НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
Кравченко Микола Олександрович
УДК 577.353.5:612.822
Кальцієва регуляція гальмівної синаптичної передачі між нейронами
культури гіпокампу
03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук
Федулова Світлана Анатоліївна
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідуюча лабораторією біофізики синаптичної передачі
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Малишева Маргарита Костянтинівна
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
ст. науковий співробітник, зав. відділом нейрохімії
кандидат біологічних наук
Пархоменко Микола Тимофійович
Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України
пров. науковий співробітник відділу нейрохімії
Провідна установа: Національний Університет імені Тараса Шевченка,
біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ
Захист відбудеться “30” травня 2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.
Автореферат розісланий 28 квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Нейрони обмінюються між собою інформацією переважно
за допомогою хімічних синапсів. У таких синаптичних з’єднаннях потенціал
дії, який генерується поблизу соми, розповсюджується вздовж аксона до
пресинаптичної терміналі, де відкриває потенціал-керовані Са2+-канали.
Іони кальцію, потрапляючи при цьому всередину нервових терміналей,
запускають швидке вивільнення везикул, що містять нейротрансмітер,
молекули якого зрештою й сприймаються рецепторами на постсинаптичній
клітині. Практично всі типи синапсів регулюються цілою низкою коротко-
та довготривалих процесів, з яких деякі сприяють зменшенню, а інші –
збільшенню амплітуди постсинаптичного сигналу (синаптичної сили). В
деяких синапсах при повторюваному використанні відбувається синаптичне
підсилення і домінує полегшення нейропередачі; в інших наслідком є
зменшення синаптичної сили і розвивається депресія ADDIN REFMGR.CITE
plasticity
Plasticity
S.Gov't,Non-P.H.S.
.
File
більшості випадків, імовірно, має місце накладання великої кількості
регуляторних процесів, і результуючий вплив являтиме собою комбінацію
полегшення та депресії, причому зміни синаптичної сили істотно
залежатимуть від особливостей часових характеристик синаптичної
активації.
Добре відомо, що основним джерелом вільних іонів кальцію, які ініціюють
викликане надходженням потенціалу дії вивільнення нейромедіатора з
пресинаптичних закінчень, виступає позаклітинне середовище. Однак,
показано, що пресинаптичні кальцієві депо, зокрема, депо
ендоплазматичного ретикулуму, безсумнівно приймають участь у запуску
вивільнення медіатора ADDIN REFMGR.CITE
signalling
signalling
Signaling
Reticulum
earch
Support,Non-U.S.Gov't
File
Calcium.
Calcium.
кальцій-опосередкований контроль регуляторних процесів з
постсинаптичного боку також знайшли експериментальне підтвердження у
працях різних авторів ADDIN REFMGR.CITE
synaptic currents in neonatal rat hippocampal neurons
synaptic currents in neonatal rat hippocampal
neurons
logy
Acid
Vitro
Fluid
Techniques
gy
Cells
Channel
in
File
Таким чином, питання про існування та внесок різних пре- та
постсинаптичних механізмів у регуляцію пластичності синаптичної передачі
на тому чи іншому експериментальному об’єкті наразі залишається
відкритим.
У більшості робіт з дослідження короткочасної синаптичної пластичності
увага акцентується на вивченні лише однієї з її форм – або депресії, або
полегшення. Одне з дискусійних питань, пов’язаних з синаптичною
пластичністю, торкається здатності нервових клітин змінювати притаманний
їм характер пластичності. З огляду на наявність у гіпокампі різних типів
ГАМК-ергічних інтернейронів, які є ключовою ланкою у формуванні
специфічних для гіпокампу ритмів електричної активності ADDIN
REFMGR.CITE
interneurons in rat hippocampus
interneurons in rat
hippocampus
er,B.H.
derivatives
Blockers
Acid
Vitro
Potentials
Inhibition
gy
Terminals
Cells
Time
Glutamate
secretion
File
1:123-30.
літературними даними, зумовлюють коротко- та довгострокові зміни
гальмівної передачі, актуальність має також порівняння різних типів
пластичності, спостережуваних на одному й тому самому об’єкті, а також
можливих переходів між ними.
З іншого боку, накопичення знань про синаптичну передачу в цілому
спонукає до поглибленого вивчення її особливостей на якомога більш
елементарному рівні. На сьогодні більшість авторів використовує непрямі
методи для дослідження синаптичної пластичності на рівні поодинокої
терміналі. Тому особливий інтерес представляє не тільки аналіз
кальцій-залежної регуляції короткочасної синаптичної пластичності, а й
порівняння її властивостей при одночасній активації різної кількості
синаптичних терміналей.
Усе вищезгадане й визначило необхідність дослідження особливостей
кальцій-залежної регуляції короткочасної пластичності гальмівних
синаптичних зв’язків між культивованими нейронами гіпокампу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках наукових тем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця
“Дослідження молекулярних механізмів – проявів функціонування геному, що
зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в
нормі та патології” (Державний реєстраційний номер 0102U002472),
“Вивчення ролі Са2+ як внутриклітинного посередника у активності
синапсів холінергічних вегетативних нейронів та ГАМК-ергічних нейронів
гіпокампу” (Держ. реєстр. № 0102U000830), “Дослідження збуджуючої та
гальмівної синаптичної передачі центральних та периферичних нейронів в
залежності від функціональних властивостей їх пре- та постсинаптичних
мембран” (Держ. реєстр. № 0105U003232) та наукового проекту Державного
фонду фундаментальних досліджень “Шляхи регуляції синаптичної передачі
через впливи на субмікронну структуру синапсів” (Держ. реєстр. №
05.07/00237).
Мета дослідження. Метою роботи було вивчити короткочасні зміни
синаптичної сили ГАМК-ергічної передачі між культивованими нейронами
гіпокампу при впливі на кальцій-опосередковані регуляторні механізми на
рівні поодинокої терміналі та при інтегральній активації багатьох
синаптичних закінчень одного аксона.
