.

Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
167 5703
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Федірко Наталія Вікторівна

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства науки і освіти України та Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України

Наукові консультанти: академік НАН України, доктор біологічних наук

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології

імені О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділом загальної фізіології нервової системи

доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Львівського національного університету ім. Івана Франка

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук

Магура Ігор Сільвестрович,

Фізико-технічний навчально-науковий центр НАН України,

професор кафедри молекулярної фізіології та біофізики

член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів

Інституту біохімії імені О.В.Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач відділом цитофізіології науково-дослідного Інституту
фізіології імені Петра Богача Київського національного

університету імені Тараса Шевченка.

Провідна установа: Київський національний медичний університет імені
О.О.Богомольця

Захист дисертації відбудеться “25” квітня 2006 року о “14” годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.
акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “25” березня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Слина – важливий фактор підтримання здорового
стану органів ротової порожнини (Zachariasen, 1996). Вона
характеризується прямою бактерицидною, антивірусною та антигрибковою
активністю, що сприяє нормальному функціонуванню слизової оболонки
ротової порожнини, відіграє роль у формуванні смакових відчуттів,
жуванні та мовленні (Jensen et al., 2004). Зменшення слиновиділення та
зміни складу слини є причиною підвищення ймовірності карієсу,
периодонтологічних захворювань та патологій слизової оболонки ротової
порожнини (Porter et al., 2004). Відчуття сухості у роті (ксеростомія),
зумовлене пригніченням здатності клітин слинних залоз синтезувати та
виводити слину, є симптомом багатьох захворювань або побічним ефектом
дії лікарських препаратів. Ксеростомія супроводжує С’йогрен синдром,
цукровий діабет, радіаційне опромінення ділянок голови чи шиї,
хемотерапію та ін. (Porter et al., 2004). Однак, незважаючи на чисельні
клінічні дані, клітинні механізми розвитку ксеростомії залишаються
нез’ясованими. Враховуючи це, дослідження механізмів, що опосередковують
патологічні зміни функціонування слинних залоз є важливим завданням
сучасної фізіології.

У ссавців секреція рідкої слини (як базальна, так і стимульована) для
зволоження ротової порожнини здійснюється в основному підщелепною
слинною залозою (Foskett et al., 1989). Враховуючи це, виникненя
ксеростомії вірогідно пов’язане із порушенням функціонування ацинарних
клітин саме цієї залози. Також відомо, що синтез і секреція компонентів
слини є Са2+-залежними процесами, які регулюються змінами концентрації
вільного кальцію в цитоплазмі ([Са2+]i) та ендоплазматичному ретикулумі
([Са2+]ЕР) (Ambudkar, 2001). Виходячи з цього, порушення кальцієвого
гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози є вірогідною
причиною розвитку ксеростомії. Підтримання гомеостазу кальцію
досягається за рахунок узгодженого функціонування Са2+-транспортних
систем плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел та їх
взаєморегуляції. Проте дані про зміни кальцієвого гомеостазу при
ксеростомії, а також навіть щодо механізмів взаємодії між
Са2+-транспортними системами ацинарних клітин за фізіологічних умов
практично відсутні, хоча очевидно, що вони відіграють ключову роль у
регуляції слиновиділення.

Таким чином, вивчення механізмів [Са2+]i та [Са2+]ЕР сигналізації,
вкладу у їх модуляцію інших внутрішньоклітинних органел, таких як
мітохондрії, та їх взаємодії між собою зробить вагомий крок до більш
детального визначення ролі кальцієвого гомеостазу та внутрішньоклітинних
регуляторних органел у процесах слиновиділення та дасть змогу підняти на
новий рівень методи терапії дисфункцій слинних залоз.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини і тварин
Львівського національного університету імені Івана Франка:
науково-дослідних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний
метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом
екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б
“Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних
клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння
Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Об’єкт досліджень – кальцієвий гомеостаз в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози.

Предмет досліджень – механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.

Методи досліджень – фізіологічні тести, біофізичні, біохімічні,
електронно-мікроскопічні та статистичні методи досліджень.

Мета роботи. Мета виконаної роботи полягала у вивченні механізмів
взаєморегулюючого функціонування Са2+-транспортних систем плазматичної
мембрани, ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій, а також їх вкладу
в підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози в нормі та за умов ксеростомії.

Завдання дослідження

Визначити особливості перебігу [Са2+]і сигналізації при холінергічній
стимуляції ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та вклад різних
Са2+- транспортних систем у формування [Са2+]і сигналів.

Вивчити перебіг [Са2+]і сигналізації при активації пуринорецепторів в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

Розробити методичний підхід для прямої реєстрації концентрації
іонізованого Са2+ в ЕР на моделі хімічно пермеабілізованих ацинарних
клітин для дослідження кальцієвого гомеостазу всередині Са2+ депо.

