.

Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і днк у водному розчині (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
129 4138
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

ЄВСТИГНЄЄВ Максим Павлович

УДК 577.113:541.49

Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і днк у
водному розчині

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному
університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант доктор фізико-математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольський національний технічний

університет, завідувач кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор, Семенов Михайло Олексійович,
Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України,
старший науковий співробітник відділу біофізики (м.Харків);

доктор фізико-математичних наук, професор, Харкянен Валерій Миколайович,
Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем
(м.Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор, Прилуцький Юрій Іванович,
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри
біофізики (м.Київ).

Провідна установа

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН
України, відділ молекулярної біофізики, м.Харків.

Захист відбудеться 02.02.2007 р. о 15_ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному
університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м.Харків, пл. Свободи, 4.
ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою:

61077, м.Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 23.12. 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологічно активні ароматичні сполуки (БАС) утворюють
найважливішу групу фармацевтичних препаратів, що знайшли широке
прикладання в різних медичних застосуваннях. Використання ароматичних
сполук в якості лікарських засобів в багатьох випадках сполучено з
ризиком побічної токсичності, що різко обмежує їх застосування в
клінічній практиці. Разом з тим, ризик побічних ефектів може бути
суттєво знижений, або медико-біологічний ефект посилений при
комбінуванні ароматичних препаратів з іншими ароматичними сполуками в
дозі. Численні дослідження показують, що суміш різних БАС, які присутні
в організмі одночасно, виявляє виражений біологічний синергізм і надає
потенційну можливість спрямованої регуляції біологічного відгуку
ароматичних БАС, що надходять в організм у комбінації.

На даний час не існує чітких уявлень про причини і механізми виникнення
спостерігаємих синергетичних ефектів при одночасному використанні
ароматичних БАС як на клітинному, так і на молекулярному рівнях. Разом з
тим, відомо, що більшість сполук цього класу виявляють свою
медико-біологічну дію шляхом комплексоутворення з біополімерами в
клітині – ДНК або білками, – а також демонструють тенденцію до само-
(взаємодія однотипних молекул) і гетероасоціації (взаємодія різнотипних
молекул) у водному розчині, що носять нековалентний характер. Є підстави
вважати, що гетероасоціація ароматичних сполук і їх конкурентне
зв’язування з рецептором можуть модулювати біологічну активність БАС
через модифікацію параметрів зв’язування БАС з біополімерами і, тим
самим, виступати в якості молекулярних механізмів зміни біологічної
активності ароматичних препаратів, які надходять в організм спільно.
Однак, нековалентні взаємодії різних класів біологічно важливих
ароматичних сполук у присутності біополімеру по цей час залишаються
практично невивченими.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася відповідно до плану науково-дослідних робіт кафедри фізики
Севастопольського національного технічного університету (СевНТУ), у
рамках держбюджетної НДР “Нуклеотид” Міністерства освіти і науки України
(№ держ.реєстр. 0104U000568; керівник теми): “Гідротропний і
синергетичний ефекти при утворенні гетерокомплексів ароматичних
біологічно активних молекул і їх взаємодії з ДНК у водному розчині”,
2003-2006; у рамках персонального гранта НАТО і Королівського товариства
Великобританії “Stochastic model of competitive binding of aromatic
drugs to DNA” (2003-2004 р.); частково в рамках Міжнародного гранта
INTAS-97 31753: “Design, synthesis and testing of novel
biologically-active molecules as potential drugs with sequence-specific
binding to nucleic acids”, 1999-2002; відповідно до договорів про
науково-технічне співробітництво між Беркбек коледжем Лондонського
університету (Великобританія) і СевНТУ (2003-2008 р.) і між Автономним
університетом м.Пуебла (Мексика) і СевНТУ (2002-2007 р.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є встановлення основних
закономірностей процесів взаємодії ароматичних БАС різних за своїми
структурними (моно- і біс-інтеркалятори ДНК) і медико-біологічними
(антибіотики, мутагени, вітаміни) властивостями у водно-сольовому
розчині і з’ясування механізмів спільного (конкурентного) зв’язування
цих сполук із ДНК. У якості ароматичних БАС використовувались сполуки:
антибіотики (дауноміцин – DAU, доксорубіцин – DOX, ногаламіцин – NOG,
митоксантрон – NOV, актиноміцин D – AMD, норфлоксацин – NOR); мутагени
(бромістий етидій – EB, йодістий пропидій – PI, профлавин – PF, кофеїн –
CAF); вітаміни (флавин-мононуклеотид – FMN і нікотинамід – NMD);
біс-інтеркалятори (гомодимер етидію – EBH і акридиновий гомодимер –
AcrH) і фрагмент ДНК – дезокситетрануклеотид 5’-d(TpGpCpА).

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі:

1. Розробка теоретичних підходів для аналізу асоціації і
комплексоутворення ароматичних БАС із ДНК в умовах водного розчину.

2. Структурний і термодинамічний аналіз методом ЯМР-спектроскопії та
молекулярного моделювання процесів само- і гетероасоціації ароматичних
молекул у групах БАС1-БАС2, що мають медико-біологічне значення:
Антибіотик-Антибіотик, Вітамін-БАС, Кофеїн-БАС, Біс-інтеркалятор-БАС.

3. Дослідження комплексоутворення БАС із фрагментом ДНК.

4. Розробка способу кількісного аналізу взаємовпливу ароматичних
препаратів на параметри їх зв’язування з ДНК.

