КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Філінська Олена Мечиславівна
УДК 577.352.2+577.152.315
Біохімічні механізми мембранотропної активності гетерополіядерних сполук
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі цитофізіології НДІ фізіології імені академіка
Петра Богача біологічного факультету Київського національного
університету імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Рибальченко Володимир Корнійович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач відділу цитофізіології НДІ фізіології імені академіка Петра
Богача біологічного факультету
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
Хижняк Світлана Володимирівна,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
провідний науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології
біологічного факультету
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
Могилевич Сергій Євгенович,
Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу медико-біологічних досліджень
Провідна установа: Чернівецький національний університет
імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці
Захист відбудеться „14” червня 2006 року о 14.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект
академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський
національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет,
спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ,
вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий „11” травня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
Т.Р. Андрійчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останнім часом хімія комплексних сполук переживає
період інтенсивного розвитку: синтез, дослідження взаємозалежності їх
складу, будови, фізико-хімічних і біологічних властивостей та методи їх
практичного застосування. Гетерополіядерні комплексні сполуки –
комплекси, в молекулі яких міститься декілька атомів металів, які
з’єднані з лігандами координаційними зв’язками. У досліджуваних нами
гетерополіядерних сполуках центральними атомами металів виступають Cu
(II) і Co (III), що оточені лігандом – діетаноламіном [Маханькова, 2002;
Kokozay, Vassilyeva, 2002].
Чисельні природні лікарські препарати містять комплекси металів як
фармакологічно активні компоненти. Наприклад, вітамін B12 містить
координаційно зв’язаний іон кобальту [Kobayashi, Shimizu, 1999],
молекула інсуліну – цинк [Леменовский, 1997], цисплатин – платину тощо
[Zhang, Lippard, 2003]. Комплексні сполуки також займають важливе місце
в розробці лікарських і діагностичних засобів. Встановлена здатність
комплексних сполук проявляти функції біокаталізаторів та
антиканцерогенні властивості [Thompson, Orvig, 2003]. Гетерополіядерні
сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном характеризуються
антиканцерогенною, антифітовірусною, бактерицидною, фунгіцидною
активностями та проявляють каталітичну активність в реакції розкладу
пероксиду водню [Харіна та ін., 2003; Маханькова, 2002].
Плазматична мембрана (ПМ) є найпершою ланкою в сприйнятті клітиною всіх
зовнішніх сигналів, їх проведенні і трансформації у клітинну відповідь.
Тому при вивченні клітинних і молекулярних механізмів дії речовин різної
природи значна увага приділяється саме особливостям їх взаємодії з
плазматичною мембраною [Рибальченко та ін., 1990-2002; Островська, 2005;
Lodish, 2000]. Одним з найбільш чутливих показників впливу біологічно
активних речовин ендогенного і екзогенного походження на стан ПМ клітини
є зміна активності мембранозв’язаних ферментів. В той же час, відомо, що
афінність мембранозв`язаних АТФаз до хімічних агентів, до яких
відносяться також гетерополіядерні комплексні сполуки, визначається
тісними структурно-функціональними зв`язками між АТФазами та ліпідами
плазматичної мембрани [Рыбальченко, Островская, 1998; Filomatori, Rega,
2003]. Все це свідчить, що ефекти гетерополіядерних сполук можуть бути
опосередковані як через безпосередній зв’язок з молекулами мембранних
АТФаз, так і шляхом модифікації ліпідного матриксу мембрани. Це і
послужило нам підставою для вивчення біохімічних механізмів ефектів
гетерополіядерних комплексних сполук як на мембранах різного ступеня
організації – моно- та бімолекулярних ліпідних мембранах, фракціях ПМ
гепатоцитів, так і на органному рівні – процесах жовчовиділення в
печінці.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках науково-дослідної теми “Синтез та дослідження гетерометальних
комплексів, що виявляють протипухлинну дію” (№ державної реєстрації
0102U000412) Київського національного університету імені Тараса
Шевченка.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи є вивчення біохімічних і
фізико-хімічних властивостей гетерополіядерних сполук Cu (II) та Co
(III) з діетаноламіном, дослідження їх ефектів на різних рівнях
організації живого: молекулярному, мембранному, органному.