Завдання дослідження.
Визначити характер впливу, зумовленого активаторами вивільнення кальцію
з депо ендоплазматичного ретикулуму, на синаптичну передачу між
нейронами гіпокампу в культурі.
Проаналізувати короткочасні зміни ефективності синаптичної передачі при
парній стимуляції за умов спустошення кальцієвих депо під дією агоністів
ріанодинових рецепторів.
Дослідити залежність параметрів короткочасної синаптичної пластичності
від величини деполяризації поодинокої синаптичної терміналі та
зовнішньоклітинної концентрації іонів кальцію.
Порівняти властивості синаптичного зв’язку, сформованого поодинокою
терміналлю та кількома закінченнями одного аксона при спустошенні
кальцієвих депо.
Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі описана
одна з форм короткочасної синаптичної пластичності – зміна ефективності
синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів. Показано, що в
умовах культивування можуть існувати два типи нейронів, які здатні
проявляти суттєво відмінні типи такої пластичності – депресію та
полегшення при парній стимуляції.
Показано, що речовини, які ініціюють вивільнення кальцію з депо
ендоплазматичного ретикулума, складним чином регулюють синаптичну
передачу – за рахунок впливу як на пре-, так і на постсинаптичні
механізми. Також виявлено, що поодинокі ГАМК-ергічні синапси здатні не
лише варіювати ступінь короткочасної пластичності, а й радикально
змінювати її характер в залежності від кількості іонів кальцію,
присутніх у зовнішньому середовищі.
Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення
стосовно механізмів, відповідальних за кальцій-залежну регуляцію
ефективності гальмівних синаптичних зв’язків у ЦНС.
Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дисертаційної роботи
представляють передусім фундаментальний інтерес, оскільки отримано нові
дані стосовно короткочасної пластичності гальмівної синаптичної передачі
та її регуляції за допомогою кальцій-опосередкованих механізмів.
Отримані відомості щодо змін ефективності синаптичної передачі на рівні
поодинокої терміналі та інтегрального синаптичного з’єднання дозволяють
глибше проаналізувати процеси, які відіграють фундаментальну роль в
нормальному функціонуванні ЦНС та розвитку нейрональних мереж.
Результати роботи дозволяють наблизитись до розуміння феномену пам’яті в
цілому, оскільки нейронна мережа гіпокампу вважається місцем локалізації
процесів, які регулюють здатність до навчання та формують основи
пам’яті.
Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з
налагодження установки для електрофізіологічних досліджень та системи
локальної аплікації, з отримання та обробки експериментальних даних, з
аналізу та узагальнення результатів досліджень була виконана особисто
автором. В розробці загальної концепції роботи, її обговоренні та
редагуванні брали участь співавтори публікацій.
Апробація результатів дисертації. Загальні положення дисертаційної
роботи було викладено на семінарах Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАНУ (Київ, 2003, 2005 р.) та наступних наукових
конференціях: Second Kiev Symposium “Smooth Muscle Physiology and
Biophysics” (28-31 жовтня 2003 р., Київ, Україна), Конференція для
молодих вчених “Перспективні напрямки наукових досліджень” (17-18
листопада 2003 р., Київ, Україна), “First Ukrainian Congress for Cell
Biology” (25-28 квітня 2004 р., Львів, Україна), International Workshop
in Cell Physiology “Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels
and Pumps” (13-17 жовтня 2004 р., Санкт-Петербург, Росія).
Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових
фахових журналах та тезах 5 доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення
результатів, висновків та списку використаних джерел із 269 найменувань.
Роботу викладено на 154 сторінках та ілюстровано 27 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження короткочасної синаптичної
пластичності, внутрішньоклітинних кальцієвих депо і поодиноких
гальмівних синапсів, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено
відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих
результатів, публікацію матеріалів дисертації.
Розділ Огляд літератури присвячений висвітленню основних понять
мембранної теорії збудження; опису складу, типів, функцій
ГАМК-рецепторів; огляду внутрішньоклітинних кальцієвих депо та їх
взаємодії з механізмом вивільнення нейротрансмітера; класифікації типів
синаптичної пластичності.
Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано
використані матеріали та методи досліджень, а саме:
Приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампу низької
щільності;
Методика фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” для
реєстрації постсинаптичних струмів;
Методика позаклітинної електричної стимуляції аксона пресинаптичного
нейрона;
Методика локальної позаклітинної суперфузії для аплікації
фармакологічних речовин;
Методика позаклітинної електричної стимуляції поодинокої терміналі
пресинаптичного нейрона;
Статистична обробка отриманих результатів за допомогою стандартних
методів аналізу.
Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу. Для отримання
культури використовувались новонароджені щури лінії Вістар. Тварин
декапітували, головний мозок вміщували в мінімальне середовище Ігла
(“Sigma”, США) с додаванням 20 мМ буфера HEPES, 25 од/мл натрієвої солі
бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. За допомогою
скальпеля гіпокамп відокремлювали від решти відділів мозку і розрізували
у поперечному напрямку на частини 1 / 2 мм завтовшки. Ферментативну
обробку здійснювали 0,05%-м розчином трипсину (тип XII-S, “Sigma”, США)
при кімнатній температурі (23 / 25(С) протягом 5-6 хвилин. Потім тканину
промивали чотири рази розчином для культивування, до складу якого
входили: мінімальне середовище Ігла, 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл
інсуліну, 2,3 мг/мл бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої
солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. Суспензію
клітин отримували за допомогою механічної дисоціації набором
пастерівських піпеток з діаметрами кінчиків, які послідовно
зменшувались. Кількість клітин в одиниці об’єму вихідної суспензії
підраховувалась за допомогою камери Горяєва. Шляхом додавання розчину
для культивування кількість клітин в одиниці об’єму кінцевої суспензії
доводилось до такого рівня, при якому щільність клітин при висіванні
становила 30000 од/см2.