5. Аналіз механізмів спільного зв’язування ароматичних сполук із ДНК у
системах БАС1-БАС2-ДНК і міжмолекулярних взаємодій ароматичних БАС у
багатокомпонентних системах БАС1-БАС2-БАС3; формування уявлень про
спрямовану регуляцію біологічної активності в суміші ароматичних БАС.

Об’єкт дослідження – міжмолекулярні взаємодії за участю ароматичних БАС
та ДНК у водному розчині.

Предмет дослідження – молекулярні механізми асоціації ароматичних
біологічно активних молекул і їх спільного зв’язування з ДНК у водному
розчині.

Методи дослідження: одномірна (аналіз концентраційних і температурних
залежностей протонних хімічних зсувів) і двомірна (2М-TOCSY, 2М-ROESY)
гомоядерна 1H-ЯМР спектроскопія (500 МГц) – для одержання структурних і
термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул, аналізу
динамічної рівноваги молекулярних асоціатів у розчині; пакети програм
молекулярного моделювання X-PLOR і HyperChem для побудови просторових
структур молекулярних комплексів у розчині.

Наукова новизна отриманих результатів. У даній роботі вперше
запропоновано спосіб аналізу й інтерпретації на молекулярному рівні
механізмів регуляції медико-біологічної активності при спільному
використанні різних комбінацій ароматичних БАС. Отримано нову наукову
інформацію про характер міжмолекулярних взаємодій різних груп
ароматичних БАС: Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик,
Біс-інтеркалятор-БАС, що виявляють синергізм медико-біологічної дії при
спільному використанні.

На основі структурного та термодинамічного аналізу встановлено, що
асоціація ароматичних БАС у водно-сольовому розчині носить характер
стекингу хромофорів, переважно стабілізованого дисперсійними і
гідрофобними взаємодіями. Уперше встановлений факт додаткової
стабілізації гетерокомплексів молекул у групах Вітамін-БАС і
Антибіотик-Антибіотик міжмолекулярними водневими зв’язками.

Аналіз асоціації ароматичних біс-інтеркаляторів дозволив уперше зробити
висновок про існування в розчині різних за структурою агрегатів, що
включають відкриту і закриту форми, частково інтеркальовані димери і
тримери.

Запропоновано новий підхід до аналізу багатокомпонентних взаємодій
ароматичних молекул у розчині, заснований на алгоритмічному моделюванні
процесів асоціації молекул, що дозволило уперше вивчити трикомпонентні
змішані розчини ароматичних БАС з урахуванням усіх можливих
міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші.

Запропоновано фізичну модель спільного зв’язування різних ароматичних
БАС з ядерною ДНК, на підставі якої проведено аналіз спільного
зв’язування різних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК,
Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК.

Уперше введено поняття інтерцепторного і протекторного механізмів дії в
системах Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК, та запропоновано
спосіб кількісної оцінки відносного внеску цих механізмів у зміну
біологічної активності комбінації БАС.

Для досліджених груп ароматичних БАС продемонстровано потенційну
можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних
сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновані в роботі
теоретичні моделі і методика можуть бути використані для аналізу й
інтерпретації експериментальних даних ЯМР по нековалентній асоціації
будь-яких ароматичних сполук у водному розчині.

Отримані результати можуть мати застосування в області біотехнології
(розробка речовин із заданими медико-біологічними властивостями), оцінки
ефективності лікарських препаратів при їх комбінованому використанні,
при розробці оптимальних режимів комбінованої хіміотерапії,
вітамінотерапії, дієти при хіміотерапії і для інших застосувань,
пов’язаних з необхідністю обліку спільної дії біологічно активних
ароматичних речовин.

Особистий внесок здобувача. У роботах [9-21,23-29,31,36-38,41,43-49] –
постановка ЯМР експерименту, обробка експериментальних даних,
розшифровка і віднесення одно- і двомірних спектрів ЯМР; у роботах
[4-6,12,22,23,28,30,34,35] – розробка моделей багатокомпонентної
гетероасоціації; у роботах [1,13,20,25,32,50-53] – розробка моделі
спільного зв’язування ароматичних БАС із ДНК, формулювання критеріїв
кількісної оцінки багатокомпонентної рівноваги; у роботах
[1-8,12,13,15,19-35,37,38,40,41,43, 44,46-53] – участь у написанні
наукових статей; у всіх роботах без винятку – проведення обчислень,
аналіз і інтерпретація результатів, підбір літератури.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, які ввійшли до
дисертації, були представлені й обговорені на: 6-й міжнародній
конференції по застосуванню магнітного резонансу в науках про їжу,
Париж, вересень, 2002, Франція; 3-му з’їзді українського біофізичного
товариства, Львів, жовтень, 2002, Україна; 16-й Міжнародній
школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Севастополь,
травень, 2003, Україна; 1-й об’єднаній міжнародній конференції по ЯМР
спектроскопії EENC/AMPERE, Лілль, вересень, 2004, Франція; 1-й
всеукраїнській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики”, Харків, вересень, 2004, Україна; 3-й міжнародній конференції з
нових технологій і застосуванню сучасних фізико-хімічних методів,
Ростов-на-Дону, березень, 2005, Росія; 3-й Міжнародній конференції
“Фізика рідких середовищ: сучасні проблеми”, Київ, травень, 2005,
Україна; 17-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і
кристалів”, Берегове, вересень, 2005, Україна; 5-й Харківській
конференції молодих учених “Радіофізика і СВЧ електроніка” (секц.
біофізики), Харків, грудень, 2005, Україна; 3-й міжнародній конференції
по водневим зв’язкам і молекулярним взаємодіям, Київ, травень, 2006,
Україна; об’єднаній конференції “Euromar”, Йорк, липень, 2006,
Великобританія.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 53 роботи, у тому
числі 33 статті в наукових журналах і 20 тез доповідей на національних і
міжнародних конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, семи розділів і
висновків. Повний обсяг дисертації складається з 341 с., список
використаних літературних джерел – 490 найменувань – 29 с. Дисертація
містить 97 рис. і 45 табл., у тому числі на 34 окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, зв’язок дисертації з науковими
програмами і темами, сформульовані мета і задачі дослідження, показані
новизна і практична значимість отриманих результатів, зазначений
особистий внесок здобувача в опубліковані зі співавторами роботи.

