.

Антиоксидантний статус печінки перепела за умов впливу нітратів та додаванні в комбікорм зерна амаранту (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
150 3228
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Чубар Ольга Миколаївна

УДК 577.151:612.35:639.124:549.751:582.661.21

Антиоксидантний статус печінки перепела за умов впливу нітратів та
додаванні в комбікорм зерна амаранту

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі органічної і біологічної хімії
Білоцерківського державного аграрного університету Міністерства аграрної
політики України

Науковий керівник – доктор сільськогосподарських наук, професор

Цехмістренко Світлана Іванівна,

Білоцерківський державний аграрний університет,

завідувач кафедри органічної і біологічної хімії,

проректор факультету заочної освіти

Офіційні опоненти – доктор сільськогосподарських наук, професор

Бородай Віталій Петрович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри птахівництва

доктор сільськогосподарських наук, професор

Кирилів Ярослав Іванович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького,
завідувач кафедри технології виробництва продукції дрібних тварин,
проректор з наукової роботи

Провідна установа – Інститут біології тварин УААН, лабораторія
фізіолого-біохімічних основ живлення птиці, м. Львів

Захист відбудеться “03” листопада 2006 р. о 12 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному
університеті за адресою: 03041 м. Київ-41, вул. Героїв оборони 15,
навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного
університету за адресою: 03041 м. Київ-41, вул. Героїв оборони 13,
навчальний корпус № 4, кімната 28

Автореферат розісланий “21” вересня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Калінін І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток нетрадиційних для нашої країни галузей,
зокрема, перепелівництва, є одним із головних шляхів розширення
асортименту та підвищення економічної ефективності птахівництва
(Якименко І.Л., 2000; Бородай В.П. та ін. 2002). Перепелів завдяки їх
біологічним особливостям, крім вирощування для виробництва яєць та м’яса
(Пигарева М.Д., 1989; Кроик Л., 1992; Гущин В., 2003), використовують
для лабораторних досліджень.

Інтенсивні технології утримання сільськогосподарської птиці та
забруднення навколишнього середовища токсикантами, зокрема азотовмісними
речовинами (Zhang Xiu Lan, 2000; Хмельницький Г.О., 2001; Новожицька Ю.,
2002; Гунчак В.М., 2005), є сильним стресовим чинником, що призводить до
розвитку гіпоксичних станів, дестабілізації метаболічних процесів,
зокрема пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) (Барабой В.А., 1991; Hogg
N., 1995; Глебова Л.Ю., 1998; Chen P., 2001; Фіра Л.С., 2003), і як
наслідок ? зниження м’ясної та яєчної продуктивності. Ефективно
корегувати ПОЛ антиоксидантними препаратами можна лише з урахуванням
вікових особливостей функціонування антиоксидантної системи (АОС)
(Калитка В.В., 1995; Кучмістрова О.Ф., 1998; Цехмістренко С.І., 1999;
Ратич І.Б., 2006).

Науково обґрунтоване використання кормових добавок у годівлі птиці
позитивно впливає на продуктивність, оплату корму, відтворювальну
функцію, харчову і біологічну цінність одержуваної продукції (Іонов
І.А., 1997; Мироник О.В., 1999; Triantaphyllou K., 2001; Кирилів Я.І.
та ін., 2002). Широкого розповсюдження за кордоном, в нашій країні
меншою мірою, набуло вирощування та використання в годівлі тварин зерна
амаранту (Yue S.,1990; Гіска В.В., 1998; Гопцій Т.І., 1999; Гніцевич
В.А., 2002). При цьому такий напрямок досліджень має ширше значення для
виявлення модифікуючого впливу амаранту на метаболізм в умовах стресу
(Мельник О.І., 2002; Коник У.В., 2003; Гжегоцький М.Р. та ін., 2004).
Головна цінність цієї рослини полягає у наявності значної кількості
біологічно активних речовин (Ахмед-Заде А.Ш., 1991; Yanez E., 1994),
вітамінів (А, Е та С), каротиноїдів, мікро- і макроелементів,
флавоноїдів, дубильних речовин, сквалену (Димчин А.М., 1997; Gregori S.
et al., 1999; He Han-Ping, 2002), повноцінного білка (Тарасова Є.В.,
1997).