Клітини висаджували на чашку Петрі, яка була попередньо оброблена
полі-L-орнітином. В скляне кільце діаметром 9 мм, яке обмежувало площину
посадки, наливалось 250 мкл суспензії. Чашки Петрі з суспензією
вміщувались в інкубатор (“Jouan”, Франція) з контрольованим вмістом
двоокису вуглецю (5% СО2) в повітряно-газовій суміші, контрольованим
температурним режимом (37(С) та постійним пасивним зволоженням. На
третій день культивування для пригнічення проліферації гліальних клітин
в середовище додавали цитозин-в-D-арабіно-фуранозид (5 мкМ). Режим
обробки культури цитозин-в-D-арабіно-фуранозидом підбирався таким чином,
щоб пригнітити проліферацію гліальних клітин на такій стадії, коли
кількість астроцитів була достатньою для утворення гліального моношару.
Повторна повна заміна розчину для культивування проводилась через 20 /
24 години.
Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих
протягом 14 – 28 днів, при кімнатній температурі (20 / 23(С). На цей час
клітини формували необхідну для досліджень кількість синаптичних
контактів, також можна було чітко ідентифікувати типи клітин. Для
експериментів відбирались не тільки нейрони, які мають виражену
пірамідальну форму, а також і мультиполярні. Їх розмір складав приблизно
20 / 30 мкм.
Електрофізіологічні методи. Для вимірювання трансмембранних струмів, які
відводились від культивованих нейронів гіпокампу, було застосовано метод
фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани
(“patch-clamp”), який було описано Неєром та Сакманом ADDIN
REFMGR.CITE
frog muscle fibres
frog muscle
fibres
derivatives
Conductivity
Potentials
Denervation
pipiens
Support,U.S.Gov't,Non-P.H.S.
Factors
File
current recording from cells and cell-free membrane patches
recording from cells and cell-free membrane
patches
e
Channels
temporaria
ergic
File
Arch.
9
Arch.
Підтримуваний потенціал в експериментах становив –75 мВ. Значення
природного потенціалу спокою культивованих нейронів гіпокампу, за нашими
вимірюваннями, коливались в межах –50 / –60 мВ.
В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного
складу (мМ): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза 30.
Піпеточний розчин містив (мМ): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10, MgCl2 5,
HEPES 20. При дослідженні гальмівних постсинаптичних струмів у
зовнішньоклітинний розчин безпосередньо перед початком дослідів додавали
блокатори іонотропних глутаматних рецепторів NMDA- та
не-NMDA-типів: відповідно DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанову кислоту
(DL-AP5) и 6,7-динітрохіноксалін-2,3-діон (DNQX) у концентрації 20 мкМ
кожен. У дослідах, де проводилась стимуляція поодинокої пресинаптичної
терміналі, до складу зовнішньоклітинного розчину включався також
блокатор натрієвих каналів тетродотоксин (TTX) у концентрації 0,5 мкМ.
Заповнені розчином, піпетки мали опір 8-10 МОм. Експериментальна
установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопу Axiovert 35
(Carl Zeiss, ФРН), який при використанні фазовоконтрасного об’єктиву з
масляною імерсією забезпечував 1000-кратне оптичне збільшення. В
експериментах використовувався підсилювач електричних сигналів
Axopatch-1D (Axon Instruments, США). Сигнали відцифровувались та
записувались за допомогою АЦП LabMaster TL-1 та програмного пакету
pClamp 6.0 (Axon Instruments, США) з частотою дискретизації 10 кГц.
Електричні сигнали, які відводились від нервових клітин, піддавались
фільтрації за допомогою апаратного високочастотного фільтру Бесселя з
частотою зрізу 2 кГц.
Локальна електрична стимуляція проводилась за допомогою стимулятора з
ізольованим виходом ISO-Flex (AMPI, Ізраїль); стимулятор було заземлено
на спільний з підсилювачем індиферентний електрод. Стимуляційна
мікропіпетка з діаметром отвору близько 2 мкм, яку виготовляли за
технологією аналогічно піпеткам для реєстрації струмів, заповнювалась
стандартним зовнішньоклітинним сольовим розчином і з’єднувалась з
виходом стимулятора. Опір такої піпетки, заповненої розчином, становив 5
/ 7 МОм.
Струми реєстрували при подразненні аксона прямокутними імпульсами
напруги негативної полярності тривалістю 300 мкс. Частота стимуляції
становила 0,2 Гц. Амплітуда напруги на вході стимуляційної піпетки
змінювалась в межах від 30 до 60 В, зміна стимулюючого сигналу на виході
була лінійною в межах всіх вхідних напруг. Інтервал між імпульсами в
парі (при вивченні короткочасної синаптичної пластичності) становив 150
мс.
Методика локальної стимуляції, яка була застосована в цій роботі,
детально описана в роботі Федулової та співавт. ADDIN REFMGR.CITE
inhibitory synapse in cultured rat hippocampal neurons
synapse in cultured rat hippocampal
neurons
.V.
ctric Stimulation
Potentials
Space
Potentials
Techniques
Distribution
S.Gov't
Transmission
File
Ukraine
методики полягає у тому, що стимуляція відбувається за рахунок
локального зміщення потенціалу у зовнішньоклітиннному розчині в
безпосередній близькості від стимулюючої піпетки (Рис. 1). На відміну
від методики електричної стимуляції аксону тривалість прямокутного
імпульсу напруги в даному випадку повинна становити не менше 3 мс. Це
дозволить напряму активувати потенціалкеровані кальцієві канали в
пресинаптичній терміналі і запустити каскад реакцій, що призведуть до
вивільнення нейромедіатора.