Розділ 1 присвячений аналізу сучасної інтерпретації спостерігаємих in
vitro і in vivo синергетичних біологічних ефектів при спільному
використанні різних ароматичних БАС. Дано сучасне уявлення про
міжмолекулярні взаємодії ароматичних молекул у водному розчині і можливі
механізми зміни біологічної активності різних ароматичних препаратів, що
надходять у систему в біологічно значимих комбінаціях:
Антибіотик-Антибіотик, БАС-Метилксантин, БАС-Вітамін. Аналіз показав, що
для системи БАС-Метилксантин домінує уява про два найбільш значимі
молекулярні механізми зміни активності препарату в присутності кофеїну і
родинних метилксантинів – це конкуренція за сайти зв’язування на ДНК і
гетероасоціація – за умови, що основна біологічна дія препарату
виявляється через комплексоутворення з ДНК. Огляд літератури дозволив
зробити висновок, що обидва процеси, очевидно, є наслідком ароматичної
будови взаємодіючих молекул і в зв’язку з цим можуть виявлятися не
тільки в системі БАС-Метилксантин, але також і в інших комбінаціях
ароматичних молекул. Зокрема, існують свідчення про синергетичний
біологічний ефект в комбінаціях Антибіотик-Антибіотик і БАС-Вітамін,
який не має зараз адекватного пояснення. Таким чином, був зроблений
висновок про те, що задача з’ясування молекулярних механізмів зміни
медико-біологічної активності ароматичних препаратів у комбінації
зводиться до узагальненої проблеми аналізу трикомпонентної суміші
БАС1-БАС2-ДНК (або БАС1-БАС2-БАС3), яка включає в себе усі види
нековалентних взаємодій між розчиненими компонентами: самоасоціацію,
гетероасоціацію, комплексоутворення з ДНК, а також можливі специфічні
ефекти, характерні тільки для трикомпонентної суміші. Показано, що для
всебічного розв’язання подібної задачі (проведення структурного і
термодинамічного аналізу) найбільш придатним є метод ЯМР спектроскопії.

У розділі 2 розглянуті основи методу ядерного магнітного резонансу,
деякі практичні аспекти техніки реалізації одно- і двомірних ЯМР
експериментів, використаних у цій роботі, і теоретичні моделі, які
застосовувалися для аналізу асоціації ароматичних молекул і їх
комплексоутворення з фрагментами ДНК, розроблені в минулій кандидатській
дисертації здобувача. Зроблено висновок про те, що існуючі зараз моделі
нековалентних взаємодій ароматичних сполук обмежуються схемою реакцій,
яка формує динамічну рівновагу в розчині, при цьому будь-яке розширення
базової схеми істотно ускладнює аналітичний запис кінцевих виразів, що
особливо яскраво виявляється в моделях двокомпонентної гетероасоціації.
Як наслідок, перехід до аналізу багатокомпонентних розчинів БАС стає
неможливим у рамках існуючих аналітичних підходів. Зроблено висновок про
те, що опублікована здобувачем у кандидатській дисертації узагальнена
модель гетероасоціації є природною межею застосовності
функціонально-аналітичного підходу для опису протонного хімічного зсуву
в реакціях асоціації ароматичних молекул.

У розділі 3 запропонований новий підхід, заснований на алгоритмічному
моделюванні двокомпонентної рівноваги в розчині, дозволяючий принципово
розширити можливості аналізу гетероасоціації ароматичних сполук у
водному розчині – стохастична модель гетероасоціації.

Стохастична модель гетероасоціації. Формальний математичний опис
стохастичної моделі засновано на узагальненій реакції гетероасоціації,
що враховує утворення комплексів молекул X і Y з будь-яким чергуванням
гетеро- і гомостиків

, (1)

де ai, bi, ci – кількість однотипних молекул (довжина) відповідного
агрегату X або Y;

m, n, k – кількість агрегатів у кожнім комплексі;

KX, KY, Kh – рівноважні константи самоасоціації молекул X і Y і їх
гетероасоціації відповідно.

Введемо індекс I, що може приймати два значення X або Y: I((X,Y).
Розділимо всі можливі типи комплексів у розчині на три групи: 1)
комплекс типу X-Y, фланкирований з одного кінця молекулою X, а з іншого
кінця молекулою Y; 2) комплекс типу X-X, фланкирований з обох кінців
молекулами X; 3) комплекс типу Y-Y, фланкирований з обох кінців
молекулами Y. Тоді індекс T, що позначає тип комплексу, прийме значення
T((X-Y, X-X, Y-Y). Розглянемо довільний комплекс, що складається з L
молекул X і Y. Нехай кількість гетеростиків між молекулами X і Y у цьому
комплексі дорівнює h (h ( L – 1). Тоді довжини агрегатів однотипних
молекул, з яких складається комплекс, дорівнюють li, де i((1…h+1)–номер
агрегату.