Вивчити властивості ІnsР3-чутливого депо ЕР та механізми регуляції його
функціонування за участю інших Са2+-транспортних систем.

Визначити роль ріанодинових рецепторів у [Са2+]і сигналізації в
ацинарних клітинах та участь інших Са2+-транспортних систем в її
модуляції.

Дослідити механізм пасивного витоку кальцію з ЕР ацинарних клітин.

Визначити параметри депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини та
фізіологічну роль інших Са2+-транспортних систем у його регулюванні.

Довести адекватність стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету як
моделі ксеростомії шляхом визначення основних паметрів слиновиділення у
здорових щурів та тварин із експериментально викликаним діабетом.

Провести порівняльний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації при
холінергічній стимуляції ацинарних клітин підщелепної слинної залози
здорових щурів і тварин хворих на діабет.

Виявити зміни Са2+ сигналізації всередині ЕР та мітохондрій ацинарних
клітин при експериментально викликаному діабеті.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено
комплексний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози при активації холіно- та пуринорецепторів.
Доведено адекватність використання моделі хімічно пермеабілізованих
клітин для прямої реєстрації концентрації Са2+ в ЕР та вперше
зареєстровано [Ca2+]ЕР транзиєнти в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози. Вивчено характеристики InsP3-чутливого депо Са2+,
особливості модуляції його активності та гетерогенність в ацинарних
клітинах. Вперше доведено наявність функціонально-активних ріанодинових
рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози, вклад яких у
[Са2+]і сигналізацію визначається функціонуванням мітохондрій та
Са2+-АТФаз. Вперше одержано фізіологічні та електронно-мікроскопічні
свідчення на користь колокалізації мітохондрій, Са2+-АТФаз та
ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.
Вперше показано, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
транслоконовий комплекс ЕР є основним механізмом пасивного вивільнення
Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ та вперше доведено
фізіологічну роль мітохондрій у його підтриманні. Показано, що
трансмітохондріальне переміщення Са2+ є необхідним для перезаповнення
кальцієм депо ЕР.