У відповідності до мети дослідження були поставлені такі задачі:
1. Дослідити взаємодію гетерополіядерних комплексних сполук з штучними
мономолекулярними ліпідними мембранами.
2. З’ясувати характер впливу гетерополіядерних комплексних сполук та їх
складових на бімолекулярні ліпідні мембрани.
3. Дослідити вплив гетерополіядерних комплексних сполук на екто-АТФазну,
Мg2+,Са2+-АТФазну, Nа+,K+-АТФазну активності плазматичних мембран
гепатоцитів щурів.
4. Дослідити жовчосекреторну функцію печінки in situ у щурів за умов
впливу гетерополіядерних комплексних сполук.
Об’єкт дослідження. Біохімічні механізми реалізації ефектів
гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з
діетаноламіном на молекулярному, мембранному і клітинно-органному
рівнях.
Предмет дослідження. Мембранотропні ефекти гетерополіядерних комплексних
сполук Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном, зміни АТФазних активностей
плазматичних мембран та жовчосекреторної функції печінки під впливом цих
сполук.
Методи дослідження. У роботі використані методи дослідження поверхневої
та мембранотропної активності гетерополіядерних комплексних сполук за
зміною двовимірного тиску та граничного стрибка потенціалу ліпідних
моношарів, визначення електричної провідності та ємності бімолекулярних
ліпідних мембран, метод виділення плазматичних мембран гепатоцитів щурів
в градієнті щільності сахарози, методи визначення ферментативної
активності (екто-АТФазної, Мg2+,Са2+-АТФазної, Nа+,K+-АТФазної)
плазматичних мембран гепатоцитів, метод дослідження жовчосекреторної
функції печінки щурів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що
гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з
діетаноламіном, які мають різні аніонні замісники, взаємодіють з моно-
та бімолекулярними ліпідними мембранами, змінюючи граничний стрибок
потенціалу і двовимірний тиск ліпідних моношарів та електричну
провідність і електричну ємність БЛМ в залежності від типу аніону.
Гетерополіядерні комплексні сполуки з тіоціанатним та ацетатним аніонами
(СNCS та CАс, відповідно) більш інтенсивно вбудовуються до ліпідного
матриксу мембрани, підвищуючи його механічні та електричні
характеристики. Гетерополіядерні комплексні сполуки з хлоридним,
бромідним та йодидним аніонами (CCl, CBr, CI, відповідно) взаємодіють з
полярними головками молекул ліпідів і не інкорпоруються всередину
гідрофобної зони мембрани. Вперше встановлено і охарактеризовано впливи
гетерополіядерних комплексних сполук на екто-АТФазну, Мg2+,Са2+-АТФазну
і Na+,K+-АТФазну активності плазматичних мембран гепатоцитів щура.
Показано, що всі мембраномодулюючі ефекти гетерополіядерних комплексних
сполук Cu (II) та Co (III), включаючи зміни ферментативних властивостей
біологічних мембран, залежать від типу аніонного замісника в цих
сполуках. За мембранотропними властивостями та за модифікацією
ферментативної активності ПМ гепатоцитів найбільшою активністю
характеризуються СNCS та CАс-сполуки, а найменшою – CCl, CBr та
CI-сполуки. Встановлено також, що CCl, CI, CАс-сполуки проявляють
гальмівну дію на об’ємну швидкість секреції жовчі печінкою, СNCS-сполука
викликає протилежний ефект.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють
уявлення про молекулярні механізми, що лежать в основі сигнальної
трансдукції біологічних мембран, є внеском в розуміння біохімічних
механізмів ефектів біорегуляторів. Встановлені первинні механізми
взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з
плазматичною мембраною клітини і модифікації ними ліпідного матриксу
мембрани та активності мембранозв’язаних ферментів можуть бути
використані для пошуку та цілеспрямованого синтезу нових біорегуляторів
з заданим спектром дії та підбору оптимальних комбінацій і ефективних
концентрацій, для створення нових підходів у профілактиці низки
патологічних станів, пов’язаних із забрудненням довкілля. Отримані
результати впроваджені в навчальний процес біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка в спецкурси:
„Цитологічні ефекти фармпрепаратів”, „Рецептори мембран”,
„Фармакологія”, а також використані в навчальному посібнику „Фізіологія
і біохімія травлення. Практикум” (2006).
