гліцерину,
пригнічується після розморожування, а після дегліцеринізації
кріоконсервованих клітин підвищується. Новими є результати, які
свідчать, що рівень цитозольного Са2+ в еритроцитах під впливом
гліцерину збільшується. У кріоконсервованих клітинах після
дегліцеринізації рівень Са2+ ще більш зростає в порівнянні з умовами
інкубації в присутності гліцерину. Уперше встановлено факт слабкого
впливу гліцерину і низьких температур на зміну асиметричного розподілу
фосфатидилсерину в плазматичній мембрані еритроцитів протягом короткого
періоду часу. Отримано нові дані про те, що під впливом гліцерину і
кріоконсервування можуть відбуватися Са2+-індуковані перебудови в
мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені в роботі дослідження
змін функціональної активності Са2+-АТФази та рівня вільного
цитозольного Са2+, що свідчать про можливу роль Са2+- індукованих
метаболічних перебудов у зміні стійкості еритроцитів, можуть бути
використані при розробці нових технологій кріоконсервування біообґєктів.
Встановлені закономірності перебудов плазматичної мембрани та
мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом гліцерину
можуть бути використані для порівняльного аналізу змін у даних
структурах під впливом різних фізико-хімічних факторів при розробці й
удосконаленні способів довгострокового зберігання еритроцитів.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно
здійснено аналіз даних літератури, отримано результати експериментальних
досліджень, проведено їхню статистичну обробку. Автором особисто
проведено первинний аналіз даних і сформульовано попередні висновки.
Разом із науковим керівником автором визначені мета, задачі дослідження
та засоби їх вирішення, інтерпретовано отримані результати та зроблено
остаточні висновки. В опублікованих із співавторами працях особистий
внесок здобувача полягає:

у роботах [1-3,5-9,14,15,17-19] у проведенні досліджень функціональної
активності Са2+-АТФази та аналізі отриманих результатів;

у роботі [10] у вивченні рівня цитозольного Са2+ в еритроцитах;

у роботах [11,12,21] у проведенні досліджень асиметричного розподілу
фосфатидилсерину та аналізі отриманих результатів;

у роботах [4,16,20] у проведенні досліджень функціональної активності
Са2+-АТФази на сапонін-перфорованих та білих тінях еритроцитів у
присутності гліцерину, участі в обговоренні результатів;

у роботах [13,22] у вивченні Са2+-залежних перебудов білок-білкових
взаємодій мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом
гліцерину і низьких температур.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися та обговорювалися на установчому з’їзді Українського
товариства клітинної біології (Львів, 2004), науково-практичній
конференції молодих вчених “Досягнення молодих вчених – майбутнє
медицини” (Харків, 2004), Першій Міжнародній конференції студентів і
аспірантів (Львів, 2005), 5й Парнасівській Конференції “Molecular
mechanіsms of cellular sіgnalіng” (Київ, 2005), міжнародній
науково-практичній конференції “Дни науки 2005” (Дніпропетровськ, 2005),
міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”
(Пущино, 2005), міжнародній науково-практичній конференції “Гематологія
і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання” (Київ, 2005),
межвузівській конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”
(Харків, 2006), Другій Міжнародній конференції студентів і аспірантів
(Львів, 2006), всеукраїнській науково-технічній конференції “Физика.
Биофизика-2006” (Севастополь, 2006), Пущинській школі-конференції
“Биология-наука XXI века” (Пущино, 2006), ІV Міжнародному симпозіумі
“Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології”
(Київ,2006), конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та
біотехнології–2006” (Київ, 2006), Сьомому з’їзді Білоруського
суспільного об’єднання фотобіологів і біофізиків “Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем” (Мінськ,
2006), науково-практичній конференції молодих вчених “Досягнення молодих
вчених – майбутнє медицини” (Харків, 2006), ІX Українському біохімічному
з’їзді (Харків, 2006), ІІ міжнародному симпозіумі “Гемостаз – проблемы и
перспективы” (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 статей, з яких 5 –
у наукових фахових виданнях і 8 – в збірниках матеріалів наукових
конференцій, та 9 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 165 сторінках
друкованого тексту, з яких 134 сторінки основного тексту. Дисертація
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення
результатів дослідження, висновків, переліку використаної літератури
(235 першоджерел, розміщено на 23 сторінках) і додатка (на 4 сторінках).
Робота ілюстрована 25 рисунками і 3 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМЙСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на еритроцитах ІІ(А) групи донорської крові
чоловіків, заготовленої на консерванті “Глюгіцир”, з терміном збереження
при температурі 2-4 ?С протягом 2-4 діб.

Гліцеринізацію еритроцитів здійснювали додаванням розчину
кріоконсерванта (30% гліцерин, 4% манітол, 150 мМ NaCl, 10 мМ тріс-HCl,
pН 7,4) у співвідношенні 1:1 за об’ємом [Аграненко В.А. и др., 1980] і в
сталевих контейнерах занурювали в рідкий азот (-196 єС). Для
експериментів з дослідження активності Са2+-АТФази до складу
кріоконсерванта не додавали манітол. Розморожування еритроцитів
проводилося у водяній бані з температурою 42 єС. Для видалення
кріопротектора проводили триразове відмивання еритроцитів відповідно до
стандартних методик [Семенова Н.Ф. и др., 1986; Sumida S. et al., 1999].