У роботі вперше одержано докази на користь того, що в основі розвитку
ксеростомії при цукровому діабеті лежать зміни гомеостазу Са2+ в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Вперше показано зростання
базального рівня [Са2+]і та порушення перебігу [Са2+]і сигналізації при
холінергічній стимуляції ацинарних клітин за умов діабету. Виявлено, що
за умов діабету пригнічується функціонування Са2+-транспортних систем
ЕР, посилюється пасивний витік Са2+ через транслоконовий комплекс та
активується додатковий шлях вивільнення Са2+ із мітохондрій. Розроблено
гіпотезу, згідно якої посилення пасивного витоку Са2+ з ЕР та зменшення
активності Са2+-АТФаз лежать в основі зменшення в ЕР кількості Са2+,
здатного вивільнятися при стимуляції, що призводить до пригнічення
слиновиділення, а виявлене підвищення чутливості холінорецепторів та
споріденості Са2+-АТФази ЕР до ATP є природніми протекторними
механізмами для компенсування діабет-індукованих порушень у клітинах
слинних залоз.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати мають як
фундаментальне, так і практичне значення. Комплексний аналіз механізмів
підтримання гомеостазу кальцію розширює розуміння шляхів регуляції
функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози та є новим
кроком до з’ясування причин виникнення патологій слинних залоз.
Практична цінність одержаних результатів полягає в тому, що вони вперше
вказують на те, що порушення функціонування ацинарних клітин корелює із
змінами кальцієвого гомеостазу. Отримані в роботі дані та їх
інтерпретація можуть стати основою для теоретичних та практичних
рекомендацій при розробці методів терапії та фармакологічної корекції
порушення функціонування слинних залоз. На основі одержаних результатів
є підстави вважати, що потужні агоністи холінорецепторів та речовини,
які модулюють їх активність, можуть бути використані для корекції
ксеростомічних станів у хворих на діабет. Отримані дані використовуються
при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і тварин”,
„Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні механізми
регуляції обміну речовин” у Львівському національному університеті імені
Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулювала мету та
завдання дослідження, розробила методики вимірювання сумарного вмісту
кальцію з одночасною реєстрацією рівня секреторної активності,
ізолювання ацинарних клітин, реєстрації концентрації Са2+ в цитоплазмі
та ЕР цих клітин. Дисертант самостійно виконувала основну частину
експериментів, здійснювала аналіз, статистичне опрацювання й
узагальнення результатів. Разом із к.б.н Вац Ю.О розробила методики
одержання фракції мембранних везикул клітин слинної залози та визначення
у ній активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Разом з к.б.н. Копач О.В.
налагодила методику хімічної пермеабілізації та прямої реєстрації
концентрації Са2+ в ЕР ацинарних клітин. Деякі експерименти були
проведені разом з іншими спіавторами опублікованих робіт – молодшим
науковим співробітником к.б.н. Кругликовим І.А., старшим науковим
співробітником к.б.н. Півневою Т.А., провідним науковим співробітником
Інституту фізіології ім. О. Богомольця д.б.н. Войтенко Н.В., к.б.н. Вац
Ю.О., к.б.н. Копач О.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні
положення дисертації були представлені на: школі-семінарі “Мембрани і
сигнали” (Київ, 2000 р.), З’їзді Британського фізіологічного товариства
(Ліверпуль, 2001), 23му Міжнародному Конгресі фізіологічних наук
(Крайсчерч, 2001 р.), 4тій Конференції Чеського Нейрофізіологічного
товариства (Прага, 2001 р.), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна
сигналізація в рослинних та тваринних системах” (Київ, 2001 р.), 16му
З`їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), III
з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002 р.), 47му
з’їзді Біофізичного товариства (Сан-Антоніо, 2003 р.), 33му з’їзді
Товариства Нейронаук (Новий Орлеан, 2003), 3му Конгресі FEPS (Ніцца,
2003 р.), науковій конференції “Сечєнов та Одеська школа фізіологів”
(Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO “Receptors, Channels,
Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській конференції “Прoблеми
бiологiчної і медичної фізики” (Xapків, 2004 р.), регіональному
біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), 25му Міжнародному
фізіологічному конгресі (Сан-Дієго, 2005 р.), XV Міжнародному
біофізичному конгресі (Монтпельєр, 2005 р.), семінарах кафедри
фізіології людини і тварин та звітних конференціях Львівського
національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.), а також
на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського
національного університету імені Івана Франка та засіданні сектору
молекулярної фізіології Інституту фізіології ім.О.Богомольця у липні
2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 24 статті у фахових
наукових журналах та 29 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 381
сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: „Вступ”,
„Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати досліджень”,
„Обговорення результатів досліджень”, „Висновки” та „Список використаних
джерел”, який містить 510 посилань. Робота ілюстрована 118 рисунками та
8 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів.
Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар у віці 1–1,5 міс.
Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для
привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком
експерименту тварину наркотизували внутрішньо-очеревною ін’єкцією
кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної
слинної залози, відбирали за допомогою мікроканюлі, впритул підведеної
до проток залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення,
б-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком
гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку
декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали
шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у
базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 320
од/мг), протягом 25-30 хв (35 С). Базовий зовнішньоклітинний розчин
містив (у мМ): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0;
гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза –
10; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка.
Сумарний вміст кальцію в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично
з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу
полягає у тому, що іони Са2+ утворюють з арсеназо III комплекс синього
кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+
у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг
білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію
загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного
вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Реєстрація [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах
реєстрували з використанням високоафінного флуоресцентного Са2+ барвника
фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у
базовому розчині, який містив 5 мкМ фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35
С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом
30 хв для повної деетерифікації барвника. Для розрахунку [Ca2+]i
використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i =
Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9,
Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нМ (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Для пермеабілізації ацинарних
клітин використовували детергенти дигітонін та (-есцин. Концентрацію
детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально.
Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до
внутрішньоклітинного (НДВ), який містив (у мМ): KCl – 120; NaCl – 20;
MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75; рН 7,2.
Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою програми
“WinMAXC v2.10” (Chris Patton, Stanford University), у такому розчині
НДВ становила ~100 нМ. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20
мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах за виключенням окремо
згадуваних з (-есцином (40 мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин
контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під
світловим мікроскопом MP-3, а у випадку маг-фура-2/АМ-зафарбованих
клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Реєстрація [Ca2+]ЕР в ацинарних клітинах. Для моніторингу концентрації
Са2+ в ЕР ацинарні клітини завантажували низькоафінним флуоресцентним
Са2+ барвником маг-фура-2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60
хв при 37 С, що забезпечує компартменталізацію барвника у
внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Для вимивання
цитоплазматичної частки барвника проводили хімічну пермеабілізацію
клітин. Зміни [Ca2+]ЕР виражали як співвідношення інтенсивності
флуоресцентного сигналу маг-фура-2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм
до такої на 390 нм (F360/F390), яке прямо пропорційне змінам [Ca2+]ЕР
(Hofer & Machen, 1994).

