.

Вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних клітин миші (реферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
155 2856
Скачать документ

Міністерство аграрної політики україни

білоцерківський державний аграрний університет

Медведовська Марина Ігорівна

УДК 636:57.08

Вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних
клітин миші

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Біла Церква – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії клітинної та молекулярної біології
Інституту тваринництва Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: кандидат сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник,

Щербак Олена Валентинівна,

Національний фармацевтичний університет,

доцент кафедри біотехнології

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук,

чл.-кор. УААН, Безуглий Микола Дмитрович,

Українська академія аграрних наук,

віце-президент;

доктор сільськогосподарських наук, професор,

Шеремета Віктор Іванович, Національний аг-

рарний університет, кафедра розведення і гене-

тики тварин ім. М.А. Кравченка

Провідна установа: Інститут експериментальної і клінічної ветеринар-

ної медицини УААН, м. Харків

Захист відбудеться 5 липня 2007 р. о 11 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 27.821.01. у Білоцерківському державному
аграрному університеті за адресою: 09117, Україна. Київська обл.., М.
Біла Церква, Соборна пл. 8/1, ауд. № 99.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Білоцерківського
державного аграрного університету, м. Біла Церква, Соборна пл. 8/1

Автореферат розісланий 4 червня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради
Малина В.В.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Основними напрямами використання тотипотентних клітин
ссавців у новітніх біотехнологіях є створення трансгенних, химерних та
клонованих тварин; медичні дослідження по цілеспрямованої диференціації
цих клітин з їх наступною трансплантацією, а також отримання модельних
тварин для досліджень на молекулярному рівні патогенезу і терапії хвороб
людини (Anderson G.B., 1992; Глик Б., Пастернак Дж., 2002; Безуглий
М.Д., 2002; Forsberg E.J. et al., 2002). Виходячи з цього, вирішення
проблеми проліферації тотипотентних клітин in vitro набуває особливої
актуальності. У якості тотипотентного матеріалу у біотехнологіях
відтворення використовують ембріональні стовбурові клітини та бластомери
ранніх стадій ембріогенезу (Квасницкий А.В. і співавт., 1988; Wilton
L.J., Trounson A.O., 1989; Stice S.L. et al., 1996; Савченкова И.П.,
1997; Turksen K., 2002).

На сьогоднішній день визначено загальний принцип отримання та
культивування тотипотентних клітин ссавців. Проте, існують розбіжності
щодо факторів, які є вирішальними при отриманні та культивуванні
тотипотентних клітин in vitro з підтриманням їх недиференційованого
стану. Для розробки нових та удосконалення існуючих методів
біотехнології тотипотентних клітин ключовим підходом є використання
матеріалу модельних тварин. Це робить актуальним та доцільним проведення
досліджень, спрямованих на оптимізацію методів і умов отримання та
культивування тотипотентних клітин миші.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну
роботу було виконано протягом 2001 – 2006 рр. у рамках тематичного плану
Харківського біотехнологічного центру УААН та відділу біотехнології
репродукції сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН.
Здобувачка була виконавцем за темами: „Розробити для цілей новітніх
біотехнологій ефективні методи отримання та культивування поза
організмом тотипотентних клітин ссавців” (№ держреєстрації 0101U003378)
та „Розробити та удосконалити ембріоінженерні методи отримання
реконструйованих ембріонів і молекулярно-генетичні підходи для
застосування у відтворенні та селекції сільськогосподарських тварин” (№
держреєстрації 0106U007896).

Мета та завдання досліджень. Мета даної роботи – оптимізація умов
отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні завдання:

1. Удосконалити методи і умови отримання, а також довгострокового
культивування ембріональних фібробластів миші, як однієї з передумов
оптимізації культивування тотипотентних клітин ссавців.

2. Виявити технологічні фактори, що є суттєвими для отримання та
культивування тотипотентних клітин миші.

3. Підвищити ефективність отримання та довгострокового пасування
ЕС-подібних клітин миші.

4. Визначити вплив стадії розвитку ембріонів миші на потенційну
здатність до ізоляції та подальшої проліферації in vitro тотипотентних
бластомерів.

5. Удосконалити на рівні розробки модифікованого методу умови
культивування тотипотентних бластомерів миші.

Об’єкт досліджень – ембріони миші, ізольовані бластомери миші,
ЕС-подібні клітини миші, ембріональні фібробласти миші.

Предмет досліджень – вплив технологічних чинників на отримання та
культивування тотипотентних клітин миші.

