.

Вплив нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на стан імунної системи у інтактних тварин і пухлиноносіїв (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
130 2819
Скачать документ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Дворщенко Олег Станіславович

УДК 57.083:611.018.53:678.046.361:661.8

Вплив нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на стан імунної
системи у інтактних тварин і пухлиноносіїв

03.00.09 – імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології

біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Позур Володимир Костянтинович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Савцова Зоя Дмитрівна,

Національний Університет “Києво-Могилянская Академія”,

професор кафедри біології факультету природничих наук

доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник кафедри біохімії

Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології

імені Ф.Г. Яновського АМН України, м. Київ

Захист відбудеться 26 вересня 2006 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д26.001.14 у Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ,

проспект Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433
(конференцзал).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

Спецрада Д 26.001.14, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 11 травня 2006 року

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Молчанець
О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток методів рекомбінантної технології та
технологій штучного синтезу дозволили одержувати нові сполуки, які мають
певний вплив на клітини імунної системи. Це дозволило розширити пошук
протипухлинних препаратів.В останні роки виявлені нові природні і штучно
синтезовані сполуки, які мають ад’ювантну активність: а) природні
високополімерні сполуки, що включають у себе полісахариди бактеріального
і рослинного походження, бактеріальні глікопептиди, нуклеїнові кислоти
(Johnson A.G., 1994, Eck J., 1999); б) штучно синтезовані аналоги
природних полімерних сполук — синтетичні полінуклеотиди, поліпептиди,
глікопептиди (Toka F.N., 2003); в) штучно синтезовані полімерні сполуки,
що не мають природних аналогів — синтетичні карболанцюгові і
гетероланцюгові поліаніони і полікатіони (Чизмаджев Ю.А., 2000, Dockrell
D.H., 2001).

Основний наголос у створенні нових медичних препаратів і конструюванні
вакцин робиться на розробці перспективних кон’югатів і знаходженні
активних ад’ювантних речовин. В останній час все більше уваги приділяють
синтезу кон’югатів і ад’ювантних речовин на базі нанокомпозитів Шифа і
фулеренів (Moghimi S.M., 2005, Thrall J.H. 2004).

Відомо, що основи Шифа відносяться до сполук, котрі характеризуються
імуностимулюючою дією, яка пов’язана з активацією CD-4+ та CD-8+
лімфоцитів (Chen H., 1996). Основи Шифа підвищують силу імунної
відповіді на антигени різної природи при первинному контакті з ними
комітованих лімфоцитів, особливо цитотоксичну активність Т-лімфоцитів,
спрямовану проти клітин уражених вірусом і пухлинних клітин (Brown F.,
1999).

Фулерени характеризуються високою антивірусною (Schinazi F.F., 1995,
Straface E., 1995), антиоксидантною (Murugan M.A., 2002), хемотаксичною
(Toniolo C., 1994), антимікробною (Nina T., 1999) і протипухлинною
активністю (Miyata N., 1997, Miyata N., 1997).

Дослідження протипухлинної дії нанокомпозитів саліцилальімінатів та
фулеренів, визначення їх ролі у підвищенні імунного статусу організму за
умови канцерогенезу, є важливою проблемою сьогодення, що дозволяє
удосконалювати та суттєво покращувати імуномодулюючі препарати,
збільшуючи термін тривалості життя осіб з онкологічною патологією.

Наведене обумовлює актуальність проблеми і обґрунтовує вибір теми
дисертаційної роботи.

Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану
науково-дослідної роботи кафедри мікробіології та загальної імунології
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка та виконана у рамках теми № 01БФ036-08 “Закономірності
формування імунної відповіді на біополімери бактеріального походження”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було порівняльне дослідження
у модельних експериментах на інтактних тваринах та за умови ізогенного
росту пухлини стану імунної системи під дією саліцилальімінатів та
фулеренів для з’ясування закономірностей прояву імуномодулюючого ефекту
цих сполук.