Одержання фракції мембранних везикул. Мембранні везикули підщелепної
слинної залози щурів одержували методом диференційного центрифугування.
Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив (мМ): сахароза –
250,0; ЕДТА – 1,0; трис-Сl – 10,0 (рН=7.1, t=4С); оуабаїн – 1,0; NaN3 –
1,0. Гомегенат відцентрифуговували (10 хв при 1600 g та 30 хв при 40000
g), кінцевий супернатант видаляли, а осад розводили буферним розчином та
зберігали при t=-40оС (Hurley & Martinez 1985). Топологію мембранних
фрагментів визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1 %).
Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів
підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами
діаметром 0,5±0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са2+-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили
у розчин НДВ, який містив в мМ: NaCl – 50,0; KCl – 100,0; трис-Сl – 20,0
(рН=7.4, t=37 С); MgCl2 – 3,0; CaCl2 – 0,01. АТФ-гідролазну реакцію
ініціювали додаванням 3 мМ АТФ і через 1,5 хв реакцію зупиняли
додаванням 200 мкл 20% трихлороцтової кислоти. Вміст пробірок
відцентрифуговували (10 хв, 1600 g) і в супернатанті фотоколориметрично
визначали концентрацію Рі (Nakamura et al., 2002). Вміст білка
мембранного препарату визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951).
Активність Са2+-АТФаз розраховували як різницю між АТФазною активністю в
Са2+-вмістному та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са2+-АТФазну
активність розділяли на тапсигаргін-нечутливу (Са2+-АТФаза ПМ) та
-чутливу (Са2+-АТФаза ЕР) складові. Активність АТФаз виражали у мкмоль
Рі/год·мг білка.

Метод індукції експериментального діабету. Діабет викликали
внутрішньоочеревинною ін’єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненого в
0,9% NaCl (80 мг/кг маси тіла тварини). СТЗ-ін’єктовані та контрольні
тварини того ж віку утримували на однаковій дієті. Тварин
використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін’єкції СТЗ.
Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин становила 5-9 мМ, у
хворих на стрептозотоцин-індукований діабет – 14-28 мМ.

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували (12
год, 20оС) у суміші глютаральдегіду (2%) та параформальдегіду (2%),
приготовлених на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,2-7,4). Дофіксацію
проводили в 1% OsO4 у фосфатному буфері (1 год, 20оС). Фіксовані
клітини тричі промивали буферним розчином по 10 хв. Зразки зневоднювали
у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу
(аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі
зрізи (60-70 мкм) отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB,
Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату.
Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія)
при 80 кВ із збільшенням 5000-40000.

Статистична обробка результатів. Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР
опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичне
опрацювання результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel,
аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal
Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Са2+ сигналізація при активації холінорецепторів. Секреція рідинного
компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем,
який реалізується медіатором ацетилхоліном (АХ). Зв’язування АХ із
холінорецепторами ПМ призводить до підвищення [Са2+]і за рахунок
вивільнення Са2+ з депо та входу ззовні (Petersen et al., 2005). Однак,
незважаючи на інтенсивне дослідження окремих процесів, які
опосередковують [Ca2+]і сигналізацію в ацинарних клітинах, механізми їх
взаємодії залишаються нез’ясованими.

Характеристики АХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів. В стані спокою
[Ca2+]i в ацинарних клітин підщелепної слинної залози становаить 95(4 нМ
(n=124). Аплікація (10 с) до клітин АХ (5 мкМ) викликала [Ca2+]i
транзиєнти з амплітудою 215±22 нМ (n=124, рис. 1А). Амплітуда другого
АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту була меншою за першу на 15%, а при
наступних прикладаннях АХ – не змінювалась (n=8), що свідчить про
відсутність швидкої десинситизації холінорецепторів. Розрахована ЕС50
для АХ складала 0,83(0,06 мкМ (рис. 1В,Г), причому АХ викликав глобальне
підвищення [Ca2+]i незалежно від діючої концентрації (рис. 1В).
Аплікація АХ на фоні атропіну (10 мкМ) приводила до зменшення [Ca2+]i
транзиєнтів на 79±5% (n=8, p карбахолін (КХ) > пілокарпін. Розрахована ЕС50 для
КХ (негідролізуємого аналогу АХ) складала 4,7(0,6 мкМ.