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні експериментів, в аналізі
та інтерпретації даних літератури і отриманих результатів, формулюванні
висновків, оформленні дисертації. Загальне планування роботи та
обговорення результатів проводилось за участю наукового керівника.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були
представлені на: Міжнародній науковій конференції „Клітинні і
субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004);
Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004); II З’їзді токсикологів України (Київ, 2004); I Міжнародній
конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ в біології” (Львів,
2005); VI Міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми
токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (Київ, 2005); V
Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів „Біологічні
дослідження молодих вчених в Україні” (Київ, 2005); 2nd International
conference “Neural-humoral and cellular regulatory mechanisms of
digestion processes” (Kyiv, 2005).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статтей у фахових
наукових виданнях та 7 тез доповідей на конференціях та з’їздах.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках, складається
з вступу, огляду літератури, розділу з описом матеріалів і методів
досліджень, розділу власних досліджень, узагальнення, висновків і списку
використаних джерел, що включає 255 найменувань. Робота ілюстрована 24
рисунками і 7 таблицями.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном
синтезовані на хімічному факультеті Київського національного
університету імені Тараса Шевченка. Всі досліджувані сполуки мають
однаковий центросиметричний катіон (Cu2Co2(H2Дea)2(Дea)4(+, але різні
аніонні замісники: Cl-, Br-, I-, NCS-, CH3СОO-. Далі по тексту хлоридна,
бромідна, йодидна, тіоціанатна та ацетатна сполуки позначаються: CCl,
CBr, CI, СNCS, САс.
Дослідження взаємодії гетерополіядерних сполук з ліпідними моношаровими
мембранами проводили на межі розподілу фаз „розчин електроліту –
повітря” та „розчин електроліту – моношар ліпідів – повітря” [Гевод,
1990; Островська, 2005]. Двовимірний тиск (П) моношарових структур
вимірювали за допомогою напівзануреної платинової пластинки за методом
Вільгельмі, чутливість – 0,1 мН/м. Граничний стрибок потенціалу (ГСП),
що виникає при формуванні поверхневих структур на поверхні субфази,
вимірювали за методом динамічного конденсатора, чутливість – 2 мВ. Для
відведення ГСП використовували хлор-срібний електрод (занурений у
субфазу) і золоту пластинку діаметром 1 см, яка вібрувала у повітрі над
поверхнею розподілу фаз з частотою 1450 Гц. За нульове значення приймали
параметри вільної поверхні розподілу фаз „розчин електроліту–повітря”.
Розчин гетерополіядерних сполук вносили в об’єм субфази за допомогою
насосу Бернулі, що запобігає безпосередньому їх попаданню на поверхню
розчину. Ліпідні моношари формували з азолектину (сумарна фракція
фосфоліпідів із бобів сої) шляхом нанесення розчину ліпідів (1 мг/мл) у
хлороформі на поверхню субфази (0,01 М KCl, 0,01 М трис-HCl, рН=7,4) у
тефлоновій кюветі (130Ч200Ч5 мм) до досягнення стабільної величини
двовимірного тиску.
Плоскі бімолекулярні ліпідні мембрани (БЛМ) формували з розчину
фосфатидилхоліну в n-декані (23-25 мг/мл) на отворі (( 0,8 мм) у
тефлоновій склянці, зануреній у 0,1 М розчин KCl [Омельченко, 1990].
Струм (I) крізь мембрану вимірювали в умовах фіксації потенціалу (U) за
допомогою швидкодіючого операційного підсилювача (чутливість – 0,1 пА) і
реєстрували двокоординатним самозаписувачем Н-307/1. Опір мембрани
вираховували за формулою R=U/I, провідність – G=1/R. Ємність БЛМ
вимірювали за методом нестаціонарних циклічних вольт-амперних
характеристик і розраховували за рівнянням: C=Ic/2/?ц/Дф, де Ic –
ємнісний струм, а ?ц/Дф – швидкість розгортки мембранного сигналу до 50
мВ.
