НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ
Дмитренко Ірина Віталіївна
УДК 577.21:575:616.155.392-053.2
Молекулярно-генетичні порушення, асоційовані з гострими лейкеміями у
дітей
03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті клінічної радіології
Наукового центру радіаційної медицини АМН України
Науковий керівник
доктор біологічних наук
Мінченко Жана Миколаївна,
Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України, завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та
трансплантології
Офіційні опоненти
доктор біологічних наук
Дьоміна Емілія Анатоліївна,
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології АМН
України,
провідний науковий співробітник відділу радіобіології
доктор біологічних наук
Заставна Данута Володимирівна,
Інститут спадкової патології АМН України, м. Львів,
завідувач відділення діагностики спадкової патології
Провідна установа
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,
кафедра загальної та молекулярної генетики
Захист дисертації відбудеться “ 23 ” березня 2006 р. о 13.00
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 Наукового
центру радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул.
Мельникова, 53).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53).
Автореферат розісланий “ 21 ” лютого 2006 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради ________________________ А.В.
Стефанович
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Сучасна молекулярно-генетична діагностика лейкемій
базується на визначенні специфічних генетичних порушень, пов’язаних із
злоякісною трансформацією клітин. Генодіагностика надає можливість не
тільки судити про ступінь злоякісності пухлини, але і проводити ранню
ідентифікацію маркерів несприятливого прогнозу щодо перебігу хвороби. що
у великій мірі вилучає фактор суб’єктивності в оцінці конкретного
клінічного синдрому і є вкрай важливим для вибору тактики лікування
(Киселев Ф.Л. с соавт., 1990; Greaves M., Wiemels J., 2003; Steelman
I.S. et al., 2004).
На сьогодні вже описана більшість специфічних транслокацій, пов’язаних
із гострими лейкеміями (ГЛ) (Сергеев А.Г. с соавт., 2000). Транслокації
приводять до утворення химерних генів та експресії химерних білків з
онкогенними властивостями. Однак, у випадках гострих лімфобластних
лейкемій (ГЛЛ) такі транслокації та відповідні химерні гени виявляються
у невеликому відсотку хворих. Це обумовило необхідність пошуку інших
пухлинних маркерів, які б представляли більш зручну мішень для детекції
лімфоїдної клональності. До таких маркерів належать гени важких та
легких ланцюгів імуноглобулінів (IgH та IgK), оскільки перебудови в них
виникають на ранніх етапах В-клітинної проліферації (Ruiz-Arguelles G.J.
et al., 2000). Оскільки пухлинна маса походить з однієї
злоякісно-трансформованої клітини, то перебудови генів імуноглобулінів
(Ig) всіх пухлинних клітин будуть ідентичні.
У випадках, коли специфічні транслокації відсутні і походження
злоякісного процесу залишається нез’ясованим, ключову роль можуть
відігравати інші генетичні пошкодження, що стосуються, наприклад,
мутацій в генах-супресорах пухлини або в генах репарації
дезоксірибонуклеїнової кислоти (ДНК). За даними більшості авторів
непрямим доказом порушень в генах репарації є поява мікросателітної
нестабільності, що характеризується змінами у мікросателітній ДНК. Вони
виникають внаслідок зниження ефективності клітинних репараційних систем.
Порушення репарації ДНК розглядають як частину молекулярного механізму
канцерогенезу (Chung D.C., Rustgi A.K., 1995; Indraccolo S. et al.,
1999).
Дані про наявність мікросателітної нестабільності при гемобластозах
досить суперечливі. В експериментальних роботах виявлено взаємозв’язок
між інактивацією генів репарації і наступною мікросателітною
нестабільністю з одного боку та із злоякісною лімфоїдною проліферацією з
іншого боку (Lowsky R. et al., 1997). Окремі дослідники розглядають
мікросателітну нестабільність як ознаку прогресії гострих та хронічних
лейкемій (Wada C. et al., 1994). Існують дані про те, що наявність
мікросателітної нестабільності у початковому періоді гострої лейкемії
або неходжкінської злоякісної лімфоми є несприятливим прогностичним
фактором. При цьому рецидиви, які розвиваються досить швидко,
резистентні до хіміотерапії (Indraccolo S. et al., 1999).
