.

Роль опіоїдних пептидів в модуляції імунної відповіді хворих на дисциркуляторну енцефалопатію у віддалений період після опромінення (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
131 3977
Скачать документ

АКАДЕМІЯ медичних НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

Голярник Наталія Анатоліївна

УДК: 577.112.6: 612.017: 616.831: 616–001.28

Роль опіоїдних пептидів в модуляції імунної відповіді хворих на
дисциркуляторну енцефалопатію у віддалений період після опромінення

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Базика Дмитро Анатолійович,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України, завідувач відділу клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Чоботько Григорій Михайлович,

Інститут експериментальної радіології Наукового центру радіаційної
медицини АМН України, завідувач лабораторії радіаційної цитології;

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор
Лісяний Микола Іванович, Інститут нейрохірургії ім.
А.П. Ромоданова АМН України, завідувач відділу нейроімунології.

Провідна установа:

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний
факультет, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “ 07 ” березня 2006 р. о 1200
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового
центру радіаційної медицини АМН України, 03115, м. Київ, просп.
Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини АМН України, 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий “ 07 ” лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук _______________________ Л. О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед багатьох дискусійних проблем сучасної
радіобіології невизначеними залишаються питання про характер змін в
імунній системі (ІС), їх наслідки та значення для розвитку соматичної
патології.

Факт високої радіочутливості імунокомпетентних клітин [Рябухин Ю.С.,
2000; Иванов А.А. и др., 2001] значною мірою визначає активну участь ІС
як у патогенезі пострадіаційного відновлення, так і у формуванні
віддалених наслідків променевих уражень. Після аварії на Чорнобильській
атомній електростанції (ЧАЕС) імунологічний моніторинг постраждалих
контингентів показав наявність нестохастичних ефектів в ІС. Комбінований
набутий імунодефіцит раннього поставарійного періоду, протягом 3–5
років, змінився періодом розвитку компенсації радіаційного ураження із
формуванням радіаційноіндукованої соматичної та психоневрологічної
патології [Нягу А.И., Логановский К.Н., 1998; Чумак А.А. и др., 2004];
однак повної нормалізації імунологічної реактивності, навіть майже через
20 років після аварії, не встановлено. У віддалений період після
опромінення у значного контингенту потерпілих зберігається дисбаланс
морфофункціонального стану ІС, у більшій мірі вираженого дефіцитом
тимусзалежної ланки, що супроводжується змінами поверхневих структур,
субпопуляційної організації, проліферації та функціональної активності
Т–лімфоцитів [Баєва О.В. та ін., 2000; Bebeshko V. et al., 2000; Мельнов
С.Б., 2004; Климова Е.М., Дроздова Л.А., 2005]. Більшість дослідників
схильні пов’язувати виявлені зміни як провідний показник впливу радіації
[Akiyama M. et al. 1991; Baranov A.E. et. al., 1995; Titov L.P. et al.,
1995], інші припускають конкурентний вплив факторів нейроендокринної та
психічної природи [Литвиненко Н.В., 2000; Нікольський І.С., 2000;
Лісяний М. І., Любич Л.Д., 2001; Логановский К.Н., 2001].

Особливу увагу привертають контингенти із сформованою імунозалежною
патологією центральної нервової системи (ЦНС), що розвинулась після
опромінення. Передусім, це обумовлено високою поширеністю та тяжкістю
перебігу психоневрологічних, зокрема, цереброваскулярних розладів,
дисциркуляторної енцефалопатії (ДЕП) в учасників ліквідації наслідків
аварії (УЛНА) на ЧАЕС [Литвиненко Н.В., 2000; Логановский К.Н., 2000;
Грицай Н.М. та ін., 2002]. З іншого боку, зумовлено загальновизнаним
уявленням про тісний, багатоланцюговий зв’язок між ЦНС та імунітетом, а
також значенням гуморальних чинників в нейроімунній регуляції [Weigent
D.A., Blalock J.E., 1995; Крыжановский Г.М., 1999; James D.E., Nijkamp
F.P., 2000; Engelsma M.Y. et al., 2002; Степаненко І.В., 2004]. З огляду
на це, вивчення регуляторних властивостей опіоїдних пептидів (ОП) може
бути перспективним напрямком у вирішенні патогенезу змін імунологічного
статусу та психоневрологічних розладів у віддалений період після
опромінення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є
самостійним завершеним комплексним науковим дослідженням. Дисертацію
виконано у відділі клінічної імунології Інституту клінічної радіології
(ІКР) Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України у
структурі науково–дослідних робіт (НДР) відділу клінічної імунології ІКР
НЦРМ АМН України. Дисертант був співвиконавцем наступних НДР:

1999–2001 рр. НДР на замовлення Міністерства України з питань
надзвичайних ситуацій у справах захисту населення від наслідків
Чорнобильської катастрофи (МНС), договір № 17/11 Н–99., шифр №308
“Вивчення закономірностей виникнення, механізмів розвитку та
особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у
постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи
лікувально–реабілітаційних заходів, первинної і вторинної профілактики
патологічних станів”, № держреєстрації 0199U003595; підтема “Вивчити
імунологічні аспекти формування природного перебігу і реабілітації
хворих на енцефалопатії у віддаленому поаварійному періоді”.