Рис. 1 Електрична стимуляція поодинокого синаптичного закінчення
(мікрофотографія досліду, оптичний мікроскоп, фазовий контраст). До
постсинаптичної клітини підведено піпетку для реєстрації струмів. На
проксимальному дендриті знаходиться чітко візуально ідентифікований
синаптичний бутон (показаний у збільшеному вигляді на вставці).
Аплікація фармакологічних речовин здійснювалась за методикою швидкої
локальної суперфузії (Veselovsky et al., 1996).
Аналіз даних. Кінетичні параметри викликаних постсинаптичних струмів
визначались за допомогою програмного пакета Clampfit 9.0 (Axon
Instruments, США). Результати представлені в тексті як середнє значення
± похибка середнього.
У розділі Результати викладено результати досліджень змін характеристик
гальмівних ГАМК-ергічних струмів, зареєстрованих при спустошенні
кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулума.
Спочатку було проведено серію дослідів з визначення іонної природи
постсинаптичних струмів та їхньої чутливості до специфічного агоністу
ГАМКА-рецепторів. З рівняння Нернста рівноважний хлорний потенціал при
використанні описаних вище розчинів (концентрація іонів хлору в
зовнішньо- та внутрішньоклітинному середовищах становить відповідно 150
та 58 мМ) за кімнатної температури (23 °С = 296 К) буде дорівнювати
–24,2 мВ. В експериментальних умовах, використовуючи стимуляцію аксона
пресинаптичної клітини, при різних значеннях підтримуваного потенціалу в
межах від –100 до 0 мВ було зареєстровано викликані постсинаптичні
струми, для яких було побудовано вольт-амперні характеристики. За
характеристиками було розраховане усереднене значення потенціалу
реверсії, яке виявилось рівним –28,2 ± 4 мВ (n = 3). Також було
використано комбінацію методик швидкої локальної суперфузії та
іонофоретичної аплікації для безпосереднього прикладання агоніста
ГАМК-рецепторів (10 мМ) на сому нейрона.
Усереднене значення потенціалу реверсії становило –24,3 ± 1 мВ (n = 4).
Як видно з Рис. 2, потенціали реверсії струмів, викликаних електричною
стимуляцією та аплікацією ГАМК (на малюнку, відповідно –28,7 та –24,9
мВ), мають досить близькі значення.
Рис. 2 Хлорні струми, викликані активацією ГАМК-рецепторів. А – приклад
запису ГПСС, викликаних електричною стимуляцією аксона; Б – приклади
запису струмів, викликаних іонофоретичною аплікацією
(-аміномасляної кислоти (10 мМ). Обидва графіки побудовано в однаковому
масштабі. Відведення струмів здійснювались від різних клітин. В –
відповідні вольт-амперні характеристики постсинаптичних струмів,
побудовані за реєстраціями
А (•) та Б (?).
На основі порівняння отриманих експериментальних даних з теоретично
розрахованими було зроблено висновок про те, що розглянуті струми
переносяться переважно іонами хлору.
Для ідентифікації рецепторів, які приймають участь у проведенні
зареєстрованих струмів, було застосовано локальну аплікацію відомого
селективного антагоністу ГАМКА-рецепторів бікукуліну метоброміду в
концентрації 10 мкМ. Як видно з Рис. 3, бікукулін майже повністю
(до 8 ± 1% від контрольної) пригнічував амплітуду ГПСС, викликаних
стимуляцією аксона. Ефект зменшення амплітуди був достовірним (t-тест
Ст’юдента, n = 4) і зворотнім.
Рис. 3 Пригнічення викликаних постсинаптичних струмів блокатором
ГАМКА-рецепторів бікукуліном. Приклади реєстрації вГПСС: А – в контролі,
Б – при аплікації бікукуліну метоброміду (10 мкМ). В обох випадках
усереднення проводилось за 10 послідовними реєстраціями.
Оскільки бікукулін майже повністю та зворотно блокував зареєстровані
вГПСС, струми були віднесені до таких, що опосередковуються
ГАМКА-рецепторами.
Участь кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму в регуляції
гальмівної синаптичної передачі між культивованими нейронами гіпокампу.
Після остаточного визначення природи викликаних ПСС було досліджено
пластичність синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів.
В якості кількісної міри синаптичної пластичності було обрано т.зв.
коефіцієнт парної стимуляції (КПС, paired-pulse ratio, PPR). Цей
коефіцієнт обчислюється як відношення амплітуди другої відповіді у парі
до першої. В залежності від значення КПС при стимуляції парою імпульсів
може спостерігатись депресія (КПС 1).
Популяція нейронів виявилась суттєво неоднорідною за характером
короткочасної синаптичної пластичності при парній стимуляції аксонів.
Клітини (точніше, пари клітин) демонстрували як полегшення (КПС > 1,
Рис. 4 А), так і депресію при парній стимуляції (КПС 1) та Б – депресію при парній стимуляції
(КПС 0,05
для всіх величин). До того ж, в усіх (n = 6) досліджених парах клітин на
початку дослідів було зареєстровано депресію при парній стимуляції (КПС
1).
Як видно з Рис. 6 В, коефіцієнт парної стимуляції не тільки змінювався в
процесі поступового збільшення/зменшення амплітуди стимулу нелінійним
чином, а й міг бути як меншим, так і більшим за одиницю. Така картина
була характерною для трьох з п’яти досліджених клітин. В інших двох
експериментах КПС, хоч і змінювався досить істотно, проте був завжди
меншим за одиницю – короткочасна синаптична пластичність була
представлена виключно депресією при парній стимуляції. Під час дослідів
КПС (значення усереднювались за 30 послідовними записами вГПСС при
кожній сталій амплітуді UСТИМ) варіював у межах 0,33 / 1,48 і в
середньому дорівнював 0,78 ± 0,04 (n = 5).