З урахуванням уведених позначень і припущень щодо характеру процесу
молекулярної асоціації в розчині, аналітичні вирази для обчислення
сумарної концентрації CI і хімічного зсуву (I молекул типу I у ЯМР
експерименті можуть бути представлені у вигляді:

, (2)

– концентрація і хімічний зсув від самоасоціатів;

I0, I1 – загальна і мономерна концентрація молекул I у розчині
відповідно;

(m,(d –хімічний зсув протонів молекули I у мономері й у димері
відповідно;

f(h) – одинична функція, що розділяє парні і непарні h.

молекул I у комплексах типу T, що фігурують у виразі (2), визначаються
відповідно до закону збереження маси і, виходячи з адитивності хімічного
зсуву в умовах швидкого обміну в масштабі часу ЯМР, як

, (3)

– кількість молекул I у комплексі T з розподілом довжин агрегатів
l1…lh+1;

– концентрація комплексу T з розподілом довжин агрегатів l1…lh+1, яка
може бути визначена в загальному виді з закону діючих мас.

в (3) дає хімічній зсув від молекул типу I у комплексі T з розподілом
довжин агрегатів l1…lh+1 і визначається як різниця сумарного хімічного
зсуву молекул I в ізольованих агрегатах і в результаті додаткового
екранування в гетеростиках:

, (4)

де (h – хімічній зсув молекули I у гетерокомплексі;

– кількість агрегатів молекул виду I у комплексі типу T.

В описаній вище теоретичній моделі гетероасоціації немає обмежень на
розміри агрегатів і комплексів – у рівняннях (2) у загальному випадку
враховуються усі фізично можливі реакції з утворенням гетерокомплексів з
будь-якими ймовірними комбінаціями агрегатів взаємодіючих ароматичних
молекул у розчині. На відміну від запропонованих раніше моделей
молекулярної гетероасоціації модель (2) не вводить будь-яких додаткових
граничних умов у схему динамічної рівноваги (1). Рівняння (2)-(4)
складають основу некооперативної стохастичної моделі молекулярної
гетероасоціації STOCH-NC.

описує параметр кооперативності молекул I-типу в розчині.

Обчислювальний алгоритм стохастичної моделі будується на представленні
довільного гетерокомплекса, утвореного випадковим набором молекул X і Y,
у виді подвійного числа, у якому кожен біт ‘0’ чи ‘1’ відповідає
речовині X чи Y. Отже, цикл по всім подвійним числам від 0 до
максимально можливого при даній довжині гетерокомплекса означає
генерування всіх статистично можливих комплексів молекул у розчині.

Порівняльний аналіз результатів розрахунку по різним моделям дозволяє
зробити висновок про те, що величина розкиду параметрів гетероасоціації
аналітичних і алгоритмічних моделей істотно залежить від величин
рівноважних констант асоціації молекул. Базова модель найкраще
застосовна до систем з невеликим внеском реакцій гетероасоціації в
сумарну динамічну рівновагу в розчині. Разом з тим, для всіх досліджених
молекулярних систем узагальнена аналітична модель дає результати, що
збігаються з точністю до (30% з алгоритмічною моделлю, яка є найбільш
точною серед існуючих на сьогоднішній день теоретичних підходів. Аналіз
впливу параметра кооперативності на розрахункові параметри
гетероасоціації свідчить про відсутність вираженої кореляції між
константою гетероасоціації і похибкою розрахунку. Разом з тим у системах
з подібним характером кооперативності самоасоціації взаємодіючих речовин
похибка неврахування кооперативності може досягати 30%.

Двосайтова модель гетероасоціації. Розглянуті вище моделі молекулярної
гетероасоціації, засновані на припущенні структурної подоби взаємодіючих
компонентів X і Y, при якому з однієї сторони хромофора молекули X може
комплексоутворюватись лише одна молекула Y. Разом з тим, клас
ароматичних сполук містить у собі молекули, істотно різні за розмірами і
будівлею хромофору. Прикладом тому може служити вітамін нікотинамід з
одним ароматичним кільцем у хромофорі і молекули антрациклінових
антибіотиків з чотирма кільцями в хромофорі. У зв’язку з цим можна
припустити, що в змішаному розчині відразу дві молекули нікотинаміду
можуть сісти на одну сторону хромофора антрацикліна. Для обліку такого
типу взаємодій розроблена двосайтова модель гетероасоціації структурно
різних речовин X і Y. Отримано аналітичні вирази для опису хімічного
зсуву протонів взаємодіючих молекул (рівняння не наведені в зв’язку з їх
громіздкістю).

Модель багатокомпонентної гетероасоціації (N-STOCH). Базова ідея
розглянутої вище стохастичної моделі двокомпонентних взаємодій (2-STOCH)
полягала в розгляді довільного гетерокомплексу як подвійного числа, у
якому кожен біт може приймати значення 0 чи 1, відповідно типу речовини
X чи Y. Перехід до багатокомпонентної системи, що містить N взаємодіючих
ароматичних сполук, означає, що в такій системі довільний
гетерокомплекс еквівалентний числу в системі числення з основою N. У
спрощеному формулюванні це рівносильно тому, що для реалізації алгоритму
N-STOCH моделі досить базовий алгоритм 2-STOCH моделі перевести в
загальному випадку в систему числення з основою N.