Плазматичні мембрани (ПМ) клітин печінки щурів виділяли методом
ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози [Song et al.,
1969.]. Вміст білка в отриманій фракції визначали за методом Lowry et
al. [1951]. Чистоту препарату визначали за порівнянням активності
маркерних ферментів – 5?-нуклеотидази (ЕС 3.1.3.5) та
глюкозо-6-фосфатази (ЕС 3.1.3.9) – у вихідному гомогенаті і в отриманих
мембранних фракціях. Mg2+,Са2+-АТФазну активність (ЕС 3.6.1.38) ПМ
гепатоцитів щурів визначали у середовищі, що містить: 50 мМ Трис-НСl, 70
мМ КСl, 30 мкМ ЕГТА, 0,3 мМ АТФ, рН 7,5, яку активували додаванням 10
мкМ CaCl2 [Lotersztain et al., 1981]. Середовище для визначення
екто-АТФазної активності (ЕС 3.6.1.3) містило: 50 мМ Трис-НСl, 70 мкМ
КСl, 3 мМ АТФ, рН 7,5. Активність ферменту стимулювали додаванням 300
мкМ СаСl2. Вміст ПМ в середовищі інкубації становив 20 мкг білка на 0,5
мл середовища інкубації. Nа+,K+-АТФазну активність (ЕС 3.6.1.37) ПМ
гепатоцитів визначали за різницею між загальною АТФазною активністю і
активністю в присутності уабаїну (1·10-4 М). Вміст мембранного препарату
в реакційній суміші становив ~50 мкг білка на 0,5 мл середовища
інкубації мМ: 100 NaCl, 20 KCl, 5 MgCl2, 0,5 ЕДТА, 5 · 10-7 М SDS, 50
Трис-НСl, 5 АТФ, рН 7,4. Кількість неорганічного фосфату, що виділився в
процесі ферментативної реакції, визначали за методом Rathbun, Betlach
[1969]. Активність мембранозв’язаних ферментів виражали у нмоль Рн/мг
білка ( хв.
Для вивчення жовчосекреторної функції печінки in situ у щурів після
лапаротомії канюлювали загальну жовчну протоку і через 20 хв реєстрували
вихідний рівень жовчовиділення. Після цього у воротну вену впродовж
наступних 20 хв інфузували 1 мл розчину гетерополіядерної комплексної
сполуки у концентрації 5·10-6 М.
Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної
статистики [Плохинский, 1978]. Математичну обробку експериментальних
результатів проводили з використанням програм статистичного пакету
аналізу даних Microsoft Excel. Для визначення вірогідних відмінностей
між середніми величинами використовували критерій Стьюдента (t).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Мембранотропна активність гетерополіядерних комплексних сполук. При
дослідженні взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co
(III) з діетаноламіном з мономолекулярними ліпідними мембранами
встановлено, що галогенідні гетерополіядерні сполуки (CCl, CBr, CI) не
викликають значних змін двовимірного тиску та граничного стрибка
потенціалу мономолекулярних ліпідних мембран. Найвищу мембранотропну
активність проявляють тіоціанатна (СNCS) та ацетатна (САс) сполуки,
збільшуючи поверхневий тиск до 6,5 мН/м.
При дослідженні дії гетерополіядерних комплексних сполук на БЛМ
встановлено, що модифікація ліпідної мембрани хлоридною сполукою (СCl)
в концентрації 10-10 – 10-5 М призводить до зростання електричної
провідності та
ємності БЛМ максимально на 20% (p.?UeP H* Vтруктуру і функції мембран. Одним з найбільш чутливих показників впливу біологічно активних речовин ендогенного і екзогенного походження на стан ПМ клітини є зміна активності мембранозв’язаних ферментів. Враховуючи цей факт, що всі досліджувані нами гетерополіядерні комплексні сполуки характеризуються різним ступенем мембранотропності, для вивчення впливу речовин на активність мембранозв’язаних ферментів ми вибрали речовини з найбільш вираженою мембранотропністю – тіоціанатна сполука (СNCS) та з найменшою – хлоридна (CCl) та бромідна (CBr) сполуки. У немодифікованих гетерополіядерними сполуками мембранах гепатоцитів середнє значення екто-АТФазної активності складає 99,1(9,7 нмоль Рн/хв(мг білка. Хлоридна сполука (CCl) в концентрації 10-9-10-7 М практично не викликає достовірних змін екто-АТФазної активності ПМ гепатоцитів. При мікромолярних концентраціях досліджуваної речовини ферментативна активність знижується на 20%, максимальний ефект речовини спостерігається при концентрації 10-4 М – активність спадає на 70% (p
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