Крім зміни електрорушійної сили для іонів Са (при електричній стимуляції
поодинокої терміналі) іншим важливим фактором, який здатний впливати на
кількість цих іонів всередині синаптичної терміналі, виступає
концентрація кальцію у позаклітинному середовищі.
Було досліджено зміни пластичності при парній стимуляції поодиноких
синаптичних закінчень за умов підвищеного та зниженого вмісту іонів
кальцію в зовнішньоклітинному розчині.
Виявилось, що при підвищенні концентрації кальцію до 5 мМ ефекти, які
спостерігались при нормальній [Ca2+]о (2 мМ) якісно залишаються
незмінними. Різниця полягає в тому, що крива імовірності Pr = f(UСТИМ)
після досягнення максимального значення Pr = 1 не зменшується при
подальшому збільшенні напруги на стимуляційній піпетці. Що стосується
пластичності при парній стимуляції, в усіх п’яти досліджених клітинах
було зареєстровано депресію при парній стимуляції. Ця депресія була
значно більш вираженою, ніж при нормальній [Ca2+]о, КПС в середньому
складав 0,48 ± 0,03 (n = 5) (Рис. 7 В). Випадків, коли КПС перевищував
одиницю (усереднення проводилось за 30 послідовними записами вГПСС при
одному сталому значенні UСТИМ) зареєстровано не було.
Рис. 7 Графіки залежностей коефіцієнтів парної стимуляції від амплітуди
стимулюючого напруги у розчинах з різними концентраціями іонів кальцію.
А – [Ca2+]o= 0,5 мМ, Б – [Ca2+]o= 2 мМ, В – [Ca2+]o= 5 мМ). В усіх трьох
випадках реєстрація проводилась від різних клітин.
В дослідах зі зниженою концентрацією іонів кальцію спостерігалась
протилежна (з точки зору синаптичної пластичності) картина. Початково в
усіх п’яти клітинах спостерігалось полегшення при парній стимуляції. В
ході дослідів при зміні амплітуди стимуляції в двох клітинах (з п’яти)
КПС зменшувався до значень, менших за одиницю, проте у середньому він
становив 1,17 ± 0,08 (n = 5) (Рис. 7 А). При зниженні [Ca2+]о до 0,5 мМ
імовірність вивільнення нейромедіатора значно знижувалась (хоча якісно
графік залежності
Pr = f(UСТИМ) залишався незмінним у порівнянні з експериментами при
[Ca2+]о = 2 мМ), що істотно відбивалось на усереднених значеннях
амплітуд вГПСС.
Результати, отримані після усереднення за 5-ма клітинами для кожної з
трьох різних зовнішньоклітинних концентрацій іонів кальцію, були зведені
в таблицю 3. Статистичну достовірність відмінностей параметрів
розраховано по відношенню до величин за нормальної концентрації [Ca2+]o
(2 мМ) і вказано як: ** P
inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus
inhibitory postsynaptic responses in rat
hippocampus
idge,G.L.
Action Potentials
derivatives
effects
Antagonists
Acid
Transmission
File
рідше) полегшення ADDIN REFMGR.CITE
facilitation in area CA1 of the rat hippocampus
facilitation in area CA1 of the rat
hippocampus
ano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione
derivatives
imals
Potentials
Vitro
Tracts
Strains
Support,Non-U.S.Gov't
Factors
File
Найцікавішою особливістю проведених нами експериментів є те, що в них
було зафіксовано як перший, так і другий випадки. При цьому клітини, які
демонстрували депресію, зустрічались в середньому у 2 рази частіше (16
проти 9 випадків), ніж ті, які демонстрували полегшення. Потрібно
відзначити, що і під час прикладання фармакологічних агентів, і після
їхнього відмивання характер синаптичної пластичності при парній
стимуляції для кожної окремої клітини залишався незмінним (тобто
депресія не переходила у полегшення і навпаки). Нейрони для дослідів
відбирались неупереджено; між групами клітин, які відрізнялись за
характером короткочасної синаптичної пластичності, виявити додаткові
відмінності за морфологічними чи віковими ознаками, використовуючи
математичні критерії, не вдалося.
За даними літератури відомо, що багато властивостей (зокрема, параметри
пластичності при парній стимуляції) викликаних збуджуючих
постсинаптичних струмів істотно залежать від відділу мозку, з якого
походить пресинаптична клітина ADDIN REFMGR.CITE
plasticity by neurotrophins in dentate gyrus
by neurotrophins in dentate
gyrus
Pathways
Factor
Study
Gyrus
effects
Plasticity
3
Techniques
Pathway
Proteins
Support,Non-U.S.Gov't
File
and intracortical synapses onto layer 6 neurons in
neocortex
synapses onto layer 6 neurons in
neocortex
Potentials
Potentials
x
Inhibition
Pathways
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Nuclei
File
and Connors, 2002) . Більш того – навіть нейрони гіпокампу, розташовані
у різних його зонах, можуть проявляти різні форми коротко- та
довгострокової синаптичної пластичності ADDIN REFMGR.CITE
synaptic plasticity in rat CA1 hippocampal region
plasticity in rat CA1 hippocampal
region
0/5/26
Mapping
Media
effects
Stimulation
citatory Postsynaptic
Potentials
Vitro
Plasticity
ters
Factors
File
Kostopoulos, 2000) . У гіпокампі за морфологічними та фізіологічними
ознаками, внутрішньоклітинними компонентами, типовими зразками інервації
ADDIN REFMGR.CITE
hippocampus
ytology
Pathways
smitters
urotransmitter
re
File
класифіковано багато типів інтернейронів (які й утворюють ГАМК-ергічні
синапси). Відомо також, що пірамідні нейрони з різних зон гіпокампу
можуть демонструвати різні типи електричної активності в залежності від
клітин, які утворюють з ними синаптичні контакти ADDIN REFMGR.CITE
plasticity by neurotrophins in dentate gyrus
by neurotrophins in dentate
gyrus
Pathways
Factor
Study
Gyrus
effects
Plasticity
3
Techniques
Pathway
Proteins
Support,Non-U.S.Gov't
File
structure and composition of CA3 branched dendritic spines and their
synaptic relationships with mossy fiber boutons in the rat
hippocampus
CA3 branched dendritic spines and their synaptic relationships with
mossy fiber boutons in the rat
hippocampus
Reticulum
Processing,Computer-Assisted
Microtubules
Fibers
Cells
Strains
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Fractions
e
File
Neurol.