2001р. НДР на замовлення МНС, договір № 17/3 В–2001., шифр №338
“Впровадження методів обстеження, діагностики та лікування осіб, які
постраждали внаслідок Чорнобильської катастрофи”, № держреєстрації
0101U006644; підтема “Впровадити імунологічні критерії зв’язку
дисциркуляторної енцефалопатії з впливом іонізуючого випромінювання у
постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС”.

2001–2003 рр. НДР на замовлення АМН України, шифр № 328 “Вивчити
механізми алергічного запалення при формуванні імунозалежної соматичної
патології у учасників ліквідації наслідків Чорнобильської аварії”, №
держреєстрації 0101U001451.

Мета дослідження. Встановити особливості регуляторного впливу б– та
в–ендорфінів на субпопуляційну організацію та функціональну активність
лімфоцитів у хворих на дисциркуляторну енцефалопатію у віддалений період
після опромінення.

Завдання дослідження.

Дати характеристику імунної реактивності хворих на ДЕП у віддалений
період після опромінення.

Визначити особливості спонтанної та мітоген–залежної активації
лімфоцитів у хворих на ДЕП у віддалений період після променевого
ураження залежно від дози опромінення.

Визначити in vitro особливості проліферативної активності
імунокомпетентних клітин периферичної крові за розподіленням лімфоцитів
по фазах клітинного циклу спонтанно та при мітогенній активації у хворих
на ДЕП в залежності від дози опромінення.

Дослідити in vitro вплив б– та в–ендорфінів на субпопуляційну
організацію лімфоцитів хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення.

Дослідити in vitro вплив б– та в–ендорфінів на процеси спонтанної та
мітоген–залежної активації лімфоцитів хворих на ДЕП у віддалений період
після опромінення.

Дослідити in vitro блокуючий ефект антагоніста опіоїдних рецепторів (ОР)
– налоксона на регуляцію ендорфінами субпопуляційної організації та
процесів активації лімфоцитів у хворих на ДЕП в залежності від дози
опромінення.

Об’єкт дослідження. УЛНА на ЧАЕС, опромінені в діапазоні доз 0,25 – 3,8
Зв, хворі на ДЕП.

Предмет дослідження. Реакції імунної системи на регуляторні стимули
опіоїдних пептидів в УЛНА на ЧАЕС, хворих на ДЕП, у віддалений період
після опромінення.

Методи дослідження. Цитофлуориметричні – визначення субпопуляційного
складу імунокомпетентних клітин та експресії поверхневого фенотипу
лімфоцитів у прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі
моноклональних антитіл серії Leu, Simultest ІМК Plus (Becton Dickinson,
США); серологічні – визначення рівнів сироваткових імуноглобулінів
основних класів (IgA, IgG, IgM); концентрації дрібно– та
великодисперсних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК); культуральні –
мітоген–індукована активація та проліферація лімфоцитів; вплив
ендорфінів на субпопуляційну організацію та процеси спонтанної і
мітоген–залежної активації імунокомпетентних клітин у короткочасовій
культурі лімфоцитів; статистичні – параметричні критерії; варіаційний та
регресійно–кореляційний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено у віддаленому
періоді після опромінення в інтервалі доз 0,25 – 3,8 Зв модулюючий вплив
б– та в–ендорфінів на структурнофункціональний стан лімфоцитів людини.
Доведено залежність від дози опромінення змін імунологічних показників
субпопуляції Т–лімфоцитів при імунологічній недостатності у хворих на
ДЕП. Із збільшенням дози опромінення виявлено зниження числа CD3+, CD4+
клітин та коефіцієнту CD4+/CD8+, що призводить до ускладнення
імунопатологічного стану та розвитку дефіциту Т–ланки ІС.

Встановлено, що у віддалений період після опромінення зберігаються
дозозалежні зміни експресії активаційних антигенів імунокомпетентних
клітин та розподілу лімфоцитів по фазах клітинного циклу. У хворих на
цереброваскулярну патологію після опромінення в дозах 0,25 – 0,9 Зв
встановлено накопичення лімфоцитів у G1–фазі із блокуванням виходу
клітин у S–фазу синтезу ДНК та прояви ендогенної активації за
підвищенням кількості Т–клітин з високою спонтанною експресією CD25
антигенів. У опромінених дозами понад 1 Зв поряд із збільшенням
кількості лімфоцитів з пошкодженою ДНК встановлено зниження експресії
маркерів HLA–DR, CD25, CD71 та кількості активованих Т–лімфоцитів, що
після стимуляції мітогеном змінюється надмірним виходом клітин у
мітотичний цикл.