Методи досліджень. Хірургічний метод виділення доімплантаційних та
пізніх ембріонів миші. Метод хімічної дебластомерізації ранніх
ембріонів. Метод механічної дезагрегації ембріональних тканин. Метод
трипсинізації ембріональних тканин та клітин. Метод оцінки клітин на
життєздатність. Метод визначення концентрації клітин у суспензії. Методи
культивування бластомерів, доімплантаційних ембріонів, ембріональних
фібробластів, клітин внутрішньої клітинної маси ембріонів, ЕС-подібних
клітин та ембріоїдних тіл миші. Морфологічний аналіз. Світлова
мікроскопія. Статистичний метод обробки результатів експериментів.

Наукова новизна роботи. Вперше застосовано комплексний підхід для
визначення ключових факторів, що впливають на отримання та розвиток in
vitro всіх типів клітин, які мають потенційні тотипотентні здібності.
З’ясовано основні фактори, що впливають на успіх при отриманні та
культивуванні ембріональних фібробластів миші. Модифіковано методи
трипсинізації для отримання та пасування ембріональних фібробластів та
ЕС-подібних клітин миші. Запропоновано метод стабільного отримання та
культивування ЕС-подібних клітин миші. Експериментально доведено та
теоретично обґрунтовано доцільність використання моношару ембріональних
фібробластів миші для культивування ізольованих тотипотентних
бластомерів миші. Накопичено ілюстративний матеріал, що послідовно
відображає всі стадії розвитку ембріональних фібробластів, ЕС-подібних
клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші у культурі.

Практичне значення отриманих результатів. Основні результати досліджень
можуть стати базою для розробки новітніх біотехнологічних методів
відтворення ссавців та створення принципово нових медичних засобів.
Отримані результати можуть бути використані біологічними, медичними,
фармацевтичними та біотехнологічними лабораторіями для отримання культур
ембріональних фібробластів, тотипотентних бластомерів та ЕС-подібних
клітин. Розроблені методичні та технологічні підходи, а також
накопичений ілюстративний матеріал можуть бути використані у курсах
лекцій відповідних спеціальностей вищих учбових закладів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачкою самостійно проведено аналіз
джерел літератури, експерименти з отримання та культивування
ембріональних фібробластів миші, ЕС-подібних клітин миші та ізольованих
бластомерів миші, морфофункціональну оцінку ембріональних фібробластів,
ЕС-подібних клітин, ембріонів та бластомерів. Здобувачкою самостійно
проведено узагальнення, статистична обробка експериментальних даних, їх
трактування й обговорення. Висновки сформульовані здобувачкою спільно з
науковим керівником. Викладені в дисертації результати отримані
здобувачкою особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були
представлені та ухвалені на ІІ Всеукраїнській науково-практичній
конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, 2004); щорічній
конференції молодих учених Інституту тваринництва Української академії
аграрних наук (Харків, 2004); VI національному з’їзді фармацевтів
України „Досягнення та перспективи розвитку Фармацевтичної галузі
України” (Харків, 2005); ІІ міжнародної науково-практичної конференції
„Сучасні наукові дослідження – ‘2006” (Дніпропетровськ, 2006);
Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та
спеціалістів „Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і
практики” (Львів, 2006); ІІІ міжнародній науково-практичній конференції
„Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика – ‘2006”
(Дніпропетровськ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції
„Сучасність та майбутнє аграрної науки та виробництва” (Львів, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи опубліковано у 10
наукових роботах, 4 з яких – статті у фахових наукових виданнях
відповідної спеціальності, затверджених ВАК України.

Структура і об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу,
3 розділів, висновків, практичних пропозицій та списку використаних
джерел. Загальний обcяг роботи – 127 сторінок машинописного тексту, 6
таблиць, 24 рисунки. Перелік використаної літератури включає 158 джерел,
з яких 96 іноземних авторів.

матеріал і основні методи досліджень

У дослідах були використані лабораторні миші лінії СВА. Для отримання
ембріонів на стадіях розвитку 2, 4, 8 клітин та бластоцисти самиць
піддавали гормональній стимуляції множинної овуляції (Манк М., 1990).
Ембріони вилучали хірургічним шляхом (Манк М., 1990).