Механізми формування АХ-індукованих [Ca2+] транзиєнтів. Для багатьох
типів незбудливих клітин доведено, що при активації М-холінорецепторів
формування висхідної фази [Ca2+]і транзиєнтів забезпечується тільки за
рахунок вивільнення Са2+ із депо ЕР (Ambudkar, 2001; Clapham et al.,
2001). З метою вивчити вклад у формування амплітудно-часових параметрів
АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів саме процесу вивільнення Са2+ із депо
ЕР порівняно із входом Са2+ ззовні, ми прикладали до клітин АХ за умов
безкальцієвого середовища (1 мМ ЕГТА). З’ясувалось, що на відміну від
кальційвмісного середовища, внаслідок багаторазового прикладання АХ
відбувалось значне зменшення амплітуди АХ-індукованого [Ca2+]і
транзиєнтів та їх зникнення після 4-5 прикладань АХ (рис. 2А).
Довготривала аплікація АХ (5 мкМ, 5 хв) за умов безкальцієвого
середовища призводила до появи [Ca2+]і транзиєнту, проте на відміну від
такого у Са2+-вмісному розчині, спостерігалось відновлення початкового
рівня [Ca2+]і навіть у присутності АХ (рис. 2Б). Час напівспаду такого
[Ca2+]і транзиєнту складав 36±7 с (n=15). Таким чином, за умов
неможливості перезаповнення депо ЕР АХ здатний повністю спустошувати
доступний для вивільнення запас Са2+ в ЕР. Для оцінки вкладу
перезаповнення депо Са2+ у АХ-індуковані [Ca2+]і транзиєнти ми блокували
Са2+-АТФазу ЕР (SERCA), яка є єдиною системою транспорту Са2+ в ЕР
(Putney, 1985; Berridge, 2004). Для цього ми використовували блокатори
SERCА: реверсивний – циклопіазонова кислота (СРА) та незворотний –
тапсигаргін (TG). Ми виявили, що обидва блокатори викликали зростання
[Ca2+]i ~100 нМ (n=10), яке характеризувалось виходом на плато та
зберігалось протягом усього часу присутності блокатора. В присутності
СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти зменшувались: перший на 31±8%,
другий на 56±9%, а наступна дія АХ не викликала змін [Ca2+]і (n=8).
Після відмивання СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти відновлювались до
початкової амплітуди. При використанні незворотнього блокатора TG було
виявлено зміни аналогічного характеру, за виключенням більш вираженого
пригнічення амплітуди першого АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту (на
75±8%, n=8, рис. 3Б). Отже, переважний внесок у формування
АХ-індукованих [Ca2+]і відповідей належить процесу вивільнення Са2+ з
ЕР.

За умови що вивільнення Са2+ з депо ЕР є єдиним механізмом формування
[Ca2+]і відповідей, не повинно було б спостерігатись відмінностей
абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів,
викликаних у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах.

Однак, виявлено: і) амплітуда АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді в
безкальцієвому розчині зменшувалась на 36±9% (n=19; pt? th. 4 ? ? ? ? h h h h h h h h h h h h h $ tth4 r 1/4 ? ? ????1/4 o ? ? ? ??????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ?????????? ??????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ???????????????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h -0@?thy h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h Ae oe?????ee???eeaaaaaaoeoeoeO?? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h N R N R Ae h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ±?±?z¦±¦ h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h  ? oioioi h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h :ого у здорових тварин. Таким чином, ми не спостерігали змін здатності МХ акумулювати Ca2+ під час агоніст-індукованого вивільнення Ca2+ із ЕР при діабеті, тому зменшення [Ca2+]і транзиєнту викликаного АХ після на фоні СССР вірогідно зумовлене швидкою Са2+-залежною інактивацією ІnsР3 рецепторів ЕР (як наслідок потенціювання за умов діабету процесу вивільнення Са2+ із МХ). Зміни функціонування Са2+-АТФаз ПМ та ЕР за умов діабету. Виявлене нами за умов діабету підвищення рівня [Ca2+]і в стані спокою та сповільнення [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, може бути зумовлене порушенням роботи Са2+-АТФаз. Проте, відомості про зміни функціонування Са2+-AТФаз ПМ та ЕР клітин слинних залоз за умов діабету відсутні. Нами вперше показано, що при СТЗ-індукованому діабеті пригнічується робота обох Са2+-АТФаз. Зокрема, зменшення активності Са2+-AТФази ПМ та ЕР ацинарних клітин хворих тварин складала 88±3% та 53±6% (n=9; рАХ>>кофеїн). Крім того, наявність депо-керованого входу
Са2+ при спустошенні ріанодин-чутливого депо підтверджує функціональну
роль RyR у кальцієвій сигналізації та свідчить про роль CICR в її
активації. Виходячи з аналізу кінетики депо-керованого підвищення
[Ca2+]i, механізм його активації не залежить від способу спустошення ЕР
(InsP3-залежного чи -незалежного). Це ймовірно зумовлене тим, що у
досліджуваних клітинах депо-керовані (SOC) канали є гетеромерами, які
сформовані декількома ізоформами TRPC білків, а саме TRPC3/TRPC6 в
апікальному полюсі та TRPC1/TRPC6 – у базолатеральному (Liu et al.,
2005). Як і вивільнення Са2+ з депо ЕР, депо-керований вхід Са2+ у
досліджувані клітини також виражено залежить від функціонального стану
МХ. Про це свідчить його драматичне зменшення та сповільнення при
блокуванні як захоплення, так і вивільнення Ca2+ МХ. Виявлені ефекти не
залежали від способу спустошення депо ЕР (InsP3-залежного чи
InsP3-незалежного), а, отже, відображають безпосередньо регуляцію МХ SOC
каналів. Враховуючи наявність у досліджуваних клітинах угрупування МХ,
розташованих на відстані порядка 10 нм від ПМ, ми вважаємо, що за
фізіологічних умов вони відіграють роль сенсорів мікродоменів високої
[Ca2+] біля вустя SOC каналів ПМ та здійснюють швидке захоплення Са2+
одразу після його входу у клітини. Оскільки припинення захоплення Са2+
МХ різко пригнічує депо-керований вхід Са2+, а не потенціює його (що
можна було б очікувати у випадку, якби МХ виконували роль бар’єру для
Са2+), ми вважаємо, що роль МХ полягає у забезпеченні позитивного
зворотнього контролю над функціонуванням SOC каналів шляхом попередження
їх Са2+-залежної інактивації. Все це забезпечує умови для повноцінного
перезаповнення депо ЕР після стимуляції. Загалом, одержані нами дані є
першим експериментальним свідченням того, що в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози МХ, локалізуючись безпосередньо під ПМ,
здійснюють захоплення Са2+ одразу після його надходження у клітини та
відіграють важливу фізіологічну роль у підтриманні депо-керованого входу
Са2+ (рис.24).