Не дивлячись на прогрес в галузі молекулярно-генетичної діагностики
лейкемій, на сьогоднішній день немає єдиної думки про діагностичне і
прогностичне значення відносно перебігу захворювання як транслокацій і
пов’язаних з ними химерних генів, так і маркерів клональності
(перебудови у генах імуноглобулінів та в мікросателітних локусах) при
гострих лейкеміях у дітей. Практично відсутні роботи по дослідженню
взаємозв’язку між нестабільністю мікросателітної ДНК, утворенням
химерних генів, цитогенетичними порушеннями і іншими маркерами
клональності.
Безумовно, сучасна діагностика гострих лейкемій у дітей для встановлення
діагнозу повинна включати дані про генетичні зміни, які обумовлюють
властивості пухлини та особливості перебігу захворювання, що вимагає
розробки відповідної схеми дослідження клональних генетичних порушень у
таких хворих. Застосування встановлених цитогенетичних та
молекулярно-генетичних ознак патологічного клону дасть змогу визначити
ступінь злоякісності процесу та визначити групу ризику щодо перебігу
хвороби, виділити групи лейкемій з однаковими генетичними механізмами
для подальшої модифікації програми лікування, збільшити термін
тривалості життя хворих, що буде мати соціально-економічний ефект.
Наведене визначає актуальність проблеми і обгрунтовує вибір теми
дисертаційної роботи.
Зв’язок роботи з науковим програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась на базі Інституту клінічної радіології Наукового
центру радіаційної медицини АМН України в лабораторії імуногенетики
відділу гематології та трансплантології, а також в Лестерському
університеті (Великобританія) на кафедрі генетики (керівник наукової
групи проф. Ю.Є. Дуброва). Робота виконана в рамках науково-дослідних
робіт за тематикою АМН України: “Створити програму проведення
трансплантації стовбурових клітин кісткового мозку з урахуванням
особливостей реакції організму постраждалих у віддалений період після
радіологічної катастрофи” (№ держреєстрації 0100U00338, 2000–2003 рр.),
“Вивчити особливості перебігу лейкемій та лімфом у дітей і підлітків,
які проживають на забруднених радіонуклідами територіях України, та
удосконалити сучасні методи лікування їх у віддалений період після
аварії на ЧАЕС. Розробити та впровадити систему
лікувально-профілактичних заходів у дітей і підлітків груп радіаційного
ризику з онкогематологічної патології” (№ держреєстрації 0102U005694,
2002–2005 рр.), “Визначення ролі генетичних систем крові та деяких
молекулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів в комплексній оцінці
ефективності трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин у хворих на
лейкемії, лімфоми та солідні пухлини” (№ держреєстрації 0103U001408,
2003–2006 рр.).
Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – визначення
молекулярно-генетичних маркерів пухлинних клонів з урахуванням
клональних перебудов в генах імуноглобулінів і мікросателітної
нестабільності як прогностичних факторів перебігу гострих лейкемій у
дітей, розробка оптимальної схеми дослідження клональних генетичних
порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії.
Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі задачі:
1. Вивчити цитогенетичні порушення у дітей, хворих на гострі лейкемії.
2. Вивчити експресію химерних генів у дітей, хворих на гострі лейкемії.
3. Вивчити клональні перебудови в генах легких та важких ланцюгів
імуноглобулінів у дітей, хворих на гострі лейкемії.
4. Вивчити порушення мікросателітної ДНК у дітей, хворих на гострі
лейкемії.
5. Визначити найбільш діагностично значущі генетичні порушення при
гострих лейкеміях, розробити схему дослідження клональних генетичних
порушень у дітей, хворих на гострі лейкемії.