Для отримання ембріональних фібробластів миші у ембріонів віком 12,5 –
14,5 діб видаляли голови, кінцівки й кров’яні скупчення. Ембріональний
матеріал, що залишався, роздроблювали механічним шляхом (Boquest A.C. et
al., 1999) та дезагрегували за допомогою трипсинізації (Гаврилов В.И.,
1964; Савченкова И.П. і співавт., 1994). Клітини оцінювали на
життєздатність за допомогою стандартного тесту (Адамс Р., 1983).
Концентрацію клітин підраховували за допомогою камери Горяєва (Адамс Р.,
1983). Матеріал, дезагрегований механічним та хімічним способами,
культивували у середовищі ДМЕМ + 10% FCS + 10 мкл/мл гентаміцину,
збагаченому глюкозою (2 мг/мл та 3 мг/мл) та глютаміном (1 мг/мл) в
умовах 370С та 5% СО2 в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994).
Отримання суспензії клітин для пасування проводили за допомогою
трипсинізації. Клітини з однієї чашки Петрі висівали в дві із розрахунку
1 об’єм суспензії клітин: 1 об’єм свіжого культурального середовища
(Адамс Р., 1983; Савченкова И.П., 1997). Культивування проводили в
умовах 370С та 5% СО2 в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994).
Для формування фідерного моношару культуру ембріональних фібробластів
миші обробляли мітоміцином С у концентрації 10 мкл/мл протягом 2 годин в
умовах 370 С та 5% СО2 в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994;
Turksen K., 2002).

Для отримання клітин ВКМ бластоцисти культивували: 1) у середовищі М16 +
BSA з подальшим переносом бластоцист, що вилупилися, у середовище ДМЕМ +
FCS у спеціальні чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної
поверхні (Манк М., 1990); 2) одразу у середовищі ДМЕМ + FCS до виходу
бластоцист із зони пеллюцида з подальшим переносом у таке ж свіже
середовище у спеціальні чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної
поверхні (Березовская О.П. і співавт., 1986); 3) на фідерному шарі після
видалення зони пеллюцида 0,5% розчином пронази (Савченкова И.П. і
співавт., 1994; Turksen K., 2002); 4) на фідерному шарі з виходом
бластоцист із зони пеллюцида та формуванням ВКМ. Клітини ВКМ відділяли
від трофектодермальних виростів за допомогою мікропіпетки, інкубували 5
– 10 хвилин у середовищі М2 + БСА, яке не містило іонів Са2+ і Mg2+, та
дисоціювали піпетуванням (Манк М., 1990). Клітини ВКМ культивували на
фідерному моношарі у середовище ДМЕМ + 15% FCS + 4,5 мг/мл глюкози + 1
мг/мл глютаміну + 0,1 мМ 2-меркаптоетанолу + 10 мкл/мл гентаміцину
(Савченкова И.П. і співавт., 1994; Turksen K., 2002).

ЕС-подібні клітини культивували протягом від 10 пасажів. Для пасування
ЕС-подібних клітин проводили їх дисоціацію за допомогою трипсинізації
(Evans M.J. et al., 1990; Turksen K., 2002). ЕС-подібні клітини
пересівали у концентрації 2 – 4*105 клітин/см2. Культивування проводили
на фідерному моношарі у середовищі ДМЕМ + 15% FCS + 4,5 мг/мл глюкози +
1 мг/мл глютаміну + 0,1 мМ 2-меркаптоетанолу + 10 мкл/мл гентаміцину в
умовах 370С та 5% СО2 в атмосфері (Turksen K., 2002).

Культивування ЕС-подібних клітин з метою отримання ембріоїдних тіл
проводили за стандартною методикою (Turksen K., 2002). Отримання
ембріоїдних тіл проводили після кожного пасажу ЕС-подібних клітин.

Для ізоляції бластомерів проводили хімічну дебластомерізацію 2-х, 4-х та
докомпактизаційних 8-и клітинних зародків (Манк М., 1990). Ізольовані
бластомери культивували в умовах 370С та 5% СО2 в атмосфері в краплях
середовища під мінеральною олією (Манк М., 1990; Tarkovski A.K.,
Wroblenska J., 1967), а також на фідерному моношарі ембріональних
фібробластів миші. Для розвитку бластомерів використовували середовища
М16 + BSA (Манк М., 1990), ДМЕМ + 10% FCS, ДМЕМ + 10% FCS + 1 мг/мл
глюкози, ДМЕМ + 10 мг/мл FCS + 1 мг/мл глютаміну.

Документування результатів досліджень було проведено шляхом цифрової
обробки відеозапису всіх маніпуляцій під мікроскопом.