Вперше у хворих на ДЕП реконвалесцентів гострої променевої хвороби (ГПХ)
встановлено зниження відповіді Т–лімфоцитів на ендорфіни з інвертованою
реакцією на всіх стадіях активаційного процесу та зменшенням експресії
активаційних молекул. Визначені особливості комбінованої дії мітогену та
ендорфінів в умовах застосування блокатору ОР налоксону.

На підставі аналізу та узагальнення отриманих результатів комплексного
клініко–імунологічного дослідження підтверджено дані щодо пошкодження
Т–ланки ІС у віддалений період після опромінення. Набула подальшого
розвитку концепція про формування імунопатологічних станів у хворих ДЕП,
що розвинулась після опромінення [Литвиненко Н.В, 2000; Лісяний М.І.,
Любич Л.Д. 2001; Грицай Н.М. та ін., 2002; Степаненко І.В, 2004].

Встановлено кількісні параметри змін імунологічної реактивності у хворих
на ДЕП незалежно від дози опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Визначені закономірності
реактивності імунокомпетентних клітин та опіоїдної регуляції функцій ІС
мають суттєве значення у розумінні розвитку імунодефіцитних станів у
віддалений період після опромінення.

Факт зниження відповіді на ОП після опромінення дещо пояснює патогенез і
патоморфоз ДЕП, що розвинулась після променевих уражень, а також
зловживання психоактивними речовинами (швидке зниження толерантності,
формування залежності до алкоголю і бензодіазепінів), можливо –
аферентних розладів і шизофренії. Одержані результати сприятимуть
удосконаленню патогенетичної терапії даних розладів не лише у клініці
радіаційної медицини, але і у психіатрії.

Розроблені в дисертаційній роботі імунологічні підходи до вивчення стану
ІС увійшли до складу методології імунологічного дослідження осіб, які
зазнали впливу радіації внаслідок аварії на ЧАЕС, і впроваджені в
практику роботи відділу клінічної імунології ІКР НЦРМ АМН України.
Результати, одержані при виконанні роботи, включено до доповнень,
надісланих НЦРМ АМН України до розділу 13 “Immunological Effects on
Health” звіту Чорнобильського форуму експертної групи “Здоров’я” ООН
“Health Effects of the Chernobyl Accident and Special Health Care
Programmes”, матеріалів НЦРМ АМН України до Парламентських слухань у
Верховній Раді України “Вісімнадцята річниця Чорнобильської катастрофи.
Погляд у майбутнє”.

Запропоновано практичні рекомендації імунологічного обстеження хворих на
ДЕП з включенням параметрів клініко–імунологічного скринінгу,
лабораторної діагностики, визначення специфічних клітинних реакцій на
ОП, що дозволить оцінити імунологічне розпізнавання, активацію,
проліферацію, а також диференціацію імунокомпетентних клітин та
підвищить ефективність лікування цереброваскулярних розладів. Розроблено
новий спосіб діагностики стану імунної системи: пат. 74321 А Україна,
МПК 7 G01N33/53 Д.А. Базика, Н.В. Бєляєва, Н.А. Голярник; НЦРМ АМН
України.– № 2003119896; Заявл. 04.11.03; Опубл. 15.11.05, Бюл. №11.– 4.3
с.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено аналіз попередніх наукових
літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність
дослідження, його мета і задачі, сформовано групи спостереження.
Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано і відібрано
методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів та
структуру бази даних. Самостійно проведено імунологічне обстеження
відібраних контингентів, культуральні та цитофлуориметричні дослідження:
імунофлуоресцентний аналіз субпопуляційного складу імунокомпетентних
клітин; процесів спонтанної та мітоген–залежної активації лімфоцитів;
регуляторних впливів ОП. Заповнена база даних, проведений статистичний
аналіз та інтерпретація отриманих результатів.

Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів,
створення ілюстрацій та формування висновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені у
доповідях на національних і міжнародних науково–практичних конференціях
та конгресах: Міжнар. конф. “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи:
підсумки 15–річних досліджень” (Київ, 2001); Міжнар. конф. “П’ятнадцять
років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання” (Київ, 2001);
Науково–практ. конф. молодих вчених ІКР НЦРМ АМН України, присвяченій
15–ти річчю Чорнобильської катастрофи (Київ, 2001); Науково–практ. конф.
з нагоди 15–ти річчя створення відділу клінічної імунології НЦРМ АМН
України (Київ, 2002); ІІІ–му з’їзді з радіаційних досліджень України
(Київ, 2003); Школі–семінарі ІКР НЦРМ АМН України “Актуальные вопросы
проточной цитометрии” (Київ, 2003); European Respiratory Society
Congress (Glasgow, Scotland, 2004); Науково–практ. конф. молодих вчених
та спеціалістів “Актуальні проблеми радіаційної медицини та
радіобіології” НЦРМ АМН України (Київ, 2005); VII Укр. науково–практ.
конф. з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології,
алергології та імунореабілітації (Київ, 2005).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 16 наукових праць;
із них: 5 статей у фахових виданнях (у тому числі – 1 за кордоном), 1 –
розділ, складова частини монографії (англійською мовою), 1 –
деклараційний патент на винахід, 9 тез доповідей (у тому числі – 2 за
кордоном).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6
розділів основної частини (аналітичний огляд літератури, матеріал та
методи, три розділи результатів власних досліджень, аналіз і
узагальнення результатів досліджень) висновків, практичних рекомендацій
та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 39
таблицями і 42 рисунками. Повний обсяг дисертації – 183 сторінки, із них
157 сторінок складає основна частина. Список літератури викладений на 26
сторінках та містить 245 джерел (119 кирилицею, 126 латиницею).

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В дисертації узагальнено результати
дослідження хворих на ДЕП (МКХ–10 167.8; F07.3). Обстежено 186 осіб
чоловічої статі; із них 103 УЛНА на ЧАЕС, опромінених в діапазоні доз
від 0,25 до 3,80 Зв; 53 хворих на ДЕП, доза опромінення яких не
перевищувала межі природного фону, та 30 практично здорових осіб. Хворі
перебували на лікуванні у клінічних відділеннях НЦРМ АМН України.
Клінічний діагноз та стадію захворювання ДЕП встановлено у відділі
радіаційної психоневрології ІКР НЦРМ АМН України. Аналіз клінічних
проявів ДЕП, органічного ураження головного мозку проводили з
використанням діагностичних критеріїв та класифікацій, які застосовують
у відділі радіаційної психоневрології ІКР НЦРМ АМН України та викладено
у методичних рекомендаціях [Нягу А.И. и др., 1998; Логановський К.М. та
ін., 2005].

В залежності від індивідуальної дози опромінення, наведеної у офіційних
документах, досліджувані були розподілені на три групи:

Хворі на ДЕП, опромінені в межах природного фону – нозологічний
контроль. Вік обстежених складав у середньому 47,9 ± 0,84 р.

Хворі на ДЕП УЛНА на ЧАЕС, які знаходились у 30–ти кілометровій зоні
ЧАЕС з квітня по грудень 1986 р. Вік обстежених 46,5 ± 0,78 р. Дози
опромінення в межах 0,25 – 0,9 Зв та у середньому складали 0,5 ± 0,32
Зв. У період відновлення після опромінення жоден з обстежених не мав
гематологічних ознак кістково–мозкового синдрому.

УЛНА на ЧАЕС, які у 1986 році перенесли ГПХ I–III ступеню тяжкості,
хворі на післярадіаційну енцефалопатію [Нягу А.И. и др., 1998]. Вік
обстежених 51,6 ± 1,41 р. Дози опромінення, за даними визначення
хромосомних аберацій, становили 1,0 – 3,8 Зв та у середньому 1,7 ± 0,12
Зв. Умови опромінення, питання перебігу та лікування кістково–мозкового
синдрому детально описані в оглядах [Гуськова А.К и др. 1987;
Киндзельский А.С. и др., 2002].

Практично здорові особи без функціональних і органічних порушень ЦНС –
контрольна група. Вік обстежених у середньому складав 41,7 ± 1,07 р.
Пацієнти не піддавались впливу іонізуючого випромінювання, що перевищує
значення природного радіаційного фону.

Клініко–імунологічне дослідження проводили як складову частину
комплексного обстеження хворих, що використовують в ІКР НЦРМ АМН
України. Обстеження проведене у період 2000–2004 рр.

Більшість обстежених до аварії на ЧАЕС були практично здорові. Спектр
хронічної соматичної і психоневрологічної патології в УЛНА на ЧАЕС був
сформованим в перші 6 років після аварії. Хронічну патологію органів
дихання (хронічний бронхіт) реєстрували у 29% осіб з ГПХ в анамнезі; у
групі досліджуваних, дози опромінення яких не перевищували 1 Зв – у 22%
осіб; у першій групі хронічний бронхіт виявили у 32% осіб. Захворювання
системи травлення у реконвалесцентів ГПХ виявили у 60% осіб, у другій
групі дану патологію спостерігали у 32% обстежених, у групі
нозологічного контролю – у 26% осіб. Серцево–судинну патологію
(гіпертонічна хвороба, ішемічна хвороба серця) – виявили у 51%
обстежених. Аналіз даних загальноклінічного обстеження хворих не виявив
суттєвих відмінностей у частоті вказаних патологічних станів між
групами. Таким чином, вплив параметрів загального стану та супутньої
патології на ІС в усіх групах можна вважати рівноцінним.