Neurol.
medial and lateral perforant paths in vitro
rat medial and lateral perforant paths in
vitro
imals
Stimulation
citatory Postsynaptic
Potentials
Vitro
Pathways
D-Aspartate
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
File
the medial but not the lateral perforant path
the lateral perforant
path
Potentials
Gyrus
Stimulation
Pigs
Vitro
Antagonists
Inhibition
gy
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Factors
File
Res.
Res.
and Malenka, 1993; Kahle and Cotman, 1989) . Деякі дослідження напряму
пов’язують різні інтернейрони гіпокампа та зубчастої борозни з різними
типами короткочасної синаптичної пластичності ADDIN REFMGR.CITE
hippocampus
rat
hippocampus
000/3/1
&
inhibitors
Antagonists
Acid
Vitro
Potentials
Inhibition
Techniques
ic
Acids
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
File
2:425-39.
release at a hippocampal interneuron-principal neuron
synapse
hippocampal interneuron-principal neuron
synapse
Potentials
Stimulation
ocytosis
Acid
Inhibition
ics
Reaction Time
Support,Non-U.S.Gov't
Vesicles
File
currents evoked by identified GABAergic neurones in rat hippocampus in
vitro
identified GABAergic neurones in rat hippocampus in
vitro
ons
Membrane
y
Postsynaptic Potentials
Acid
Vitro
Techniques
gy
Cells
Support,Non-U.S.Gov't
Transmission
in
File
1:91-116.
from distinct interneurons in rat hippocampus
interneurons in rat
hippocampus
er,B.H.
derivatives
Blockers
Acid
Vitro
Potentials
Inhibition
gy
Terminals
Cells
Time
Glutamate
secretion
File
1:123-30.
mossy fiber system
system
Pathways
chemistry
Acid
Fibers,Hippocampal
Proteins
Techniques
Cells
Support,Non-U.S.Gov't
File
Kraushaar and Jonas, 2000; Maccaferri et al., 2000; Poncer et al., 2000;
Vida and Frotscher, 2000) .
При приготуванні культури нейронів для наших експериментів не
проводилось навмисне виділення клітин з певних зон гіпокампу, до того ж,
відомо, що в умовах культивування нервові клітини не завжди зберігають
свою природну форму ADDIN REFMGR.CITE
cultures
cultures
Markers
Size
Acid
Decarboxylase
Vitro
ociated Proteins
Proteins
Cells
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
ot in
File
це класифікація пресинаптичних клітин за морфологічними ознаками була б
сильно ускладнена.
На нашу думку, найвірогіднішим поясненням спостереженню як депресії, так
і полегшення при парній стимуляції є інервація пірамідних клітин
терміналями, що походять від різних типів гальмівних інтернейронів (а
це, безсумнівно, свідчить на користь наявності пресинаптичних
механізмів, які відповідають за короткочасну пластичність).
Відомо, що локальна електрична стимуляція поодинокого синаптичного
закінчення за умови блокування натрієвих каналів (в нашому випадку – за
допомогою тетродотоксина, 0,5 мкМ) викликає відкриття потенціал-чутливих
Са2+ каналів та входження іонів кальцію в пресинаптичну терміналь. Як
випливає з законів термодинаміки, потік заряджених частинок буде прямо
пропорційний різниці потенціалів на клітинній мембрані під час
електричного стимулу та трансмембранному градієнту концентрацій іонів
ADDIN REFMGR.CITE
Chapter
Excitability and Ion
Channels
.
File
(6th
Edition)
Publishers
EA;à
Whole
F4;³çèêà
îñòþê,Ï.Ã.
åíêî,Ì.Ñ.
1998; Костюк и соавт., 2001) .
Оскільки кількість іонів кальцію, наявних у синаптичному бутоні,
суттєвим чином визначає ефективність синаптичної передачі, можна було б
очікувати отримання якісно однакових ефектів при поступових змінах як
амплітуди електричного стимулу, так і зовнішньоклітинної концентрації
іонів кальцію. Однак, як було показано, в залежності від [Ca2+]o
амплітуда викликаних ГПСС змінювалась монотонно, а в залежності від сили
стимуляції – куполоподібно. Скоріш за все, така форма залежностей
f(UСТИМ) зумовлена специфічним характером вольт-амперної характеристики
сумарного кальцієвого струму (який опосередковується переважно N- та
P/Q-типами кальцієвих каналів ADDIN REFMGR.CITE
xF6;èàëîçàâèñèì&#
xFB;å êàëüöèåâûå
êàíàëû â
êóëüòèâèðóåì
ûõ íåéðîíàõ
ãèïïîêàìïà
êðûñ
xE7;àâèñèìûå
êàëüöèåâûå
êàíàëû â
êóëüòèâèðóåì
ûõ íåéðîíàõ
ãèïïîêàìïà
êðûñ
E0;åâà,Å.Â.
#xD4;åäóëîâà,Ñ.À.Primary>
;êèé,Í.Ñ.
E;ôèçèîëîãèÿ/
Neurophysiology
E;ëîãèÿ/
Neurophysiology
останньої, і, таким чином, якісно відображає кальцієвий потік,
спрямований всередину терміналі ADDIN REFMGR.CITE
transients at a single hippocampal terminal
transients at a single hippocampal
terminal
vsky,N.S.
analysis
Potentials
inobutyric
Acid
Potentials
Inhibition
c
Terminals
Support,Non-U.S.Gov't
Transmission
File
Arch.