. Будь-яка складова Ii вектора H може приймати значення I((0…N-1) і
позначає тип i-ї компоненти комплексу.

Введемо в розгляд квадратну матрицю Дд розмірності NxN, що містить
індуковані хімічні зсуви протонів молекул за номером рядка, що
знаходяться в комплексі з молекулами за номером стовпця. Значення
індукованих хімічних зсувів, що лежать на головній діагоналі,
відповідають екрануванню в гомостику, інші – екрануванню в гетеростику.
Аналогічним чином, уведемо матрицю K виду NxN, що містить рівноважні
константи асоціації між молекулами за номером рядку і молекулами за
номером стовпця. На головній діагоналі лежать константи самоасоціації
молекул; недіагональні елементи матриці відповідають константам
гетероасоціації.

, що містять мономерні і загальні концентрації всіх типів молекул у
розчині відповідно. З урахуванням цього закон збереження маси для
молекул типу I може бути записаний у вигляді:

, (5)

є функцією включення, що дозволяє проводити вибірку молекул тільки
заданого типу I;

fH – службова функція, необхідна для виключення з результату
підсумування фізично нерозрізнимих складових, відповідних т.зв.
“відзеркаленим” гетерокомплексам;

CH – концентрація поточного комплексу H у розчині, яка може бути
визначена відповідно до закону діючих мас:

. (6)

молекул типу I у комплексі H, може бути визначений шляхом послідовного
віднімання з мономерного хімічного зсуву дm величини індукованого
хімічного зсуву, створюваного молекулою “праворуч” і “ліворуч” від
даної:

. (7)

З урахуванням (7) результуючий хімічний зсув молекул типу I у розчині в
умовах швидкого обміну в масштабі часу ЯМР записується у виді

. (8)

Рівняння (5) і (8) складають основу Стохастичної моделі N-STOCH
багатокомпонентної рівноваги взаємодіючих ароматичних речовин. Зручність
запропонованого формалізованого опису полягає в можливості
безпосереднього програмування зазначених рівнянь з метою створення
комп’ютерного алгоритму обробки даних ЯМР за аналогією з алгоритмом
2-STOCH моделі. У якості вхідних даних використовуються матриці хімічних
зсувів Дд і констант K, вектор сумарних концентрацій Ct і концентраційна
(температурна) залежність протонного хімічного зсуву.

. При такому розгляді є можливим скорегувати константи
реакцій комплексоутворення лігандів X і Y з олігомером ДНК. Аналіз
свідчить про суттєвий вплив кооперативності на параметри спільного
зв’язування лігандів із фрагментом ДНК.

У розділі 4 проведений аналіз самоасоціації різних ароматичних БАС:
дауноміцина, доксорубіцина, норфлоксацина й ароматичних
біс-інтеркаляторів гомодимерів етидія й акридина методом 1М- і 2М-1H ЯМР
спектроскопії. Загальний алгоритм проведення обчислювального
експерименту полягає в пошуку оптимальних параметрів самоасоціації: (m
(граничний хімічний зсув в мономері), (d (хімічний зсув в димері), K
(рівноважна константа самоасоціації) чи (H (ентальпія), (S (ентропія),
при яких сума квадратів відхилень теоретичної кривої, розрахованої по
моделі самоасоціації, від експериментальної концентраційної ((x0) чи
температурної ((T) залежності протонного хімічного зсуву мінімальна.
Розрахунок залежності ((T) базується на використанні співвідношення
Вант-Гоффа для апроксимації залежності константи асоціації від
температури.

Самоасоціація ароматичних моноінтеркаляторів. З огляду на залежність
розчинності різних ароматичних БАС від типу використовуваного буфера,
був проведений експеримент по самоасоціації дауноміцина в різних
буферних розчинниках, з метою установлення впливу типу буфера на
параметри асоціації. Як розчинник були обрані буферні системи, широко
розповсюджені в біофізичних дослідженнях: водно-сольовий розчин (D2O +
0.1М NaCl), 0.1М фосфатний-, TRIS- і HEPES буфери. У табл.1 наведені
параметри самоасоціації DAU, розраховані за нескінченномірної
некооперативної моделі самоасоціації:

Таблиця 1

Параметри самоасоціації дауноміцина в різних буферних розчинниках (pD
7.3, T=303K)

Буфер D2O+NaCl Фосфатний буфер HEPES TRIS

K, л/моль 1160 ( 210 1020 ( 250 1400 ( 320 1130 ( 170

((H(, кДж/моль 32 ( 2 29 ( 2 30 ( 3 34 ( 3

((S(, Дж/моль(K 47 ( 7 38 ( 10 39 ( 10 55 ( 10

У цілому отримані результати свідчать про незначний вплив типу буферного
розчину на параметри самоасоціації ароматичних сполук у водному
середовищі.

Аналіз 2М-NOESY/ROESY спектрів показав, що в розчинах антибіотика
спостерігаються крос-піки, які варто віднести до міжмолекулярних
взаємодій близько розташованих у просторі протонів молекул DAU. Отримані
експериментальні результати дозволяють зробити висновок про існування
двох просторових структур самоасоціатів DAU у розчині – з паралельною й
антипаралельною орієнтацією хромофорів молекул у димерному комплексі з
можливістю утворення міжмолекулярного водневого зв’язку (рис.1).