Динаміка зареєстрованого нами депо-керованого Са2+ транзиєнту та дані
високороздільної конфокальної мікроскопії для інших незбудливих клітин
(Malli et al., 2003) свідчать, що створені швидким захопленням Са2+ в МХ
мікродомени низької [Са2+] у субплазматичному просторі, існують
щонайменше кілька хвилин. Проте підвищення [Ca2+]МХ, викликане
захопленням Са2+ МХ при активації SOC каналів, має транзиєнтний
короткочасний характер (Glitsch et al., 2002; Malli et al., 2005), що
свідчить про транс-мітохондріальне переміщення захопленого Са2+ та його
вивільнення у більш віддалені ділянки цитоплазми. Ми виявили, що
припинення вивільнення Са2+ з МХ після активації депо-керованого [Ca2+]i
транзиєнту, призводило до істотного зменшення його амплітуди, що
зумовлено накопиченням Са2+ у МХ та наступним припиненням його
захоплення, що, у свою чергу, призводить до Са2+-залежної інактивації
SOC-каналів. Враховуючи виявлені тісні контакти між МХ та ЕР, а також
показану для інших об’єктів структурно-функціональну взаємозалежність
перебігу [Ca2+]і сигналізації в ЕР та МХ (Arnaudeau et al., 2001; Bowser
et al., 2002), фізіологічна роль транс-мітохондріального транспорту Са2+
полягає, ймовірно, у спрямуванні вхідного потоку Са2+ від ПМ до EР для
його перезаповнення. Шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР нами виявлено, що
блокування роботи Na+/Ca2+-обмінника дійсно призводило до часткового
пригнічення процесу перезаповнення ЕР. Крім того, при повторній
стимуляції клітин АХ за умов блокування Na+/Ca2+-обмінника вивільнення
Са2+ з ЕР складало ~70 %. Останнє може свідчити про те, що при
спустошеннні ЕР короткочасною дією АХ його перезаповнення здійснюється в
основному за рахунок роботи SERCA і додатково за рахунок
транс-мітохондріального транспорту Са2+. На основі цих результатів та
даних, одержаних на інших об’єктах (Malli et al., 2005), ми пропонуємо
гіпотезу, згідно якої при короткочасному процесі InsP3-індукованого
вивільнення Ca2+ домени ЕР, наближені до ПМ, імітують функцію МХ,
попереджуючи Са2+-залежну десенситизацію SOC-каналів шляхом прямого
захоплення Ca2+ в люмен EР (рис. 24). Завдяки наявності в ацинарних
клітинах потужного інтралюметального транспорту Са2+ (Tinel et al.,
1999; Petersen, 2005) фізіологічна роль такого захоплення Са2+ в ЕР може
полягати у транспорті Са2+ в більш віддалені від ПМ ділянки клітини.