Дослідження імунного статусу проводили за рекомендаціями по обстеженню
осіб, які постраждали від дії іонізуючої радіації [Чумак А.А. та ін.,
1991, 1998]. Концентрацію імуноглобулінів основних класів у сироватці
крові визначали за методом Manchini G. et al. (1965). Визначення рівнів
ЦІК проводили методом селективної преципітації у градієнті
поліетиленгліколю з фотометричним визначенням щільності преципітату
[Гашкова В. и др., 1987]. Субпопуляційний склад лейкоцитів та експресію
поверхневих антигенів визначали методом протічної цитофлуориметрії у
прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних
антитіл (МКАТ) серії Leu фірми Becton Dickinson (BD) методом дво– та
трьохкольорового аналізу. Використовували комбінації МКАТ з метою
визначення антигенів CD45/CD14 – диференціювання лімфоцитів, моноцитів
та гранулоцитів; CD3/CD19 – визначення загальної кількості Т– та
В–клітин; CD4/CD8 – оцінки регуляторних субпопуляцій Т–лімфоцитів;
CD3/HLA–DR – виявлення стабільних Т–клітин та активних Т– і В–клітин;
CD3/CD16CD56 – оцінки цитотоксичних Т–лімфоцитів (ЦТЛ) та природних
кілерів (ПК). Контролем були мікросфери “CaliBRITE” (BD), помічені
відповідно флуоресцеїну ізотіоціанатом (FITC) чи фікоеретрином (РЕ), та
МКАТ до імуноглобулінів миші IgG1 – FITC / IgG2a – PE.

Кров відбирали з ліктьової вени у пробірки, що містили гепарин в
концентрації 20 од/мл. На дно пластикової пробірки вносили 10 мкл МКАТ
та 50 мкл цільної периферичної крові. Змішували протягом 3 с на вортексі
та інкубували при температурі 27?С, 20–30 хв у темряві. Для лізису
еритроцитів використовували Lysing Solution (BD).

Цитофлуориметричний аналіз проводили у лінійному режимі підсилення для
показників прямого (FSC) і бокового (SSC) світлорозсіювання та у
логарифмічному для показників флуоресценції FITC (FL–1) та РЕ (FL–2).
Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флуоресценції складали 0,9%
для FL–1 та 17,2% для FL–2. Дослідження здійснювали на лазерному
протічному цитофлуориметрі FACScan (BD) з аргоновим лазером (довжина
хвилі 488 нм). Математичну обробку первинних даних проводили у програмі
LYSYS II.

Активацію лімфоцитів оцінювали за кількістю клітин, що експресують
маркери активації (МА) – рецептори до ІЛ–2 (CD25), рецептори до
трансферину (CD71) та антигени гістосумісності ІІ класу (HLA–DR).
Досліджували спонтанну експресію МА, здатність лімфоцитів in vitro
відповідати на мітоген (за підвищенням вмісту клітин, що експресують МА)
та вплив ОП на процес мітоген–залежної активації. Коефіцієнти активації
(КА) обчислювали окремо для кожного МА як відношення відсотку клітин, що
експресують МА після інкубації з мітогеном, до відсотку клітин, що
експресують МА спонтанно. Для індукції активації та проліферації
лімфоцитів використовували класичний мітоген – Конканавалін А (Кон А) у
концентрації 5 мкг/мл [Ярилин А.А., 1999; Lazda V., Baram P., 1974].

Мононуклеари виділяли з периферичної крові в одноступеневому градієнті
фікол–верографіну (d = 1,076–1,078 г/мл). Суспензію мононуклеарів
периферичної крові (МПК) готували у концентрації 5 х 106 клітин/мл у
повному живильному середовищі на основі RPMI–1640 (“SIGMA”, США),
L–глутаміну – 300 мкл/мл, гентаміцину – 60 мкг/мл (“PHARMACHIM”,
Болгарія), HEPES (“SIGMA”, США). В об’ємі 200 мкл МПК інкубували 24 год
з Кон А при 37?С в присутності СО2 .

З метою визначення впливу фізіологічних концентрацій ОП на лімфоцити та
процеси мітоген–індукованої активації МПК до суспензії клітин додавали
б–ендорфін М 10–6 та в–ендорфін М 10–8 (“SIGMA”, США); паралельно
проводили інкубацію МПК з ендорфінами та налоксоном М 10–6 (“SIGMA”,
США). МПК центрифугували (200g) 5 хв у 2 мл забуференого фосфатами
фізіологічного розчину (ЗФР), відбирали супернатант, ресуспендували у 20
мкл ЗФР та кон’югували з МКАТ до кластерів диференціації – CD3, CD4,
CD25, CD71– FITC і CD19, CD8, CD16, CD56, HLA–DR – РЕ.

Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів використовували метод
розподілення клітин за фазами клітинного циклу [Пинегин Б.В., 2001].
Пермеабілізацію клітинної мембрани МПК проводили з використанням
Permeabilizing Solution за рекомендаціями фірми виробника (BD).
Зафарбовували пропідій йодидом в концентрації 5 мкг/мл, інкубували 20 хв
у темряві. При цитофлуориметрії реєстрували червоний спектр
флуоресценції (FL–2) пропідій йодиду для 50 000 клітин, визначали
процент диплоїдних клітин (фази G0/G1), процент клітин у S– та
G2+M–фазах.

Статистичний аналіз проводили за рекомендаціями [Бююль А. и др., 2002;
Лапач С.Н. и др., 2002; Сигел Э., 2004]. Обробку та презентацію
статистичних даних за параметричними критеріями, варіаційний та
регресійно–кореляційний аналіз здійснювали в електронних таблицях SPSS
V. 10.05 у середовищі Microsoft Windows.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень. Проведені в УЛНА на ЧАЕС
дослідження субпопуляційного складу лімфоцитів та показників
гуморального імунітету дозволили охарактеризувати стан імунної
реактивності хворих на ДЕП та виявити типові порушення в ІС у віддалений
період після опромінення.

Аналіз показників загальної популяції Т–лімфоцитів у хворих на ДЕП
опромінених у дозах понад 1 Зв, показав наявність Т–клітинного дефіциту.
Встановлено зниження середньогрупових значень процентного вмісту і
абсолютної кількості СD3+ клітин (p ? 0,01, p ? 0,05). У 58% хворих на
ДЕП, які потерпіли від ГПХ, виявлено зниження експресії CD3 рецептору,
що може служити доказом прихованого дефекту Т–ланки ІС. Встановлено
негативну кореляцію дози опромінення та відсотку СD3+ (r = –0,270; p 2,2) визначено у 5,5%. Частотний аналіз показав
превалювання зниженого імунорегуляторного коефіцієнту ( 1 Зв

(n=50)

M±SD

CD4+8–

Т–хелпери % 42,7±1,16 41,6±1,11 38,5±1,03** 38,1±1,12**

Г/л 0,8±0,03 0,9±0,04 0,8±0,05* 0,7±0,04**

CD8+4–

Т–супресори % 29,3±0,90 28,1±1,01 33,1±1,25** 31,3±0,87**

Г/л 0,6±0,02 0,6±0,03 0,7±0,03 0,6±0,03**

CD4+/CD8+

1,5±0,08 1,6±0,09 1,3±0,07** 1,3±0,06**

Примітка.

*, ** – вірогідність розбіжностей з показниками контрольної групи p 30). У групі
нозологічного контролю концентрація ЦІК 4,16% достовірно відрізняється
від такої у контрольній групі (р ? 0,05). У більшості випадків це
пов’язано з наявністю хронічної патології, що сприяє утворенню ЦІК, які
з урахуванням механізмів рециркуляції можуть призвести до формування
імунокомплексного синдрому та обтяжити перебіг захворювання.

Аналіз спонтанної та мітогенної активації лімфоцитів виявив, що у хворих
на ДЕП, розвиток патології супроводжується зниженням CD4–25+
Т–супресорів (p

@

l

n

O

??

???????&

>

@

l

n

:^`?? OeE

I

I

o

o

oe

iaeiaI???????{I?e????{????TI??T h

h

* h

h

h

h

Ra@?uyCJ aJ , h

h

$ h

h

2 h

h

h

h

h

h

– OE

I

I

o

oe

??????

???

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

?

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

H0K|K~KtNxNzN|N?N„N†N?N?N¶N?N1/4N3/4NANAeNAENENeQeQiQ6R8ReO?O?OeOeOeOeOe
O??¤–???–???¤v¤o¤v¤o¤vh¤v

h

Ra@?uyH*

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

yyyy

h

Ra@?uyH*

h

h

h

h

h

h

h

I,Iooooooooooiiiiiooooooooooa

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

ss6ss8ssbssdsshssjsslssnsspssaessess?ssoss>a@aDaFaneUeUEeU1/2UeUe1/2U1/2
Ue1/2e1/2e1/2eU1/2UeUe1/2U1/2Ue1/2e1/2e1/2E1/2e?e?eEeUeE1/2eYeYeEeUeE1/2
e h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

e
eoeeueetheeFeLeNeRenereteve1/4eAeAeAeeEeIe?eneUeNeAe?®¤?¤?¤®?®“®“®“®?®“®
“®“®?®“®“®?®?®?®?®?®?®“®?®“?®?