Дані літератури не дають однозначних висновків про стан антиоксидантної
системи печінки перепела в онтогенезі за умов оксидативного стресу,
спричиненого впливом на організм різних ксенобіотиків, зокрема нітратів.
Відсутні дані про вплив зерна амаранту у складі комбікорму на
метаболічні процеси при стресах. Вирішення цих питань допоможе зрозуміти
біохімічні аспекти токсичного впливу нітратів на антиоксидантну систему
і сприятиме розробці оптимальних варіантів ефективної профілактики та
корекції токсичних уражень організму. Наведені вище аргументи зумовлюють
актуальність, своєчасність і доцільність проведення відповідних
експериментальних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася згідно з планом науково-дослідних робіт
Білоцерківського державного аграрного університету за темою: „Вплив
фізико-хімічних факторів на біохімічні показники органів та тканин птиці
та її продуктивність” (державний реєстраційний номер № 0103U004477 від
19.05.2003).

Метою роботи було з’ясування закономірностей перебігу пероксидного
окиснення ліпідів та функціонування антиоксидантної системи печінки
перепела у віковому аспекті за умов впливу нітрату натрію та при
додаванні зерна амаранту в комбікорм.

Для досягнення мети досліджень сформульовані наступні завдання:

дослідити інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів, особливості
функціонування ферментативної та неферментативної ланок антиоксидантної
системи печінки перепела за період від першої до 70-ї доби життя;

оцінити ступінь розвитку гемічної гіпоксії та функціональний стан
печінки за активністю амінотрансфераз та лужної фосфатази за умов
тривалого впливу (протягом 70-ти діб) нітрату натрію;

дослідити інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів та функціональний
стан системи антиоксидантного захисту печінки перепела за умов впливу
нітрату натрію;

вивчити вплив добавки зерна амаранту у складі комбікормів на
інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів та функціональний стан
антиоксидантної системи печінки перепела;

дослідити вплив добавки зерна амаранту у складі комбікормів на вміст
каротиноїдів, жиророзчинних вітамінів А та Е у жовтку перепелиних яєць;

провести ветеринарно-санітарну експертизу м’яса перепела на залишковий
вміст нітрат- та нітрит-іонів, токсичність та поживність;

вивчити вплив добавки зерна амаранту у складі комбікормів на
інтенсивність росту та збереженість поголів’я.

Об’єкт дослідження ? інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів та
функціональний стан антиоксидантної системи печінки перепела у віковому
аспекті (до 70-денного віку), за умов впливу нітрату натрію та при
застосуванні зерна амаранту у складі комбікорму.

Предмет дослідження – показники пероксидного окиснення ліпідів та
антиоксидантної системи печінки перепела.

Методи дослідження – при виконанні роботи використані біохімічні
(спектрофотометричні), гематологічні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані експериментальні дані
розширили існуючі уявлення про патогенетичні ланки розвитку
оксидативного стресу, зокрема, за умов впливу нітратів, що відкриває
перспективи для розробки методів цілеспрямованої профілактики та
корекції токсикозів. Встановлено, що гемічна гіпоксія супроводжується
підвищенням інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів, зниженням
функціональної активності антиоксидантної системи та порушенням
дезінтоксикаційної функції печінки, проявом якої в цьому випадку є
зростання активності амінотрансфераз та лужної фосфатази.

Доведено, що добавка зерна амаранту в комбікорм (10%), за рахунок
відновлення активності ферментів та накопичення неферментативних
компонентів антиоксидантної системи знижує ступінь розвитку гемічної
гіпоксії та сприяє нормалізації процесів ліпопероксидації.