Arch.
h
j
A
th
Oue.
p
h
j
l
A
th
hOOeO.
p
O
„@
`„@
??&?
??
??
(/*/F/V/f/z/?/YOBBBB
?/?/?/¶/?/A/Ae/YOBBBB
^
a
ae
zpcc
…xxxxxx
Oe0”y@
¬
i_RRR
`„•kdk
?\?????…?
j`SSS
”y@
¬
j`SSS
”y@
¬
lbUUU
”y@
¬
lbUUU
”y@
¬
lbUUU
”y@
¬
”y@
¬
{
|
uhh
{
|
uhh
{
|
uhh
{
|
uhh
{
|
uhh
{
|
{
|
P>
Compounds
inhibitors
effects
Dyes
ical
Techniques
gy
Compounds
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Culture
File
наявність різниці між амплітудами вГПСС у парі буде вказувати на
варіації пресинаптичних детермінант вивільнення трансмітера (головним
чином – на варіації імовірності викиду) ADDIN REFMGR.CITE
developing rat spinal networks in vitro
developing rat spinal networks in
vitro
L.
is
inhibitors
effects
Stimulation
y Amino Acid
Antagonists
Acid
Vitro
Potentials
,Electron
Inhibition
Plasticity
gy
Terminals
Acid
Cord
Synapses
Transmission
in
File
paired-pulse facilitation to paired-pulse depression at unitary CA3-CA3
synapses in the rat hippocampus
paired-pulse depression at unitary CA3-CA3 synapses in the rat
hippocampus
elli,G.
Potentials
Stimulation
citatory Postsynaptic
Potentials
Cells
Time
Support,Non-U.S.Gov't
File
2
al., 2002) . Одним з найпростіших шляхів маніпулювання імовірністю
вивільнення везикул є зміна зовнішньоклітинної концентрації кальцію.
Також продемонстровано, що збільшення концентрації зовнішньоклітинного
кальцію призводило до збільшення амплітуди ГАМК-ергічних ПСС та більш
значної депресії при парній стимуляції і навпаки, зменшення концентрації
кальцію тягнуло за собою зменшення амплітуди ГПСС та менш виражену
депресію ADDIN REFMGR.CITE
to a presynaptic mechanism independent of GABAB autoreceptor
activation
to a presynaptic mechanism independent of GABAB autoreceptor
activation
Potentials
ug effects
Stimulation
ppocampus
Plasticity
Concentration
ology
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
File
2
Ми показали, що зміна зовнішньоклітинної концентрації кальцію якісно
змінює характер пластичності при парній стимуляції. Пояснюючи ефект
зміни депресії при парній стимуляції на полегшення, можна припустити
можливість існування кількох підтипів ГАМК-ергічних синапсів, в яких
викид нейромедіатора завжди здійснюється в середньому більш або менш
імовірно ADDIN REFMGR.CITE
hippocampus
rat
hippocampus
000/3/1
&
inhibitors
Antagonists
Acid
Vitro
Potentials
Inhibition
Techniques
ic
Acids
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
File
2:425-39.
межах поодинокого синапса співіснують активні зони (на сьогодні немає
переконливих доказів, що у гальмівних синапсах в гіпокампі є тільки одна
активна зона) з різними “базовими” імовірностями вивільнення.
Виснаження депо везикул, які готові до екзоцитозу, також може виступати
в якості механізму, відповідального за зміни депресія/полегшення – КПС
істотно змінювався при різних [Ca2+]o, хоча, наприклад, для синаптичного
з’єднання “корзинчаста клітина – гранулярна клітина” у гіпокампі такої
залежності не спостерігали ADDIN REFMGR.CITE
hippocampal interneuron-principal neuron synapse
hippocampal interneuron-principal neuron
synapse
Potentials
Stimulation
ocytosis
Acid
Inhibition
ics
Reaction Time
Support,Non-U.S.Gov't
Vesicles
File
Відомо, що деякі фактори можуть спричинити зміну характеру синаптичної Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A
пластичності при стимуляції парою імпульсів; більш того, всі вони в
деякій мірі є кальцій-залежними. Наприклад, Савіане та співавт.
повідомляють про частото-залежний зсув від полегшення до депресії при
стимуляції парами імпульсів ADDIN REFMGR.CITE
paired-pulse depression at unitary CA3-CA3 synapses in the rat
hippocampus
paired-pulse depression at unitary CA3-CA3 synapses in the rat
hippocampus
elli,G.
Potentials
Stimulation
citatory Postsynaptic
Potentials
Cells
Time
Support,Non-U.S.Gov't
File
2
проведені на ГАМК-ергічних інтернейронах спинного мозку щурів, показали,
що хронічний вплив блокаторів глутаматних не-NMDA рецепторів здатний
спричинити зміну значення параметру КПС для пар викликаних струмів і
навіть інвертувати полегшення (яка звичайно спостерігається в
контрольних умовах) у депресію ADDIN REFMGR.CITE
developing rat spinal networks in vitro
developing rat spinal networks in
vitro
L.
is
inhibitors
effects
Stimulation
y Amino Acid
Antagonists
Acid
Vitro
Potentials
,Electron
Inhibition
Plasticity
gy
Terminals
Acid
Cord
Synapses
Transmission
in
File
Дослідження синаптичних зв’язків між інтернейронами та клітинами
Пуркіньє у генетично модифікованих тварин (виведених з використанням
методики “knock-out” – видалення генів, відповідальних за експресію
різних білків і, як наслідок, за прояв певних ознак) дозволило виявити,
що “вибивання” гену, який кодує здатність клітини до експресії
кальцій-зв’язуючого протеїну парвальбуміна, теж може бути причиною зміни
типу короткочасної пластичності ADDIN REFMGR.CITE
short-term synaptic plasticity
synaptic
plasticity
.