Рис.1. Просторові структури димеру молекул дауноміцину в розчині: (а)
паралельна і (б) антипаралельна. Водневий зв’язок між O12 атомом
ароматичного кільця C хромофора однієї молекули і NH3-групою
аминоцукрового кільця іншої молекули показаний пунктиром.

Розрахунок структур димерних комплексів DAU був виконаний методами
молекулярної механіки з використанням програми X-PLOR і силового поля
Charmm22. Водяне оточення моделювалося молекулами води у виді TIP3P,
розміщеними в прямокутному боксі (1100 молекул). Топологія молекули DAU
і параметризація валентних взаємодій отримані за допомогою програми
XPLO2D з використанням кристалічних структур з PDB банку даних.
Параметри невалентних взаємодій між атомами відповідали силовому полю
ММ3. Початкова структура димеру задавалася на підставі аналізу значень
індукованих хімічних зсувів (?д=дm-дd) протонів DAU і відомих з NOESY
експерименту міжмолекулярних крос-піків. Описана методика також
використовувалася для побудови структур 1:1 гетерокомплексів усіх
систем, наведених у наступних розділах.

За методикою, використаної вище для аналізу самоасоціації DAU, був також
проведений структурний і термодинамічний аналіз агрегації антибіотиків
доксорубіцина (TRIS буфер) і норфлоксацина (фосфатний буфер). Отримано
рівноважні параметри самоасоціації (табл.2) і просторові структури
димерних комплексів. Структурні параметри агрегації DOX у цілому подібні
таким для розглянутого вище DAU, однак в енергетику самоасоціації
просліджується помітний внесок гідрофобних взаємодій, обумовлений,
очевидно, різною гідрофільністю молекул DAU і DOX, що
відрізняються групами –H і –OH у положенні 9O антрациклінового
хромофора, відповідно. Самоасоціація NOR (див.табл.2) також багато в
чому визначається гідрофобним внеском від водного оточення, що
виявляється в порівняно високому значенні рівноважної константи
самоасоціації, не характерному для двокільцевих ароматичних молекул.

Таблиця 2

Параметри самоасоціації доксорубіцину (DOX) и норфлоксацину (NOR)

Молекула DOX (T=303K) NOR (T=298K)

( 1.3 ( 0.2 0.97 ± 0.06

K, л/моль 1500 ( 400 130 ± 14

((H(, кДж/моль 26.0 ( 3.0 18.0 ± 3.6

((S(, Дж/моль(K 25 ( 8 20 ± 5

Самоасоціація ароматичних біс-інтеркаляторів. Аналіз експериментальних
даних дозволив запропонувати фізичну модель динамічної рівноваги
біс-інтеркалятора, що включає утворення відкритої (U), закритої (F) форм
молекули, взаємно інтеркальованого димера (F2) і тримера (F3) (рис.2).
На підставі запропонованої моделі виведене рівняння для опису
експериментального протонного хімічного зсуву:

, (9)

де h1 і h0 – мономерна і загальна молярні концентрації;

(U і (F – хімічні зсуви в U- і F-формі біс-інтеркалятора відповідно;

Kh – рівноважна константа реакції U?F (див.рис.2а);

K2, (2 і K3, (3 – рівноважні константи і хімічній зсув в димері й у
тримері, відповідно.

На підставі концентраційних і температурних залежностей протонних
хімічних зсувів EBH і AcrH у розчині і моделі (9) отримані параметри
самоасоціації біс-інтеркаляторів (табл.3). Порівняльний аналіз
індукованих хімічних зсувів і рівноважних констант комплексоутворення
дозволяє зробити висновок про існування конкуренції димерів і тримерів у
розчині, причому значний внесок у хід експериментальних кривих дає
наявність подвійного заряду лінкеру EBH і нейтральність лінкеру AcrH.

Рис.2. Схематичне зображення реакцій самоасоціації біс-інтеркалятора.

На підставі проведеного аналізу самоасоціації ароматичних БАС, а також
аналізу параметрів самоасоціації ароматичних БАС, відомих з літературних
даних, можуть бути зроблені наступні загальні висновки:

Таблиця 3

Рівноважні константи (л/моль), ентальпії (кДж/моль) і ентропії
(Дж/моль(К) реакцій само- і гетероасоціації AcrH і EBH

Реакція K298 -(H( -(S(

Самоасоціація

U ( F AcrH 42 ( 10 11 ( 3 6 ( 3

EBH 25 ( 5 9 ( 3 4 ( 2

F + F ( F2 AcrH 540 ( 130 32 ( 5 50 ( 10

EBH 730 ( 100 23 ( 3 22 ( 5

F + F2 ( F3 AcrH 4200 ( 1000 28 ( 5 25 ( 5

EBH 1400 ( 200 26 ( 3 27 ( 5

Гетероасоціація

EB + F ( FEB AcrH —

PI + F ( FPI EBH 30 ( 10 11 ( 2 9 ( 4

EB + F2 ( F2EB AcrH 6500 ( 800 36 ( 4 50 ( 10

PI + F2 ( F2PI EBH 160 ( 40 17 ( 3 15 ( 5

1. Для всіх вивчених ароматичних систем у більшості випадків
спостерігається екранування всіх ароматичних протонів обох сполук у
гетерокомплексі, що виявляється в зміщенні концентраційних кривих
хімічного зсуву при підвищенні концентрації в область сильного поля й у
виконанні умови ?m>дd.