Практичне значення одержаних результатів. Оцінка інтенсивності
окиснювальних процесів у печінці з урахуванням віку перспективна в плані
підвищення надійності діагностики та контролю за ефективністю корекції
патологічних процесів, що супроводжуються гіпоксичними станами.
Згодовування зерна амаранту у складі комбікормів за рахунок підвищення
антиоксидантного статусу печінки знижує інтенсивність пероксидного
окиснення ліпідів, що відкриває нові можливості для використання його з
метою профілактики і корекції токсикозів та при оксидативному стресі.
Добавка зерна амаранту до складу комбікорму сприяє накопиченню каротину,
вітамінів А і Е у жовтку перепелиних яєць, підвищенню середньодобових
приростів та збереженості поголів’я, що сприятиме зростанню економічної
ефективності та рентабельності перепелівництва.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження є самостійною
роботою автора, яка виконана під науковим керівництвом професора,
доктора сільськогосподарських наук Цехмістренко С.І. Відповідно до
поставленої мети і завдань дисертантом самостійно здійснено підбір і
аналіз літератури за темою, проведено біохімічні дослідження,
статистично оброблені та проаналізовані одержані результати,
сформульовані основні положення і висновки дисертаційних досліджень.
Разом із співавторами підготовлені рукописи опублікованих статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися: на 5-й Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of
cellular signaling” (Київ, 2005), Міжнародній науково-практичній
конференції „Стан, проблеми та перспективи сучасної аграрної науки і
практики” (Львів, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції
„Стан і перспективи розвитку переробної галузі АПК” (Мелітополь, 2005),
Міжнародній науково-практичній конференції „Сучасні проблеми біохімії,
фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин”
(Дніпропетровськ, 2005), I Міжнародній науково-практичній конференції
„Екотрофологія. Сучасні проблеми” (Біла Церква, 2005), Міжнародній
науково-виробничій конференції „Проблеми екології ветеринарної медицини
Житомирщини” (Житомир, 2005), науково-практичній конференції „Проблеми
становлення галузі тваринництва в сучасних умовах” (Вінниця, 2005),
Міжнародному з’їзді терапевтів, діагностів „Актуальные проблемы
патологии животных” (Барнаул, 2005), IV та V державних наукових
конференціях аспірантів і докторантів „Наукові пошуки молоді у третьому
тисячолітті” (Біла Церква, 2005, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано

13 робіт, з них 8 статей у фахових виданнях та 4 – у матеріалах
конференцій,

1 методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з
розділів: вступ, огляд літератури, матеріал та методи досліджень,
результати власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів
досліджень, висновки, список використаної літератури, додатки. Робота
викладена на 134 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 42
таблицями та 11-а рисунками. Список використаної літератури включає 357
найменувань, у тому числі – 83 зарубіжних авторів.

основний зміст роботи

Огляд літератури. Проведено теоретичний аналіз літератури щодо
особливостей функціонування антиоксидантної системи організму тварин у
віковому аспекті та при дії патогенних чинників. Узагальнено основні
відомості щодо хімічного складу, механізму біологічного впливу та
практичного застосування амаранту у сільському господарстві та медицині.

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені
на перепелах породи фараон, м’ясного напрямку продуктивності

1–70-добового віку, яких утримували в умовах віварію.