h

h

h

h

Ra@?uy h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

h

???????? ??????????????

ooeaoeoooeoeoeoooooeoooooeooeoeooeaoeoooeooeoeooeoeoooeoeaoeoeoeoeoeoeoo
eoeoooeooooooo

h

h

h

Ra@?uy

h

h

h

h

h

h

h

h

Ra@?uyB*phH–100, нейроспецифічною енолозою (НСЕ) та ін. Факт підвищення
концентрації антигенів мозку та рівню антитілоутворення до НСБ у
периферичній крові УЛНА на ЧАЕС хворих на ДЕП описано у роботах [Лісяний
М.І., Любич Л.Д., 2001; Степаненко В.І., 2004]. Поряд з цим, у хворих на
ДЕП встановлено тенденцію до зниження популяції CD3–16+56+ ПК, активних
головним чином до вірусінфікованих та пухлинних клітин. Зміни у
кількісному складі, а саме – зменшення CD3–16+56+ клітин–ефекторів
корелює з послабленням контролю за ростом пухлин. Надлишок преципітатів
ЦІК, що відмічається у хворих на ДЕП, може викликати феномен імунної
блокади цитопатогенної дії кілерної активності та призводити до
загострення запального процесу.

Встановлено внесок радіаційного фактору у процес формування
імунологічної реактивності при ДЕП. Серед УЛНА за показниками середніх
та абсолютних значень реєстрували зниження відсотку CD4+8– клітин
Т–хелперів та підвищення рівню CD8+4– клітин Т–супресорів. Відношення
регуляторних субпопуляцій знаходиться на нижній межі норми і є
достовірно зниженим у порівнянні з контрольною групою (p ? 0,01). У
реконвалесцентів ГПХ реєстрували зменшення пулу загальної популяції
Т–лімфоцитів до 51,1% та помітне зниження експресії CD3 рецептору. У цій
групі виявлено найбільшу кількість осіб із зниженням активації
Т–лімфоцитів, хоча зменшення кількості CD3+HLA–DR+ активованих клітин
відмічається у всіх групах спостереження з ДЕП. Зниження активації
Т–лімфоцитів встановлено як у хворих на ДЕП з дозами опромінення до 1
Зв, так і у осіб, які не зазнали радіаційного впливу, але у останніх
такий стан реєструється у меншої кількості хворих. У опромінених осіб
хворих на ДЕП, як і у групі нозологічного контролю, також має місце факт
можливої сенсибілізації організму, на що вказує збільшення кількості
ЦТЛ. Відмічається підвищення як процентного так і абсолютного вмісту
клітин з фенотипом CD3+16+56+; в осіб з дозами опромінення до 1 Зв даний
показник виходить за межі нормальних значень.

Наведені дані вказують на те, що у хворих на ДЕП, які перенесли ГПХ або
були опромінені у дозах близьких до тих, що викликають ГПХ, а також у
значної кількості осіб, опромінених в межах малих доз, у віддалений
період після опромінення зберігається пригнічення Т–хелперної ланки ІС
на тлі підвищення пропорції ЦТЛ. Встановлене зниження функціональної
активності із зменшенням відповіді лімфоцитів на дію специфічних та
неспецифічних стимуляторів, що може супроводжуватись різноспрямованими
порушеннями ІС – імунодефіцитними станами, аутоімунними процесами. Така
динаміка вивчених показників відображає низькі резервні можливості пулу
клітин та ІС в цілому і може розцінюватись як комбінований тип
імунологічних змін. Радіаційний фактор, у даному випадку, сприяє
загостренню імунопатологічного стану та нейроімунного конфлікту. У ряді
випадків такі пострадіаційні ефекти в ІС класифікують як вторинну
імунологічну недостатність [Чумак А.А. и др., 1994]. Разом з тим, аналіз
трендів змін параметрів ІС свідчить про те, що істотне значення для
динаміки взаємодії нервової та імунної систем має не характер
неврологічних відхилень, а сам факт їх наявності. Можливим поясненням
може бути спільність патогенетичних механізмів аналізованих патологічних
змін, проникнення НСБ, ОБМ, S–100 у периферію [Базика Д.А. та ін., 2000;
Лісяний М.І., Любич Л.Д., 2001; Степаненко В.І., 2004], порушення
метаболізму і рецепції біологічноактивних речовин, які мають імунотропну
активність, в тому числі ендогенних ОП.

Проведено дослідження опіоїд–імунних взаємодій у хворих на ДЕП, що
дозволило охарактеризувати вплив ендорфінів на структурнофункціональну
організацію імунокомпетентних клітин та визначити особливості опіоїдної
регуляції імунної відповіді і процесів активації лімфоцитів.