6. Вивчити взаємозв’язок між молекулярно-генетичними порушеннями
(химерними генами, клональними перебудовами в генах Ig, мікросателітною
нестабільністю) та клініко-гематологічними факторами прогнозу і
перебігом гострих лейкемій у дітей.
Об’єкт дослідження: цитогенетичні та молекулярно-генетичні порушення при
гострих лейкеміях у дітей.
Предмет дослідження: характеристика молекулярно-генетичних порушень як
критериїв щодо перебігу гострих лейкемій у дітей.
Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань використовували
цитогенетичні, молекулярно-генетичні методи дослідження. Статистична
обробка даних проводилася за допомогою програми Microsoft Excell та
програмних пакетів STATISTIKA (версія 7.0) і SYSTAT (версія 10.0).
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проаналізовані та описані
характер, частота та складність порушень каріотипу, експресія химерних
генів, клональні перебудови генів імуноглобулінів та порушення в
мікросателітній ДНК (локуси D9S171 та D12S98) в співставлені з
показниками перебігу гострих лейкемій у дітей.
Показано, що наявність клітин із спорідненими клонами є прогностично
несприятливою ознакою перебігу ГЛ.
Вперше встановлено, що складні клональні порушення каріотипу у дітей,
хворих на ГЛ, є незалежним прогностично несприятливим чинником
індивідуальної відповіді на терапію, а делеція 16-ї хромосоми в сегменті
16q13 специфічна для хворих на гостру мієлобластну лейкемію (ГМЛ) і не
погіршує прогноз перебігу захворювання.
Встановлено, що транскрипт AML/ETO не є специфічним виключно для
М2-варіанту ГМЛ, що обумовлює необхідність його дослідження у всіх
хворих на гостру мієлобластну лейкемію. Показано, що ПЛР-позитивні хворі
щодо генів AML1/ETO та TEL/AML1 мають кращу відповідь на терапію.
Показано, що клональні перебудови генів імуноглобулінів, а також
порушення в мікросателітних локусах D9S171 та D12S98 можуть бути
використані як молекулярні маркери пухлинного клону у дітей, хворих на
ГЛЛ. А залучення декількох пар праймерів для кожного гена та аналіз двох
генів імуноглобулінів (IgH та IgK) збільшує виявлення клональності.
Встановлено, що контроль за мінімальною резидуальною хворобою, який
грунтується на скринінгу химерних транскриптів та клональних порушень
генів імуноглобулінів, дозволяє виділити пацієнтів з найвищим ризиком
розвитку раннього рецидиву ГЛ.
Практичне значення одержаних результатів. На основі вивчення
цитогенетичних та молекулярно-генетичних порушень у дітей, хворих на
гострі лейкемії, визначені критерії прогнозу перебігу цього
захворювання, надана оцінка інформативності різних методів дослідження
окремих маркерів пухлинних клонів у пацієнтів з ГМЛ та ГЛЛ. Обгрунтована
доцільність використання клональних перебудов генів імуноглобулінів та
мікросателітної нестабільності як маркерів клональності лейкемічного
процесу у дітей.
Розроблена схема дослідження клональних молекулярно-генетичних порушень
у дітей, хворих на гострі лейкемії.
За результатами роботи розроблено “Методичні рекомендації щодо принципів
формування груп ризику з онкогематологічних захворювань та прогноз
перебігу лейкемій у дітей, які мешкають на забруднених радіонуклідами
територіях України”, співавтори В.Г. Бебешко, О.В. Кучер, К.М. Бруслова,
О.Є. Кузнєцова.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено
патентно-інформаційний пошук, проаналізовано літературу за обраною
темою, визначено мету і задачі дослідження. Особисто виконані постановка
культури клітин кісткового мозку, приготування та диференційне
G-фарбування препаратів хромосом обстежених пацієнтів, цитогенетичний
аналіз, дослідження експресії химерних генів методом
зворотнотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР),
клональних перебудов генів імуноглобулінів методом полімеразної
ланцюгової реакції (ПЛР), вивчення мікросателітної нестабільності
методом ПЛР з подальшим сіквенуванням, статистичний аналіз матеріалу.