У першому досліді вивчали інтенсивність ПОЛ та особливості
функціонування АОС печінки перепела від народження до встановлення
інтенсивної яйцекладки, за умов впливу нітрату натрію та при додаванні
зерна амаранту в комбікорм. Із добового молодняку сформували чотири
групи птиці по 100 голів. Птиця 1-ї групи слугувала контролем та моделлю
для вивчення ПОЛ та антиоксидантного статусу печінки перепела у віковому
аспекті, згодовували основний комбікорм (ОК). Із метою моделювання
експериментального оксидативного стресу птиці 2-ї групи з 3-ї до 70-ї
доби досліджень із водою випоювали нітрат натрію в дозі 0,5 г/кг маси
тіла за NO3Ї/кг (Хмельницький Г.О., 2001), згодовували ОК. Перепелам 3-ї
(на фоні впливу нітрату натрію) та 4-ї груп у складі комбікорму згідно з
даними літератури (Хомин М.М., 1995; Гніцевич В.А., 2002) згодовували
зерно амаранту. Використовували амарант сорту „Ультра” – Amaranthus
Hybridus (Гопцій Т.І., 1998). При заміні 10% зернових компонентів ОК на
10% зерна амаранту не викликало будь-яких істотних змін у загальній
поживності комбікорму.

Для проведення біохімічних досліджень матеріал відбирали у одно-, 7-,
14-, 21-, 28-, 35-, 42-, 49-, 56-, 63-, 70-добовому віці, в один і той
же час для виключення добових коливань фізіолого-біохімічних параметрів.
Кров і печінку відбирали зразу після декапітації під легким ефірним
наркозом. З метою оцінки гіпоксії досліджували вміст гемоглобіну та
метгемоглобіну у стабілізованій крові ціанметгемоглобіновим методом
(Горячковский А.М., 1989). Печінку подрібнювали в гомогенаторі
Поттера-Елвехейма з тефлоновим товкачиком. До 100 мг гомогенату печінки
додавали 6 мл фізіологічного розчину, центрифугували (3000 об/хв). З
метою дослідження інтенсивності процесів ліпопероксидації у гомогенатах
печінки визначали вміст загальних ліпідів (ЗЛ) (Knight G.A., 1972),
продуктів ПОЛ за вмістом дієнових кон’югатів (ДК) (Стальная И.Д., 1997),
гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) (Романова Л.А., Стальная И.Д., 1997),
ТБК-активних продуктів (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1997).
Функціональний стан антиоксидантної системи печінки оцінювали за
активністю супероксиддисмутази (СОД) (Чевари С., 1985), каталази (КАТ)
(Королюк М.А., 1988), глутатіонпероксидази (ГПО) (Моин В.М., 1986),
глутатіонредуктази (ГР) (Юсупова Л.Б., 1990) та за вмістом відновленого
глутатіону (GSH) (Горячковский О.М., 1998), SH-груп (Ореховича В.Н,
1977), церулоплазміну (ЦП) (Ravin H.A.. 1961), каротину та вітамінів А
(Левченко В.И., 1991), Е (Антонова Б.И., 1991). Функціональний стан
печінки оцінювали за активністю амінотрансфераз (АсАТ і АлАТ) та лужної
фосфатази (ЛФ) з використанням стандартних наборів реактивів.

З метою виробничої перевірки результатів науково-дослідної роботи на
базі приватного підприємства „АІПЕР” було проведено господарський дослід
та сформовано дві групи птиці по 200 голів. Перепелам 1-ї групи
згодували основний комбікорм. Птиці 2-ї групи з комбікормом згодовували
зерно амаранту. Під час проведення досліду вивчали вплив добавки зерна
амаранту в комбікорм на якість м’яса за поживністю, токсичністю (Шаблий
В.Я., 1983), залишковим вмістом нітрат- та нітрит-іонів (Хмельницький
Г.О., 2001); якість яєць оцінювали за вмістом у жовтку каротиноїдів,
жиророзчинних вітамінів А (Левченко В.И., 1991) та Е (Антонова Б.И.,
1991). Щотижня проводили зважування 15 голів перепелів із кожної групи
та контроль за збереженістю поголів’я. Для визначення вірогідних
відмінностей між середніми величинами використовували t-критерій
Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вікова динаміка показників пероксидного окиснення ліпідів та
антиоксидантної системи печінки перепела. Проведені дослідження
свідчать, що печінка добових перепелят характеризується високим вмістом
загальних ліпідів (табл. 1) як основного субстрату пероксидації та
максимальним вмістом дієнових кон’югатів, що забезпечує можливість
швидкої перебудови мембран у відповідності до „програми вікового
розвитку”.