За фізіологічних умов підвищення тонусу нервових центрів парасимпатичної
нервової системи супроводжується зростанням частоти нервових імпульсів,
що призводить до довготривалого підвищення рівня АХ в області навколо
ацинуса. Підтримання довготривалої секреції за таких умов потребує
постійного перезаповнення депо ЕР та входу Са2+ ззовні, тому нас
цікавило, чи змінюється перебіг цих процесів за умов тривалої стимуляції
клітин. Ми виявили, що за таких умов механізм перезаповнення депо ЕР
істотно відрізняється від такого при короткочасній стимуляції клітин: і)
припинення роботи SERCA за таких умов не викликало достовірних змін
депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту; іі) блокування як захоплення, так і
вивільнення Са2+ МХ викликало значно більш виражене пригнічення процесу
перезаповнення депо ЕР; ііі) попарне пригнічення SERCA та
Na+/Ca2+-обмінника МХ призводило до практично повного зникнення
депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту. Виявлені ефекти ми пов’язуємо з тим,
що за умов потужної стимуляції клітини у субплазматичному просторі між
ЕР та ПМ створюється високий градієнт Ca2+ за рахунок його вивільнення
через InsP3 рецептори, локалізовані у поверхневих доменах ЕР (Larina &
Thorn, 2005), що буде призводити до локальної Ca2+-залежної інактивації
SOC каналів. За цих умов депо-керований вхід Са2+ може здійснюватись
лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюючи Са2+ з-під вустя
SOC каналів підтримують депо-керований вхід Са2+. Захоплений
мітохондріями Са2+ транс-мітохондріально переміщується та вивільняється
Na+/Ca2+-обмінником у напрямку до ділянок локалізації SERCA, що й
відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP3 (рис.
24). Таким чином, вклад МХ у процес перезаповнення депо ЕР у значній
мірі залежить від тривалості стимуляції клітин. Присутність InsP3 є
ключовим моментом, що визначає залежність чи, навпаки, відносну
автономність процесу перезаповнення депо ЕР від транс-мітохондріального
транспорту Са2+. Підсумовуючи, одержані дані доводять важливу
фізіологічну роль МХ у регуляції кожного з процесів, суперпозиція яких
визначає особливості формування агоніст-індукованих [Са2+]і транзиєнтів
в ацинарних клітинах.

Загалом, у роботі показано, що підтримання гомеостазу кальцію в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок
комплексної взаємодії між Са2+-регулюючими системами ПМ, ЕР та МХ.
Взаємодія між Са2+-регулюючими системами здійснюється за рахунок
процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки просторовій
колокалізації цих систем.

Са2+-залежні механізми порушення функціонування ацинарних клітин
підщелепної залози за умов цукрового діабету. Згідно клінічних даних
більш, ніж у 50% пацієнтів хворих на цукровий діабет, виявлено
ксеростомію (відчуття сухості у роті), виникнення якої зумовлене
зменшенням секреції слини (Zachariasen 1996; Stegeman, 2005). У стані
спокою (за відсутності стимуляції) основним джерелом слини для
зволоження ротової порожнини є її виведення підщелепною слинною залозою
(Ferguson, 1999). Виявлено, що як структура, так і функції підщелепної
слинної залози за умов діабету зазнають значно більш виражених змін, ніж
привушної та під’язикової залоз (Anderson, 1998). Крім того, згідно
клінічних даних у пацієнтів хворих на діабет ІІ типу виявлено порушення
функціонування саме підщелепної, а не привушної чи під’язикової слинних
залоз (Dodd et al., 2000). Виходячи з цього, вивчення функціонування
підщелепної слинної залози при діабеті може пояснити причини виникнення
симптомів ксеростомії. В експериментах на тваринах, хворих на цукровий
діабет, виявлено драматичне зниження величини основних параметрів як
нестимульованого слиновиділення, так і стимульованого агоністами
М-холінорецепторів. Крім того, ми виявили, що стимулюючий ефект
пілокарпіну на швидкість слиновиділення та вміст секретованого білка у
слині був більш вираженим за умов діабету, ніж у контролі. Це може бути
пов’язано з виникненням на даній стадії захворювання пристосувальних
механізмів, таких як, збільшення густини і/або чутливості
М-холінорецепторів. Незважаючи на те, що такий феномен не було виявлено
раніше для слинних залоз, він зареєстрований для ряду інших тканин,
зокрема, серця (Carrier & Aronstam, 1987), гладеньких м’язів клубової
кишки (Carrier & Aronstam, 1990), vas deferens (Kamai et al., 1994) та
сечового міхура (Kamata et al., 1992). Загалом дані, отримані в
експериментах in vivo, свідчать, що захворювання на діабет модулює
механізми, які опосередковують секрецію слини. Оскільки перебіг [Са2+]i
сигналізації у цитоплазмі та люмені ЕР забезпечує регуляцію секреції
компонентів слини та їх синтез (Lodish et al., 1990; Ambudkar, 2000), їх
зміни повинні відігравати важливу роль у виявлених порушеннях
слиновиділення за умов діабету.