2. Для усіх вивчених ароматичних систем без винятку й у незалежності від
типу бічних груп характерний екзотермічний характер реакції
самоасоціації (?Hдh; деекранування окремих протонів спостерігається тільки у випадку
значного розходження розмірів хромофорів взаємодіючих молекул.

2. Для усіх вивчених ароматичних систем без винятку й у незалежності від
типу бічних груп характерний екзотермічний характер реакції
самоасоціації (?H’ae4 6 8 ^ & j - a$ ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ”y¦  ?o?\??????? X Z E E E ?????Розрахункові параметри гетероасоціації БАС1-БАС2 у 0.1М Na-фосфатному буфері, pD 7.1 система Т, K Kh, M-1 -(Hh, кДж/моль -(Sh, Дж/моль(K Кофеїн-БАС CAF-NOV 318 256(31 9 ( 1 - (15 ( 4) CAF-DOX 303 180±30 22 ( 1 30 ( 5 CAF-NOG 303 180±40 23 ( 3 33 ( 8 CAF-NOR 298 30(10 20 ( 4 40 ( 10 CAF-FMN 298 161(26 24 ( 3 40 ( 16 CAF-NMD 298 7.12(0.04 19 ( 2 49 ( 6 Вітамін-БАС FMN-PF 298 920(80 41 ( 3 80 ( 10 FMN-EB 298 640±75 33 ( 2 57 ( 7 FMN-NOV 303 34000±8000 55 ( 6 87 ( 11 FMN-DAU 298 453(28 36 ( 5 70 ( 9 FMN-NOG 303 790(50 30 ( 1 44 ( 4 FMN-AMD 298 890(330 34 ( 6 50 ( 10 FMN-NOR 298 180(80 26 ( 2 42 ( 10 NMD-DAU 298 64(5 26 ( 4 53 ( 14 NMD-NOV 312 35(5 23 ( 3 44 ( 12 Антибіотик-Антибіотик NOV-DAU 318 3330(350 60 ( 6 95 ( 10 NOV-AMD 312 1500(600 28 ( 7 31 ( 8 DAU-AMD 298 2800(1100 39 ( 4 53 ( 12 NOG-DAU 303 2700(1200 33 ( 4 40 ( 8 NOG-NOV 318 5200(2500 34 ( 4 36 ( 7 NOG-AMD 303 3600(600 35 ( 6 47 ( 15 5. Існування міжмолекулярної взаємодії між ароматичними БАС підтверджує припущення про те, що одним з можливих механізмів зміни біологічної активності цих препаратів у суміші є гетероасоціація. Отримані в даному розділі параметри гетероасоціації використовуються далі як вхідні дані при дослідженні спільного зв'язування ароматичних лігандів із ДНК. Гетероасоціація біс-інтеркаляторів. Гетероасоціація за участю ароматичних біс-інтеркаляторов EBH і AcrH була вивчена на прикладі взаємодії EBH-PI і AcrH-EB у водно-сольовому і HEPES буфері, відповідно. Найкращу відповідність експериментальним даним виявлено при використанні моделі динамічної рівноваги в розчині, зображеної на рис.4. Для такої схеми вирази для хімічних зсувів протонів біс-інтеркалятора (h) і барвника (P) записуються у виді: (10) Рис. 4. Схематичне зображення реакцій гетероасоціації EBH-PI и AcrH-EB. Розрахункові параметри гетероасоціації представлені в табл.3. Аналіз значень у табл.3 дозволяє виділити основний фактор, що визначає розходження параметрів гетероасоціації EBH-PI і AcrH-EB – це довжина лінкеру досліджених біс-інтеркаляторів. Лінкер у AcrH на 4 зв'язки довше, ніж у EBH, що обумовило дуже низьке значення константи KC1 у системі AcrH-EB і енергетично більш вигідне зв'язування EB у F2-форму AcrH. У цілому проведений термодинамічний аналіз гетероасоціації за участю ароматичних біс-інтеркаляторів показав, що молекули, утворені сполученням двох ароматичних хромофорів, є ефективними перехоплювачами молекул ароматичних моноінтеркаляторів. Факт інтенсивної міжмолекулярної взаємодії моно- і біс-інтеркаляторів раніше не розглядався взагалі й у зв'язку з цим вимагає обов'язкового врахування в будь-яких біофізичних дослідженнях з одночасною присутністю в розчині сполук цього класу. Розділ 6 присвячений дослідженню комплексоутворення ароматичних БАС – новатрона, норфлоксацина і флавин-мононуклеотида – із фрагментом ДНК дезокситетрануклеотидом 5’-d(TGCA) у водно-сольовому розчині. Аналіз експериментальних концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів ліганду проводився по аналогічній розглянутій у розділі 5 методиці гетероасоціації. При цьому в схемі динамічної рівноваги в розчині враховувалися реакції утворення 1:1, 2:1 і 2:1, 2:2 комплексів ліганда (D) з однонитковою і дуплексною формами тетрануклеотида (N), відповідно, за виразом (11) Розрахункові значення рівноважних констант комплексоутворення наведені в табл.5. Таблиця 5 Розрахункові значення рівноважних констант (л/моль) комплексоутворення лігандів з дезокситетрануклеотидом 5’-d(TGCA) Ліганд K11, 103 M-1 K12, 103 M-1 K21, 103 M-1 K22, 103 M-1 NOV 67(15 850(170 34(15 545(103 NOR 0.3 ( 0.05 2 ( 0.5 - - FMN 0.1 ( 0.04 8 ( 2 - - У цілому для всіх розглянутих ароматичних БАС характерне екранування ароматичних протонів ліганда в складі 1:2 комплексу, досить великі негативні значення ентальпії й ентропії реакції комплексоутворення, що свідчить про інтеркаляційне чи частково