Таблиця 1

Вміст загальних ліпідів та продуктів пероксидного окиснення ліпідів у
печінці перепела (M±m; n=5)

Вік, доба Загальні ліпіди, мг/г Дієнові кон’югати, ум.од./г
Гідропероксиди ліпідів, ум.од./г ТБК-активні продукти, мкмоль/г

1 4,79±0,33 6,96±0,16 19,15±0,82 9,86±0,63

7 2,64±0,19* 2,50±0,10* 16,71±0,61* 13,15±0,91*

14 1,80±0,08* 2,65±0,11 21,22±0,48* 11,43±0,86

21 2,20±0,19 2,92±0,18 21,90±0,75 13,47±0,55

28 1,83±0,13 3,22±0,07 19,73±0,54* 15,48±0,63*

35 2,79±0,22* 3,45±0,10 17,22±0,79* 12,20±0,98*

42 3,19±0,18 3,47±0,17 17,98±1,03 12,88±0,83

49 2,48±0,19* 2,19±0,17* 17,25±0,68 15,73±1,09*

56 2,4±0,17 2,33±0,07 15,25±0,46* 16,15±0,55

63 2,24±0,13 2,08±0,15 15,17±1,12 18,47±0,83*

70 1,92±0,08 2,54±0,07* 16,94±0,96 17,65±0,94*

Примітка. Тут і надалі різниця вірогідна: * р”Oe dha$ dh`„7a$ dh`„7a$ –Oe6 ? ae ae e oooocUUUEooU?¶????E „\ dh^„\ dh^„? dh`„7a$ 2„2 4”5O6(8B9iaaaUOAEAEAE¶¶AE®FFFFF & ooeeeeeOOeeeIeeeeeAAe & ?? ooae+?kdµ ?? ooae+?kdS ?? ?? ?? ?? ?? ?????? ?c ?? ?? ?c ?? ?c ?c ?? ?? ?c ?? ?c ?c ?? ?? ?c a$ Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y За умов тканинної гіпоксії та у відповідь на збільшення кількості ДК у печінці перепела 2-ї групи зростає активність СОД (рис. 3, а) на 7-у та 14-у добу (у 1,8 та 1,4 рази відповідно до показників інтактної птиці). Пригнічення активності каталази (рис. 3, б) у період від 7-ї до 35-ї доби, з максимумом на 21-у добу (на 26,7%) спричиняє зниження активності супероксиддисмутази на 21-у добу (на 21,3%). Однією із причин зниження активності каталази може бути деградація вільних та зв’язаних з мембранами ендоплазматичної сітки рибосом, які відповідають за синтез ферменту (Глебова Л.Ю., 1998). Значні концентрації H2O2 та органічних гідропероксидів, що знешкоджуються глутатіонпероксидазою, а також пригнічення активності глутатіонредуктази, призвели до зниження вмісту відновленого глутатіону на 35-у та 49-у добу (у 1,6 раза). При застосуванні зерна амаранту у складі комбікорму у печінці перепела 3-ї групи зросла активність СОД, з максимумом на 21 і 56-у добу (у 1,6 та 1,7 рази, відповідно проти показників 2-ї групи) та КАТ на 21-у добу (на 23,2%). Підвищення ферментативної активності ГР сприяло накопиченню вміст GSH у печінці на 21-, 35-, 49-, 56- та 70-у добу (на 34%; 35,6; 28,0; 31,0; 20,4% відповідно). а б Рис. 3 Відносна активність супероксиддисмутази та каталази у печінці перепела за умов впливу нітрату натрію та при додаванні в комбікорм зерна амаранту Вплив NaNO3 спричинив зниження вмісту вітамінів: каротиноїдів (рис. 4, а) на 28-у добу (у 