Самостійно проведено аналіз та узагальнення даних, сформульовано
висновки, написано і оформлено всі розділи дисертації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і
обговорювались на III науково-практичній конференції “Onсogenetic
problems: scientific and applied aspects” (Київ, 2002), 8-му щорічному
конгресі Європейської асоціації гематологів (Ліон, Франція, 2003), 9-му
щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Женева,
Швейцарія, 2004), 5-й парнасівській міжнародній конференції “Molecular
mechanisms of cellular signaling” (Київ, 2005), міжнародній
науково-практичній конференції “Гематологія і трансфузіологія”,
присвяченій 5-річчю “Українського журнала гематології та
трансфузіології” (Київ, 2005).
Публікації. Основні положення роботи викладено в 12 друкованих працях, в
тому числі в 5 cтаттях у фахових наукових журналах та 7 тезах
доповідей на конференціях.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 180 сторінках
машинопису і складається із вступу, огляду літератури, описання
матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу
та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних
літературних джерел (9 російською та українською мовами та 153
іноземних). Дисертаційна робота проілюстрована 39 таблицями та 16
малюнками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Групу обстеження склали 110 пацієнтів у
віці від одного до 18 років, у яких був встановлений діагноз ГМЛ (35
дітей) та ГЛЛ (75 дітей). Додатково було обстежено 19 дорослих віком від
19 до 32 років, хворих на ГМЛ. Контрольну групу складали 20 здорових
дітей віком від 4 до 18 років.
Діагноз лейкемії встановлювався співробітниками відділення радіаційної
гематології дитячого віку (зав. відділення – д.мед.н. К.М. Бруслова),
відділу гематології та трансплантології (зав. відділу – чл.-кор. АМН
України, д.мед.н., проф. В.Г. Бебешко) Інституту клінічної радіології
Наукового центру радіаційної медицини АМН України, а також відділу
гематології дитячого віку Науково-дослідного інституту гематології та
переливання крові АМН України (зав. відділу – к.мед.н. В.Д. Дроздова).
Оцінка первинного клінічного статусу включала огляд шкірних покривів,
враховувала розміри печінки та селезінки, а також наявність збільшених
лімфовузлів, лейкемічних проявів з боку центральної нервової системи
(ЦНС) та осалгій. У гемограмі до уваги брали абсолютну кількість
лейкоцитів, тромбоцитів, рівень гемоглобіну та відсоток бластних клітин.
У кістковому мозку оцінювали відсоток бластних клітин. Діагноз ГЛ
формувався у відповідності до FAB-класифікації і імунофенотипу бластних
клітин.
Для оцінки особливостей клінічного перебігу захворювання аналізували
відповідь на терапію на 33-й день від початку лікування (наявність або
відсутність ремісії), тривалість ремісії (безрецидивне виживання),
наявність рецидиву, а також п’ятирічне загальне виживання. Лікування
хворих проводилося за стандартними протоколами інтенсивної
поліхіміотерапії відповідно до імуноцитоморфологічного варіанта
захворювання. Шістьом пацієнтам була проведена трансплантація
гемопоетичних стовбурових клітин периферичної крові. Медіана тривалості
спостереження за пацієнтами складала 32 місяці (від 1 до 182 місяців).
Обсяг проведених досліджень наведено в табл. 1.
Цитогенетичні дослідження проводили на прямих та 24-годинних
нестимульованих культурах клітин кісткового мозку. Препарати метафазних
хромосом фарбували за G-методом. Ідентифікацію кожної пари хромосом та
їх змін проводили згідно з критеріями ISCN (1995). У кожного пацієнта
аналізували від 7 до 30 метафазних пластинок. В облік брали тільки
клонові порушення (Mitelman F., 1995). Клоном вважали порушення, яке
повторювалося не менше ніж двічи на 10 проаналізованих пластинок. Клон з
втратою чи придбанням хромосоми враховувався тільки при наявності
мінімум трьох клітин з однаковою чисельною аномалією на 10
проаналізованих клітин.