Статистичний аналіз отриманих у результаті досліджень даних проводили за
допомогою критерію Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

результати власних досліджень

Отримання та культивування ембріональних фібробластів миші. Аналіз
методик з отримання ембріональних фібробластів визначив розбіжності в
способі одержання ембріонального матеріалу, а саме необхідності етапу
його трипсинізації (Савченкова И.П. і співавт., 1994; Boquest A.C. et
al., 1999; Tao T. et al., 1999; Keefer C.L., Baldassare H. et al., 2001;
Forsberg E.J. et al., 2002). Тому, було проведено порівняльний аналіз
впливу механічної та ферментативної дезагрегації ембріонального
матеріалу на отримання культури ембріональних фібробластів миші.

Механічна дезагрегація ембріонального матеріалу не приводила до
прикріплення клітин до культуральної поверхні чашки Петрі та формування
моношару клітин. Ми припустили, що відсутність адгезії ембріонального
матеріалу до культуральної поверхні є наслідком його недостатньої
дезагрегації.

Для повної дезагрегації ембріональний матеріал обробляли стандартним
розчином 0,25% трипсин – 0,2% ЕDТА. У літературі час трипсинізації
різниться та складає від 10 хвилин (Адамс Р., 1983) до 30 хвилин
(Савченкова И.П. і співавт., 1994). Тому, встановлення найбільш
відповідного для даного об’єкту часу трипсинізації було проведено за
допомогою експозиції ембріонального матеріалу у розчині 0,25% трипсин –
0,2% ЕДТА протягом: 1) 5 хвилин; 2) 10 хвилин; 3) 20 хвилин; 4) 30
хвилин.

Результати досліду представлені на рисунку 1.

Рис. 1. Вплив часу трипсинізації на життєздатність клітин первинної
культури ембріональних фібробластів миші

Як видно з рисунку 1, час трипсинізації 5 та 10 хвилин не призводить до
порушень життєздатності клітин первинної культури порівняно з
максимально визначеним часом ферментативної обробки у 30 хвилин, який,
навпаки, залишає життєздатною лише незначну кількість клітин отриманої
суспензії (р :°?( z ? ¶ „@ `„@ ???? ?????? ???? ? ? ‚ „ ? ? ? ¶ E E I a ae ae ue th &ae?p1/4??? ? Отримані результати представлені у таблиці 4. Статистичний аналіз отриманих даних не виявив вірогідної різниці у розвитку ембріонального матеріалу в обох групах за всіма параметрами, що оцінювали. Таблиця 4 Вплив пронази на формування колоній ЕС-подібних клітин миші Спосіб отримання бластоцист без зони пеллюцида Кількість отриманих ембріобластів, шт. структур трофобластичної морфології, шт. (%) сформованих колоній ЕС-подібних клітин, шт. (%) розвиток бластоцист на фідері 66 8a (12,1±4) 22b (33,3±5,8) видалення зони пеллюцида бластоцист проназою 55 7a (12,7±4,5) 17b (31±6,3) Таким чином, успішний розвиток на фідері бластоцист з їх виходом із зони пеллюцида та подальшим утворенням ВКМ і ЕС-подібних клітин дозволяє уникнути етапу використання пронази. Встановлено, що використання глюкози у концентрації 5,5 мг/мл та глютаміну у концентрації 2 мг/мл у культуральному середовищі забезпечує отримання ЕС-подібних клітин мишей. Пасування ЕС-подібних клітин миші. Важливим етапом пасування Ес-подібних клітин є їх трипсинізація. Для визначення найбільш ефективного способу дисоціації колоній ЕС-подібних клітин був проведений порівняльний аналіз дезагрегації клітин за допомогою двох методів: 1) використання розчину 0,25% трипсин - 0,2% ЕДТА з його подальшим видаленням за допомогою центрифугування та наступного ресуспендиювання клітин у культуральному середовищі (стандартний метод) (Савченкова И.П., 1997; Turksen K., 2002); 2) модифікація даного методу за рахунок дисоціації клітин піпетуванням при постійному мікроскопічному контролі у розчині 0,05% трипсин – 0,02% ЕDТА. Отримані результати представлені на рисунку 2. Статистичний аналіз отриманих даних підтвердив, що при пасуванні ЕС-подібних клітин концентрація ферменту 0,05% трипсин – 0,02% ЕDТА значно збільшує (майже в 9 разів) життєздатність клітин (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020