Дійсно, проведені нами дослідження виявили наявність істотних змін
кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
щурів за умов діабету. Зокрема, нами виявлено підвищення базального
рівня [Са2+]і та зміни перебігу [Са2+]і сигналізації, опосередкованої
дією АХ, а саме зростання за умов захворювання чутливості
М-холінорецепторів. Останнє підтверджує висловлену нами гіпотезу щодо
сенситизації холінорецепторів при діабеті. З іншого боку, ми виявили, що
за умов діабету зменшується амплітуда всіх [Ca2+]і відповідей,
опосередкованих вивільненням Ca2+ з депо ЕР, зокрема, [Ca2+]i
транзиєнтів, викликаних АХ, КХ чи іономіцином у безкальцієвому
середовищі. Загалом, виявлені нами зміни можуть бути зумовлені
накладанням декількох процесів: збільшенням чутливості/густини
М-холінорецепторів та зниженням вмісту Ca2+ всередині люмену ЕР. Останнє
підтверджується зменшенням за умов діабету InsP3- та кофеїн-індукованого
вивільнення Са2+, а також посиленням пасивного витоку Са2+ через
транслоконовий комплекс, що показано шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР.
На основі цих даних ми вважаємо, що за умов діабету зменшується
кількість Са2+ в ЕР, здатного вивільнятись при стимуляції клітин
агоністами, а одним із механізмів цього є посилення пасивного
вивільнення Са2+ через транслоконову пору. За умов діабету нами також
виявлено виражене пригнічення функціонування Ca2+-АТФаз ПМ та ЕР, а
також активацію пори перемінного проникнення МХ. Причиною пригнічення
активності Са2+-АТФаз при діабеті може бути зменшення кількості обертів
молекули ферменту у результаті посилення перекисного окислення ліпідів
(Pekiner et al., 2002) і/або зміни конформаційних переходів E1-E2
станів, викликані неферментативним глікозилюванням молекули ферменту
(Gonzalez-Flecha et al., 1999). Підсумовуючи, одержані дані свідчать, що
за умов діабету в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
спостерігаються драматичні зміни процесів підтримання кальцієвого
гомеостазу. Зменшення активності обох Ca2+-ATPaз, посилення пасивного
витоку Са2+ з ЕР та активація РТР є причинами підвищення базального
рівня [Ca2+]i і, так званого, перевантаження клітини кальцієм. Таке
тривале перевантаження клітин Са2+ призводитиме до його акумуляції в МХ
(Campanella et al., 2004), виснаження клітинних запасів АТФ та
токсичного ефекту (Duchen, 2004). Зменшення активності SERCA та
посилення пасивного витоку Са2+ через транслоконовий комплекс
призводитиме до зменшення вмісту Са2+ у люмені ЕР та порушення [Ca2+]ЕР
гомеостазу. Останнє призводитиме до порушення посттрансляційного
формування білків в ЕР (Kuznetsov et al., 1992), їх дозрівання та
подальшого виведення і, як наслідок, пригнічення секреції слини, що
підтверджується нашими експериментами in vivo. Узагальнююча схема, яка
відображає порушення механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози для умов діабету,
представлена на рис. 25.

Загалом, проведені дослідження дають змогу розширити фундаментальне
розуміння механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози у нормі та їх зміни при патологічних
станах слинних залоз, а також може бути використане для розробки нових
клінічних методів їх корекції.

Висновки

У представленій роботі відповідно до поставленої мети та завдань
дослідження проведено комплексний аналіз механізмів підтримання
гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у
нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. З одержаних
результатів зроблено наступні висновки:

Природній медіатор парасимпатичної нервової системи АХ незалежно від
концентрації викликає глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення
[Ca2+]i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів
атропіном. Амплітудно-часові параметри [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних
активацією М-холінорецепторів, визначаються суперпозицією процесів
вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо, надходження Са2+ ззовні та
його зворотнього захоплення в ЕР Са2+-АТФазою вже під час висхідної фази
[Ca2+]і транзиєнту.

Важлива роль у регуляції процесу АХ-індукованого вивільнення Са2+ з ЕР
належить МХ, які попереджують Са2+-залежну інактивацію InsP3 рецепторів
за механізмом позитивного зворотного зв’язку, що можливо завдяки їх
просторовій колокалізації з ЕР, яку показано методом електронної
мікроскопії.

У ПМ ацинарних клітин підщелепної слинної залози наявні функціонально
активні пуринорецептори Р1 та Р2 типів. Активація Р1 рецепторів
аденозином не призводить до змін [Ca2+]і, проте супроводжується
потенціацією [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних активацією
М-холінорецепторів, в основі якої лежить цАМФ-залежна модуляція
ФЛЦ–InsP3 сигнального шляху, оскільки цей ефект відтворюється за умов
прямої активації АЦ. Активація Р2 рецепторів АТФ викликає [Ca2+]і
транзиєнти з ЕС50=136(36 мкМ. Природа АТФ-індукованих [Ca2+]і
транзиєнтів переважно іонотропна, а вклад метаботропних Р2Y рецепторів
складає ~ 35%.

Шляхом прямої реєстрації амплітудно-часових змін концентрації
іонізованого Ca2+ всередині ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної
залози вперше показано, що як АХ, так і екзогенний ІnsР3 викликають
транзиєнтне вивільнення Са2+ з ЕР, яке повністю пригнічується блокатором
ІnsР3 рецепторів – гепарином. ІnsР3-чутливе вивільнення Са2+ із ЕР
дзвоноподібно залежить від Са2+ з максимумом в межах його фізіологічних
концентрацій у цитоплазмі (100-400 нМ), потенціюється АТФ у низьких (

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020