Рівень гемолізу в надосадовій рідині визначали спектрофотометрично на
довжині хвилі 543 нм [Дервиз Г.В. и др., 1966].

Гематокрит визначали в капілярах на мікроцентрифузі МГЦ-8 (Польща).

Для визначення активності Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих еритроцитах
клітини вносили в реакційне середовище, яке містило задані концентрації
Са2+, Mg2+, ЕГТА, ATФ та сапоніну. Склад середовища варіювали,
додатковим уведенням різних концентрацій гліцерину (5-60%), або NaCl
(150-600мМ), або KCl (150-600мМ). Реакцію ферментативного гідролізу АТФ
відслідковували, витримуючи клітини при 37 ?С протягом 20 хвилин
[Покудин Н.И. и др., 1988]. Зміну активності Са2+-АТФази оцінювали за
різницею накопичення фосфору неорганічного Pі в Са2+-утримуючих і
Са2+-неутримуючих середовищах. Визначення Pі проводили
спектрофотометричним методом (“Ломо СФ-46”, Росія) на довжині хвилі 660
нм [Rathbum W. et al., 1969]. Питому активність Са2+-АТФази еритроцитів
розраховували на 109 клітин.

Для оцінки активності Са2+-АТФази в білих тінях виділення мембран
еритроцитів проводили гіпотонічним шоком [Fairbanks G. et al., 1971].
Отримані ізольовані мембранні фракції додавали в реакційне середовище та
стежили за ферментативною реакцією в умовах аналогічних, описаних для
сапонін-перфорованих еритроцитів.

Для оцінки ролі кальмодуліну в активації Са2+-АТФази еритроцитів у
присутності 10%-го гліцерину в середовищі застосовували інгібітор
кальмодулін-залежних реакцій кальмідозоліум R24571 [Рыбина В.В. и др.,
2001]. Зміну активності Са2+-АТФази оцінювали за різницею накопичення
Pі, як описано вище.

Концентрацію білка визначали спектрофотометрично за методом Бредфорда
[Bradford M.M., 1976] на довжині хвилі 595 нм.

Рівень вільного Са2+ у цитоплазмі еритроцитів оцінювали за допомогою
флуоресцентного зонда Fluo-4 [Schnetkamp P.P. et al.,1991; Kaestner L.
et al., 2006] на флуоресцентному мікроскопі Nіkon (Японія) при лex=488
нм, лem=516 нм.

Дослідження асиметричного розподілу фосфатидилсерину в мембрані
еритроцитів були проведені на проточному цитометрі FACS Calіbur (Becton
Dіckіnson, США) з використанням набору Annexіn V-FІTC detectіon KІТ І
(Becton Dіckіnson, США).

Для електрофоретичного аналізу білків в ПААГ одержували білі тіні шляхом
гіпотонічного лізису [Fairbanks G. et al., 1971] з додаванням інгібітору
протеаз (РМSF, 1 мг/моль). В підсумку в склад гіпотонічних середовищ
було включено: 1 – 10-3 М MgCl2, 10-3 M CaCl2; 2 – 2 мМ ЕДТА; 3 – 10-3 М
MgCl2, 10-3 M CaCl2, 5% гліцерин; 4 – 2 мМ ЕДТА, 5% гліцерин.

Електрофорез тіней еритроцитів виконували у вертикальних пластинах
SDS-ПААГ із градієнтом пористості (5-20)Т4С за системою Лемлі [Fairbanks
G. et al., 1971; Остерман Л.А., 1981]. Для визначення молекулярної маси
білків використовували маркери фірми Fluka. Відносний вміст білків
різних фракцій на доріжці SDS-ПААГ оцінювали на денситометрі DM2120
(“Solar”, Білорусь). Результати обробляли за допомогою програми для
персонального комп’ютера Scіon Іmage.

Отримані результати статистично обробляли за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення

Модифікація середовища і різних клітинних структур під впливом гліцерину
створює умови, що забезпечують збереження еритроцитів у процесі
кріоконсервування. Аналіз змін структурно-функціональних параметрів
мембрано-цитоскелетного комплексу (МЦК) під впливом гліцерину сприяє
розумінню більш тонких механізмів виживання клітин за екстремальних
впливів зовнішнього середовища. Динаміку насичення клітин гліцерином і
зміну активності Са2+-АТФази в ході цього процесу можна змоделювати
дослідженням швидкості ферментативної реакції в середовищах з різними
концентраціями кріопротектора.

У роботі були вивчені зміни функціональної активності Са2+-АТФази
еритроцитів під впливом гліцерину з використанням різних
експериментальних моделей – сапонін-перфорованих клітин та ізольованих
мембранних фракцій (білих тіней). На моделі сапонін-перфорованих клітин
(рис.1А) у присутності ендогенних регуляторів було показано, що невеликі
концентрації гліцерину стимулюють ферментативну активність Са2+-насоса,
досягаючи максимального ефекту при 10%-му вмісті кріопротектора, після
чого його активуюча дія знижується.

Рис.1. Вплив гліцерину на активність Са2+-АТФази в сапонін-перфорованих
(А) та білих тінях еритроцитів (Б); *р® ? O Oe ¬ ® Oe ’ Ue TH a a

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020