Таблиця 1
Методи дослідження та групи пацієнтів, які були обстежені
Найменування дослідження Кількість обстеже-них пацієнтів з ГМЛ Кількість
обстеже-них пацієнтів
з ГЛЛ Всього
Цитогенетичне дослідження каріотипу 19 26 45
ПЛР-дослідження експресії химерних генів 32 61 93
ПЛР-дослідження клональних перебудов генів IgK і IgH
12
40
52
Дослідження порушень в мікросателітних локусах D6S268, D9S171, D12S98
7
21
28
Вилучення геномної ДНК з клітин кісткового мозку, периферичної крові та
букального епітелію проводили за стандартною методикою “висолювання”
(Miller S. et al., 1988). Вилучення РНК з клітин кісткового мозку та
периферичної крові проводили за Chomchinski P., 1987.
Визначення експресії химерних генів BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4, MLL/AF9,
AML/ETO, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 проводили за допомогою двораундової
“гніздової” ЗТ-ПЛР. Праймери для ампліфікації генів BCR/ABL, MLL/AF4 та
AML/ETO синтезували згідно до протоколів, рекомендованих Європейською
програмою BIOMED-1 (van Dongen J., 1999). Праймери для ампліфікації
генів E2A/PBX1, MLL/AF9, TEL/AML1 та CBF-в/MYH11 входили до складу
комерційних наборів (Гематологічний науковий центр РАМН, Москва).
Продукт ампліфікації візуалізували методом электрофорезу в 2 %
агарозному гелі.
Для визначення клональних перебудов в генах імуноглобулінів (IgK та IgH)
праймери, склад ПЛР-суміші та температурні режими ампліфікації
відповідали протоколам, рекомендованим Європейською програмою BIOMED-1
(Pongers-Willemse M.J. et al., 1999), а також згідно Garsia-Sаnz R. et
al. (1999). Для визначення перебудов у гені IgK використовували 5 пар
праймерів, а IgH – 2 пари праймерів. Після ампліфікації проводився
гетеродуплексний аналіз для виділення клональних ПЛР-продуктів
(Garsia-Sаnz R. et al., 1999). Отриманий продукт візуалізували методом
электрофорезу в 6 % поліакріламідному гелі.
Для дослідження перебудов у мікросателітній ДНК у кожного пацієнта
порівнювали мікросателітну пухлинну та конституційну ДНК. Джерелом
пухлинної ДНК були клітини кісткового мозку або периферичної крові в
гострому періоді захворювання. Конституційну ДНК отримували з букального
епітелію або в деяких випадках з клітин кісткового мозку в фазі
клініко-гематологічної ремісії. Проводили мультиплексну ПЛР
мікросателітних маркерів D6S268, D9S171, D12S98. Праймери та умови
ампліфікації відповідали наведеним в базі даних Genome DataBase (
HYPERLINK “http://www.ncbi.nlm.gov/Entrez” www.ncbi.nlm.gov/Entrez ).
Результати аналізували за допомогою автоматичного аналізатора ABI PRISM
3100 (“Applied Biosystems”, США) з використанням програмного
забезпечення GeneMapper, версія 3.0. Появу в пухлинній ДНК нового алеля
в даному локусі враховували як мікросателітну нестабільність (МСН),
втрату алелей порівняно з конституційною ДНК – як втрату
гетерозиготності (ВГ).