Відповідно до цього, були поставлені такі завдання: 1) дослідити
електроктрофоретичну рухомість клітин та визначити величину їх
електрокінетичного потенціалу під впливом нанокомпозитів похідних
саліцилальімінів та фулеренів; 2) визначити функціональну активність
перитонеальних макрофагів за дії досліджуваних чинників in vitro; 3)
визначити динаміку росту пухлин та виживаність тварин пухлиноносіїв, які
піддавались дії нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та
модифікованої за їх допомогою вакцини; 4) оцінити цитотоксичність
лімфоцитів мишей за умови розвитку перещепленої модельної пухлини після
введення досліджуваних сполук та модифікованої вакцини; 5) встановити
рівень циркулюючих імунних комплексів, вміст антитіл у сироватці крові
та активність перитонеальних макрофагів у мишей, яким проводили ін’єкції
досліджуваних сполук і модифікованої вакцини за умов пухлинного росту;

Об’єкт дослідження — функціональний стан імунної системи інтактних
тварин та тварин з експериментальними моделями онкологічної патології
під дією нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та модифікованої
за їх допомогою вакцини.

Предмет дослідження — електрокінетичний потенціал клітин, вміст
лейкоцитів та лейкоцитарна формула, рівень циркулюючих імунних
комплексів, функціональна активність перитонеальних макрофагів,
цитотоксична активність лімфоцитів, рівень протипухлинних антитіл у
крові, об’єм пухлини, виживаність тварин.

Методи дослідження — світлова мікроскопія, НСТ-тест, визначення
електрокінетичного потенціалу клітин методом електрофорезу, визначення
циркулюючих імунних комплексів методом преципітації, дослідження величин
цитотоксичної активності нормальних кілерів, визначення рівня
протипухлинних антитіл імуноферментним методом, оцінка протипухлинної
активності препаратів за динамікою росту пухлин та виживаністю тварин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження
імунологічного статусу і порівняльну оцінку впливу нанокомпозитів
аеросилу з саліцилальімінатами і фулереном С60 у тварин за умови
ізогенного росту пухлини саркома 37. Отримані результати значно
поглиблюють і уточнюють знання про механізми імунологічних змін in vivo
та in vitro в умовах дії саліцилальімінатів та фулеренів на інтактних
тварин та за умови ізогенного росту пухлини. Встановлено, що композити
аеросилу з саліцилальімінами і нанокомпозити фулерену С60 здатні значно
затримувати розвиток пухлини, збільшувати виживаність тварин у 2,7 рази,
підтримувати на високому рівні показники неспецифічного захисту
організму, а також показники гуморального і клітинного імунітету. Вперше
проведено спробу модифікації протипухлинної вакцини виготовленої на
основі продуктів метаболізму Bacillus subtilis B-7025 нанокомпозитами
фулерену С60. Встановлено, що така модифікована вакцина викликає
регресію пухлини саркома 37 у 11% дослідних тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть
бути використані для подальшого впровадження в практику при лікуванні
злоякісних новоутворень та є науковим обґрунтуванням розробки методів
лікування онкологічних захворювань шляхом впливу на організм
нанокомпозитів саліцилальімінатів, фулеренів та модифікованої за їх
допомогою протипухлинної вакцини.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних
положень та оформлення всіх розділів роботи виконано безпосередньо
автором. Дисертантом особисто проаналізовано літературу за обраною
темою, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів
досліджень, сформульовано висновки. Всі результати отримані дисертантом
особисто або за його безпосередньої участі. Результати розділу 3.1.
отримані за участі п.н.с., к.б.н. Ю.В. Яніша Інституту експериментальної
патології, онкології та радіобіології ім. Кавецького.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи
були висвітлені на V Українській конференції молодих вчених онкологів
(Київ, 2002), на наукових семінарах в ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького (Київ,
2005), VII міжнародній конференції молодих онкологів (Киев, 2006),
Міжнародній науковій конференції (Новосибирск, 2006).

Публікація матеріалів. Основні положення дисертаційної роботи викладено
в 8 наукових публікаціях, з них 5 статтей у фахових журналах і 3 тези
доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 136
сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів
дослідження та їх обговорення, заключення, висновків, списку
використаних джерел з 243 найменувань, 5 рисунків, 34 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ.

Матеріали та методи досліджень. В дослідах використовували самців щурів
лінії Вістар вагою 120–150 г та мишей лінії Balb/c вагою 20–24 г, яких
утримували на стандартному раціоні віварію.