інтеркаляційне зв'язування з дуплексом ДНК. Для антибіотика NOR експериментальні дані також свідчать про можливість утворення зовнішньозв’язаного комплексу з однонитковою формою тетрамеру. Комплексоутворення NOV з d(TGCA) у цілому некооперативне і характеризується значним електростатичним внеском в енергетику комплексоутворення з боку заряджених бічних аміноалкильних ланцюгів антибіотика; для антибіотика NOR інформація про утворення комплексів більш складних типів (2:1,2:2) з наявних експериментальних даних не може бути отримана; зв'язування ж FMN з тетрамером виявляє виражений антикооперативний характер, обумовлений стеричними й електростатичними перешкодами для вбудовування в дуплекс ДНК із боку бічних ланцюгів вітаміну. Отримані значення рівноважних констант комплексоутворення ароматичних БАС з тетрамером (див.табл.5) надалі використовувалися для розрахунку спільного зв'язування ароматичних молекул із ДНК. У розділі 7 проведений аналіз багатокомпонентної рівноваги ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК, Антибіотик-Антибіотик-ДНК і БАС1-БАС2-БАС3. Рівновага в системі БАС1-БАС2-ДНК. Як модель ДНК використовувалася дуплексна форма дезокситетрануклеотиду 5'-d(TGCA). Вибір такої олігонуклеотидної послідовності обумовлений наступним. По-перше, ДНК у клітині існує не у вільній полімерній формі, а в комплексі з ядерними білками–гистонами, – при цьому зв'язування типових ароматичних інтеркаляторів відбувається у вільні від гистонів ділянки ядерної ДНК. По-друге, у першому наближенні доцільно розглядати конкуренцію лігандів у локальному сусідстві тільки одного сайта зв'язування, отже, для такої мети тетрамерна послідовність є цілком придатною. По-третє, досліджуваний тетрануклеотид містить усі чотири природних нуклеотиди, що дозволяє зменшити внесок у проведений аналіз різної специфічності конкуруючих речовин при зв'язуванні з ДНК. Аналіз спільного зв'язування лігандів X і Y з олігонуклеотидом N повинний виконуватись при одночасному обліку усіх видів нековалентних взаємодій у водному розчині, докладно розглянутих у розділах 3-6: самоасоціація, гетероасоціація і комплексоутворення з ДНК. Відповідна система рівнянь закону збереження маси і спостерігаємого протонного хімічного зсуву лігандів X і Y записується у виді: (12) (13) Для того, щоб одержати хімічній зсув речовини Y, необхідно у виразі (13) всі індекси х замінити на індекси y і навпаки. Усі параметри, що фігурують у рівняннях (13)-(14), відомі з проведених раніше досліджень одно- (самоасоціація) і двокомпонентних (гетероасоціація і комплексоутворення з ДНК) взаємодій (розділи 4-6). Для перевірки адекватності моделі (12)-(13) були поміряні концентраційні залежності в системах DAU-CAF-TGCA і DAU-FMN-TGCA. Наступне перерахування хімічних зсувів DAU/CAF і DAU/FMN по рівняннях (12)-(13) дав збіг з експериментом у середньому не гірше 0.02 млн-1 на кожну експериментальну точку, що підтверджує можливість використання параметрів одно- і двокомпонентних взаємодій, для аналізу трикомпонентної рівноваги. Для аналізу спільного зв'язування ароматичних лігандів із ДНК використовувалося уявлення про існування двох основних молекулярних процесів, які впливають на зменшення зв'язування ароматичної сполуки X із ДНК у присутності іншої ароматичної сполуки Y – гетероасоціація X–Y і комплексоутворення Y із ДНК. Гетероасоціація зменшує кількість мономерів X у розчині, здатних зв'язуватися з ДНК, – цей процес назвемо "інтерцепторною" дією Y стосовно X. Комплексоутворення Y із ДНК частково витісняє молекули X, зв'язані з ДНК, зменшуючи тим самим частку комплексів X–ДНК – цей процес назвемо "протекторною" дією Y стосовно ДНК. У будь-якому випадку частка комплексів X–ДНК знижується в присутності Y і, отже, змінюється біологічна активність речовини X. : , (14) - мольна частка комплексів ліганд-d(TGCA)2 при "відключених" гетероасоціації і комплексоутворенні (Kh=0, K2Y=0). Область Rd>1 відповідає перевазі процесу комплексоутворення Y-ДНК над
процесом гетероасоціації X-Y (протекторна дія Y), а в області Rd Наукове видання ЄВСТИГНЄЄВ Максим Павлович “Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і ДНК у водному розчині” Підписано до друку 08.11.2006 р. Формат 60x90 1/16 Друк офсетний. Умовн.-др.арк. 2.5. Тираж 100 прим. Замовлення №46 Видавництво “СевНТУ”, Севастополь, 53, Стрілецька бухта, Студмістечко, НМЦ PAGE 1

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020