Цифровий матеріал оброблявся методом варіаційної статистики (критерій
Likelihood ratio ч2). Розподіл тривалості ремісії (безрецидивного
виживання) та загального виживання оцінювалися методом Каплан і Мейер,
дані про виживання порівнювали за результатами log-rank-тесту. Для всіх
досліджуваних показників статистично вірогідною вважалася величина
рN
®
a
N
P
R
t
v
?
a
N
P
R
v
x
?
a
l
AeCuuuuuuuuuuoooooeeeeaaOE
T4VaeXEZ°^?_aeauegael2nvqxqooooooeeeeoeeeeeeeoooaeO
d?th`„A
d?th`„A
oeeeooUNNoNoNeNNeeeoAo
d?th`„A
O OO
U
UU
%, що утворюється в результаті криптичної транслокації t(12;21),
виявлялася у двох дітей. Наші результати щодо сприятливого перебігу
захворювання у цих хворих (обидва пацієнта досягли повної ремісії і не
мали ранніх рецидивів) не досягли рівня статистичної значущості. Але
дослідження, проведені на великих групах обстежених (Jamil A. et al.,
2000), виявляють кореляцію між експресією химерного гена TEL/AML1 і
тривалим загальним і безподійним виживанням, що свідчить про позитивний
результат лікування хворих з t(12;21) і дає можливість розглядати це
порушення як прогностично сприятливу ознаку.
Експресія химерного гена BCR/ABL мала місце у 3-х хворих на ГЛЛ і у
одного хворого на ГМЛ. При цьому хворі відрізнялися різними варіантами
химерного продукту. Для хворих на ГЛЛ характерним вважається переважання
транскрипту BCR/ABL р190 (Cazzaniga G. et al., 2002). В нашому
дослідженні в групі дітей з ГЛЛ виявлена як експресія химерного гена
BCR/ABL р190, так і BCR/ABL р210. При ГМЛ мав місце лише транскрипт
BCR/ABL р210. У всіх обстежених нами BCR/ABL-позитивних хворих
цитогенетично не виявлялася t(9;22) і інші клональні порушення
каріотипу. Схожі результати наведені в роботі (Wells S.J. et al., 1996).
Причиною може бути наявність інших, не завжди помітних перебудов, що
приводять до формування химерного гена BCR/ABL без Ph хромосоми. Аналіз
показників перебігу захворювання не виявив яких-небудь відмінностей у
групі хворих з експресією гена BCR/ABL.
Перебудови, що задійснюють ген MLL, зокрема MLL/AF4, також були присутні
як у пацієнтів з ГМЛ (у одного з 32 дітей), так і з ГЛЛ (у 2 з 61
дитини). Проведення цитогенетичного дослідження у цих хворих виявило
транслокацію t(4;11) тільки в однієї дитини з дуже злоякісним перебігом
захворювання. В наших дослідженнях не вдалося показати особливості
перебігу захворювання, обумовлені цією перебудовою. Можливо, це
пов’язано з тим, що за віком всі хворі (за винятком вищезазначеного
випадку) не виходили за межі вікової групи від одного до 10 років, яка
відрізняється кращими показниками виживання серед хворих з t(4;11)
(Forestier E. et al., 2000). У всіх випадках транскрипти MLL/AF4
розрізнялись місцями розриву задіяних генів. Можливо, кожний з них має
своє прогностичне значення і є специфічним для того чи іншого варіанту
гострої лейкемії. Дослідження не показало розбіжностей у
розповсюдженості експресії химерного гена MLL/AF4 серед дітей (від 1 до
18 років) та дорослих віком від 19 до 32 років, хворих на ГМЛ. В той же
час транскрипт MLL/AF9 виявлявся тільки в обстеженій групі дорослих,
хворих на ГМЛ.
Дослідження мінімальної резидуальної хвороби (МРХ) показало, що чинником
прогнозу перебігу захворювання є також динаміка пухлинного клону після
проведення терапії. Серед 16 обстежених дітей в клініко-гематологічній
ремісії МРХ визначалася у 10 осіб (зберігалася ПЛР-позитивність). Серед
хворих на ГЛЛ кількість ПЛР-негативних дітей в клініко-гематологічній
ремісії була вірогідно більша (р
Підписано до друку 16.02.2006. Формат 60(90/16. Папір офсет. № 1.
Друк офсет. Ум. друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим. Зам. 365.
Друк “ІВЦ АЛКОН”
04074, м. Київ-74, вул. Автозаводська, 2.
Тел./факс: (044) 430-82-47.
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