Нанокомпозити фулерену С60 одержували за методом (Golub A.A., 2001).
Концентрація фізично адсорбованих фулеренів на поверхні аеросилу
складала 0,15 µмоль/м2. Концентрація хемосорбованих фулеренів на
амінопропілаеросилі складала 0,51 µмоль/м2. Нанокомпозити
саліцилальімінів отримували за методом (Antoachuk V.V., 1995).
Концентрація саліцилальімінуаеросилу (СІА) складала 3,1 µмоль/м2,
купруму (ІІ) (CuСІА) — 0,5 µмоль/м2, ванадію (ІІ) (VOСІА) — 0,51
µмоль/м2, мангану (ІІ) (MnСІА) — 0,17 µмоль/м2 та цинку (ІІ) (ZnСІА) —
0,51 µмоль/м2.

Дослідження впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів на інтактних щурах
проводили за наступною схемою — досліджувані сполуки вводили тричі з
інтервалом у 7 днів підшкірно в ділянку шиї. Препарати вводили з
розрахунку 2 мг/тварину на весь курс в об’ємі 0,3 мл. Показники
кількості лейкоцитів і активність нейтрофілів периферичної крові
визначали на 3, 7, 14 та 21 добу.

Вивчення впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів на мишах-пухлиноносіях
проводили за схемою — клітини саркоми 37 в кількості 1·106
трансплантували під шкіру стегна мишам–самцям лінії Balb/c. Через дві
доби починали імунізацію тварин. Ін’єкції робили підшкірно у ділянку
шиї, триразово з інтервалом 7 діб. Препарати вводили з розрахунку 2
мг/тварину на весь курс в об’ємі 0,3 мл. Показники стану імунної системи
визначали на 7, 14, 21 та 28 добу, титри протипухлинних антитіл
визначали на 7, 14 та 35 добу.

Модифікацію протипухлинної вакцини (ПВ) для підвищення її ефективності
проводили за схемою — ПВ готували із співвідношення 1 мг білку на 1·106
клітин саркоми 37 в 1 мл (Новиков Л.К., 1979). Сорбцію вакцини на
досліджуваних сполуках проводили протягом 120 хв при +37°С з подальшим
зберіганням виготовленої вакцини при –20°С. Пухлину саркома 37 у дозі
1·106 клітин трансплантували під шкіру стегна мишам-самцям лінії Balb/c,
а модифіковану ПВ вводили через 2 дні із розрахунку 2 мг/тварину
нанокомпозиту на весь курс вакцинотерапії. Препарати тваринам вводили 3
разово, підшкірно в ділянку шиї, з інтервалом в 7 днів, в об’ємі 0,3 мл.
Показники стану імунної системи визначали на 7, 14, 21 та 28 добу, титри
протипухлинних антитіл визначали на 7, 14 та 35 добу.

Розрахунок величини електрокінетичного потенціалу клітин проводили після
їх електрофоретичного розділення у фосфатному буфері (Иенсен Г.Л.,
1979).

Визначення лейкоцитарної формули та одержання сироватки крові
піддослідних тварин проводили за стандартними методами. Тимоцити
отримували шляхом протирання тимуса через нейлонову сітку у середовище
RPMI-1640. Лімфоцити отримували шляхом градієнтного центрифугування на
фікол–верографіні (с=1,077) суспензії клітин селезінки (Sashchenko L.P.,
1996). Клітини перитонеального ексудату (макрофаги) — одержували з
черевної порожнини шляхом промивання середовищем RPMI-1640. Оцінку
життєздатності клітин проводили з використанням 0,4% розчину вітального
барвника трипанового синього. Інкубацію клітин здійснювали у термостаті
при 37°С у середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональну телячу
сироватку. Активність природніх кілерних клітин визначали в
цитотоксичному тесті in vitro за методикою (Frederik M., 1998). Рівень
протипухлинних антитіл у сироватці крові мишей оцінювали за допомогою
імуноферментної реакції (ІФР), яку проводили в 96-лункових мікроплатах
(Dynatech, Швеція) (Антитела. Методы, 1991). Рівень циркулюючих імунних
комплексів (ЦІК) в сироватці крові визначали методом преципітації
поліетиленгліколем-6000 (ПЕГ-6000) (Фролов В.М., 2002). Визначення
функціональної активності перитонеальних макрофагів (Кондратьева И.А.,
2001) та нейтрофілів (Передерий В.Г., 1995) оцінювали за їх здатністю
відновлювати тетранітротетразолієвий синій в спонтанному НСТ-тесті.