У хворих на ДЕП (– та (–ендорфіни in vitro впливають на основні
популяції лімфоцитів. Ефект ендорфінів опосередкований переважно за
рахунок зв’язування їх із класичними ОР лімфоцитів.

Ендорфінам властива позитивна імуномодуляція субпопуляційної організації
лімфоцитів. Встановлено відновлення вмісту CD3+ клітин при імунологічній
недостатності віддаленого періоду після опромінення (рис. 2).

У хворих на ДЕП із зниженим вмістом CD3+ лімфоцитів (( 55%) під впливом
фізіологічних концентрацій ОП виявлено достовірне збільшення CD3+ клітин
(р ( 0,01). Різниці між впливом (– та (–ендорфінів не спостерігали.
Налоксон, антагоніст ОР, відміняє дію ендорфінів. Змін експресії CD3
рецептору після інкубації з ендорфінами не визначено.

ОП здійснюють суттєвий модулюючий ефект на регуляторні субпопуляції
Т–лімфоцитів. За середньогруповими показниками у здорових осіб, хворих
на ДЕП та у пацієнтів, опромінених в діапазоні доз від 0,25 – 0,9 Зв,
встановлено достовірне підвищення вмісту Т–хелперів та збільшення
експресії CD4 антигену (р ( 0,05). Кількість Т–супресорів достовірно
знижена лише у контрольній групі; у хворих на ДЕП відмічено тенденцію до
зниження даного показника (табл. 2).

Інтенсивність експресії CD8 молекул на лімфоцитах не змінюється відносно
контрольних значень в усіх обстежених. Попередня інкубація з налоксоном
відміняє регуляторні впливи ОП. За рахунок підвищення експресії CD4
антигену та збільшення кількості Т–хелперів ендорфіни підвищують
CD4+/CD8+ співвідношення.

Аналіз результатів впливу ОП на ЦТЛ та ПК показав зміни переважно у
кількісному складі CD3+16+56+ клітин (р ( 0,05). У хворих на ДЕП із
зниженим вмістом ЦТЛ (( 3%) (– та (–ендорфіни in vitro стимулюють
утворення CD3+16+56+ клітин, а у випадку коли даний показник перевищує
норму (> 8%) виявлено достовірне його зниження. Налоксон відміняє
регуляторний вплив (–ендорфіну. А–ендорфін достовірно (р ( 0,05)
підвищує вихід ПК у здорових осіб на 38,7%. У групі нозологічного
контролю, у хворих з нормальним вмістом CD3–16+56+ клітин, б–ендорфін
збільшує кількість ПК на 46,7%. Поряд із цим, у опромінених з нормальним
вмістом CD3–16+56+ клітин б–ендорфін знижує відсоток ПК, при ДЕП з дозою
опромінення, менше 1 Зв на 32% та, відповідно, при ДЕП з дозою понад 1
Зв на 20,6%. У хворих на ДЕП із зміненими показниками ПК (( 8%; ( 13%),
незалежно від дози опромінення, ОП не впливають на кількість CD3–16+56+
клітин. Флуоресценція специфічних антитіл рецептору ПК після інкубації з
ендорфінами також достовірно не змінюється.

Таблиця 2

Вплив in vitro (– та (–ендорфінів та налоксону на популяції CD4+ і CD8+

лімфоцитів у хворих на ДЕП в залежності від дози опромінення

Дослід Попу

ляція Вміст клітин (%)

Контрольна

група

(n=30)

M±SD ДЕП

(n=53)

M±SD ДЕП ( 1 Зв

(n=53)

M±SD ДЕП ( 1 Зв

(n=50)

M±SD

контроль CD4+ 41,8(2,5 39,7(3,6 35,0(3,5 45,6(3,0

CD8+ 32,7(3,6 30,1(3,7 34,1(3,6 31,1(1,1

(–ендорфін CD4+ 53,7(2,9* 51,0(3,1* 44,3(3,1* 34,1(3,0*

CD8+ 19,5(3,3* 29,2(3,1 28,9(3,1 31,7(1,5

налоксон +

(–ендорфін CD4+ 44,4(2,4 39,8(3,5 35,7(3,6 35,7(3,0*

CD8+ 32,8(3,0 30,0(3,5 34,3(3,5 32,3(1,6

(–ендорфін CD4+ 55,1(2,8* 52,6(3,3* 46,3(3,4* 30,2(2,8*

CD8+ 21,7(2,4* 28,3(3,0 29,2(2,7 31,6(1,6

налоксон +

(–ендорфін CD4+ 45,6(3,4 41,9(3,0 34,9(3,4 34,8(2,8*

CD8+ 30,5(3,1 30,4(3,7 34,3(3,5 32,4(2,0

Примітка.

* – вірогідність розбіжностей з контролем p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020