3,3 раза проти показників інтактної птиці), вітаміну А на 42-у добу (на 27%), вітаміну Е (рис. 4, б) на 21-у добу (у 1,8 раза). Вміст каротину корелює із вмістом ТБК-активних продуктів (r = -0,65), а ретинолу – із вмістом ГПЛ (r = -0,79). а б Рис. 4. Відносний вміст каротину та вітаміну Е у печінці перепела за умов впливу нітрату натрію та при додаванні в комбікорм зерна амаранту Враховуючи унікальний склад вітамінів у зерні амаранту, мг%: каротиноїдів – 0,19; токоферолу – 0,77; тіаміну – 0,08–0,24; рибофлавіну – 0,01–0,27; нікотинової кислоти – 1,0; біотину – 42,5–51,3 і фолієвої кислоти – 42,1–43,8 (Yanez E., 1994; Гопцій Т.І., 1999), вміст вітамінів у печінці перепела 3-ї групи зростав. Максимальне накопичення каротину відмічено на 56-у та 63-ю добу (на 64,7 та 63,0% відповідно до показників 2-ї групи), вітаміну Е – на 14-, 21- та 63-ю добу (у 1,7–1,8 рази). За умов тривалого впливу нітратів, внаслідок порушення дезінтоксикаційної функції печінки, розвивається ендогенна інтоксикація, одним із критеріїв якої є визначення активності амінотрансфераз та лужної фосфатази (Мазуркевич А.Й., 2001; Гунчак В.М., 2005). У печінці перепелів 2-ї групи відмічено підвищення активності АсАТ (табл. 5), з максимумом на 21-у добу (на 20,6% проти показників інтактної птиці), АлАТ – на 28-у добу (на 35%), ЛФ – на 42-у добу (на 31,6%), що вказує на зміну проникності мембран і вихід ферментів у позаклітинний простір (Гуфрій Д.Ф., 1997). Тривале згодовування зерна амаранту у складі комбікорму на фоні впливу NaNO3 утримувало активність амінотрансфераз та ЛФ у межах показників інтактної птиці. Таблиця 5 Активність амінотрансфераз печінки перепела за умов впливу нітрату натрію та при додаванні в комбікорм зерна амаранту (мкмоль/год·г; M±m; n=5) Вік, доба Аспартатамінотрансфераза Аланінамінотрансфераза 1-а група 2-а група 3-я група 1-а група 2-а група 3-я група 7 63,0±0,8* 62,0±1,3 61,3±1,7 15,4±1,2 17,0±1,0 14,7±0,8 14 50,6±1,3* 55,3±1,1*№ 53,3±1,6* 10,5±0,6* 13,5±0,4*№ 11,8±1,0 21 48,5±2,9 58,5±2,7№ 53,9±1,2 11,9±0,5 15,0±0,7№ 10,7±0,9І 28 50,8±2,1 59,6±1,6№ 52,3±2,1І 9,1±0,7* 12,3±0,6*№ 10,7±0,7 35 45,3±3,3 51,6±2,2* 47,8±2,6 16,2±0,9* 19,6±1,0*№ 17,1±1,4* 42 42,9±1,9 49,5±1,8№ 44,5±2,6 15,6±0,9 18,8±0,7№ 16,8±1,1 49 38,2±1,8 42,9±2,0* 39,0±2,3 11,4±0,9* 13,4±0,9* 12,3±0,6* 56 52,2±1,4* 55,9±1,3* 52,0±2,6* 12,3±0,8 16,4±0,7*№ 12,8±0,5І 63 58,8±1,4 61,5±2,1 57,9±3,0 17,2±1,2* 16,1±1,3 14,8±1,1 70 57,2±1,2 63,2±2,4 56,4±2,1 17,9±0,7 22,0±0,7*№ 15,9±1,2І Примітка. Різниця вірогідна: * р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020