Протипухлинну активність препаратів оцінювали за динамікою росту
пухлини, а також за показником виживаності.

Статистичний аналіз результатів проводили, використовуючи t-критерій
Стьюдента, та критерій Пірсона (Лакін Г.Ф., 1980).

Дослідження впливу нанокомпозитів саліцилальімінатів та фулеренів на
інтактних тваринах. Результати вивчення змін електрокінетичного
потенціалу тимоцитів та макрофагів щурів під впливом досліджуваних
сполук показали, що клітини різного походження неоднаково реагують на
попередню інкубацію з досліджуваними сполуками. Значення
електрокінетичного потенціалу (ЕКП) наведено у таблиці 1. Кожна цифра
являє собою середню величину, обчислену за результатами вимірів лінійної
швидкості 25 клітин кожного типу згідно рівняння Смолуховського (Богач
П.Г., 1983).

Макрофаги щурів відповідали на преінкубацію з усіма досліджуваними
препаратами вірогідним зниженням ЕКП на 81–55%. Ця обставина сама собою
дуже важлива для неспецифічної стимуляції роботи клітинної ланки імунної
відповіді: зниження електрокінетичного потенціалу макрофагів свідчить
про зменшення їх від’ємного поверхневого заряду, що автоматично полегшує
їх зближення і контакт з однойменно зарядженими клітинами-мішенями під
час акту фагоцитозу або при презентації антигену Т- і В- лімфоцитам
(Munn D.H., 2003).

Дослідження змін ЕКП тимоцитів щурів показало (табл. 1), що тимоцити не
однаково реагують на преінкубацію з досліджуваними сполуками. Так,
металокомплексні сполуки викликали зниження ЕКП, що в свою чергу
свідчить про виникнення специфічної сенсибілізації тимоцитів, в той же
час аеросил і фулерен-сорбований виходять за межі загальної
закономірності — більшість речовин знижують ЕКП клітин-ефекторів,
аеросил підвищує ЕКП тимоцитів на 66,7%, а фулерен-сорбований на 111,7%.
Розподіл контрольних тимоцитів за конкретними значеннями ЕКП свідчить
про наявність двох пулів тимоцитів: тимоцити з низькими значеннями ЕКП,
це тимоцити коркового шару тимусу, тоді як тимоцити з більшим значенням
ЕКП — медулярні. Тобто, підвищення ЕКП тимоцитів свідчить про здатність
цих сполук стимулювати дозрівання медулярних тимоцитів. Також треба
відмітити, що близькі за будовою фулерен-сорбований і
фулерен-ковалентний показали діаметрально протилежний вплив на ЕКП
тимоцитів, що свідчить про велике значення стереохімічної будови
нанокомпозиту, який використовується в тих або інших медико-біологічних
цілях.

Таблиця 1

Величина ЕКП клітин після 60 хв інкубації з досліджуваною речовиною

Досліджуваний препарат ЕКП, мВ

Макрофаги Тимоцити

Контроль 44,51(2,88 19,45(2,4

СІА 19,76(1,45* 16,4(2,66

VOСІА 8,28(0,61* 13,57(1,92*

CuСІА 11,49(0,89* 13,26(1,72*

Аеросил 14,37(2,02* 32,44(2,88*

Фулерен-сорбований 28,78(2,56* 41,17±2,49*

Фулерен-ковалентний 28,35(1,94* 19,08±1,07

Примітка. 1. * — р

@

Ae

oe

b

???0?????

?~?F??????

? ?F??????

?E?F??????

???F??????

???F??????

?F?F??????

???F??????

? ?F??????

а віднести всі інші групи, в яких рівень ЦАЛ стабільно вищий від
контролю, що, в свою чергу, корелює з показниками виживаності і
динамікою розвитку пухлинного процесу.

Рис. 4. Цитотоксична активність лімфоцитів мишей з прищепленою пухлиною
саркома 37 під впливом нанокомпозитів саліцилальімініну (А) та фулерену
С60 (Б).

Примітка. 1. * — рРис. 12. Титри протипухлинних антитіл визначені в ІФА-тесті у мишей з пухлиною саркома 37, після імунізації досліджуваними вакцинами Примітка. 1. * — р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020