novalerate
effects
Stimulation
citatory Amino Acid
Antagonists
Vitro
Plasticity
Cells
Support,Non-U.S.Gov't
File
Наявність у клітинах іще одного кальцій-зв’язуючого білка, NSC-1, за
літературними даними теж може інвертувати значення параметру КПС ADDIN
REFMGR.CITE
elevated levels of neuronal calcium sensor-1
elevated levels of neuronal calcium
sensor-1
4-Kinase
Potentials
Channels
Signaling
Proteins
Culture
effects
Stimulation
Potentials
Fluorescent
Proteins
Proteins
Plasticity
ansmitters
gy
Terminals
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Transmission
File
При аналізі констант часу спаду постсинаптичних струмів нами
спостерігалася подібна ситуація – значення (спаду при використанні
розчину з [Ca2+]o = 0,5 мМ виявились достовірно (P
receptors in CA1 pyramidal cells
receptors in CA1 pyramidal
cells
amma-Aminobutyric Acid
Concentration
m
Inhibition
ters
Techniques
gy
Cells
.S.Gov't,P.H.S.
naptic Transmission
File
до яких позасинаптичні ГАМК-рецептори в пірамідних нейронах гіпокампу
мають більш уповільнену кінетику у порівнянні з синаптичними.
Цікаво, що у постсинаптичних струмів, викликаних стимуляцією аксона (за
нормального вмісту іонів кальцію у розчині), константи часу спаду теж
характеризувались більшими (хоча й недостовірно, t-тест Ст’юдента)
значеннями, ніж (спаду вГПСС поодиноких синапсів (за таких самих
зовнішньоклітинних умов). Виходячи з запропонованої гіпотези, кількість
позасинаптичних рецепторів, з якими в разі “переливу” зв’яжуться
молекули ГАМК, при стимуляції аксона, очевидно, виявиться більшою, ніж
при подразненні поодинокої терміналі. Тобто в природних умовах
імовірність вивільнення медіатора (в середньому по всіх терміналях, що
активуються одночасно) в синаптичних з’єднаннях між інтернейронами та
пірамідними клітинами гіпокампу є значною величиною, яка здатна
спричинити ефект “переливу” ГАМК.
З точки зору синаптичної передачі кальцієві депо ендоплазматичного
ретикулума можуть виступати наступним (за значимістю) після зовнішнього
середовища джерелом іонів кальцію, необхідних для вивільнення
нейромедіатора ADDIN REFMGR.CITE
signalling
signalling
Signaling
Reticulum
earch
Support,Non-U.S.Gov't
File
Calcium.
Calcium.
вивільнення іонів кальцію з депо ендоплазматичного ретикулуму на
характеристики гальмівних постсинаптичних струмів, викликаних
стимуляцією поодинокої терміналі, на різних рівнях синаптичної передачі
показало, що зменшення відносної амплітуди вГПСС спостерігалось при
збудженні як одного, так і багатьох синаптичних закінчень одразу.
Оскільки інтегральні вГПСС пригнічувались в більшій мірі, ніж викликані
стимуляцією поодинокої терміналі, можна припустити, що або регуляція
може відбуватись і в аксонах пресинаптичний клітин (це – єдина ланка
нейропередачі, яка була “відключена” за допомогою специфічного блокатору
Na+-каналів при стимуляції поодиноких терміналей, у порівнянні з
подразненням цілих аксонів), або ж, активуючись одночасно у великій
кількості, постсинаптичні рецептор-канальні комплекси опосередковують
струми, які складним чином взаємодіють між собою. Друга можливість
вважається нам більш імовірною, хоча й відомо, що кальцієві депо
ендоплазматичного ретикулуму можуть впливати на роботу
Na+/Ca2+-обмінника в епітеліальних клітинах ADDIN REFMGR.CITE
Ca2+ extrusion from freshly isolated rabbit aortic endothelial
cells
Ca2+ extrusion from freshly isolated rabbit aortic endothelial
cells
Breemen,C.
Aorta,Thoracic
Signaling
Separation
ative
Study
Reticulum
xtracellular
Space
Support,Non-U.S.Gov't
in
File
Calcium.
Calcium.
серцевих клітинах ADDIN REFMGR.CITE
for protein kinase A-mediated potentiation of cardiac sodium
current
for protein kinase A-mediated potentiation of cardiac sodium
current
,C.P.
Sequence
Sites
AMP-Dependent Protein Kinases
Reticulum
Activation
s
Potentials
Sequence
Data
Support,Non-U.S.Gov't
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Homology,Amino
Acid
Transduction
Channels
File
ефект пригнічення постсинаптичної відповіді може бути частково
пов’язаним з прямою, а не опосередкованою вивільненням кальцію дією
кофеїну (наприклад, виступаючи інгібітором циклічної аденозин
3′,5′-монофосфат фосфодіестерази, яка приймає участь у
G-білок-опосередкованих процесах функціонування ADDIN REFMGR.CITE
inhibitor- and dibutyryl cGMP-evoked calcium influx in rat pituitary GH3
cells
inhibitor- and dibutyryl cGMP-evoked calcium influx in rat pituitary GH3
cells
Channels
l Cyclic
GMP
effects
yclic
rase Inhibitors
Gland
File
Lett.
Lett.
Незмінність за умови спустошення кальцієвих депо ендоплазматичного
ретикулуму такого важливого показника, як коефіцієнт парної стимуляції,
на нашу думку, вказує на те, що механізми, відповідальні за відновлення
запасу готових до вивільнення везикул у пресинаптичній терміналі, не
зазнають впливу кофеїну, або ж такий вплив є мінімальним ADDIN
REFMGR.CITE
plasticity
Potentials
Plasticity
pses
File
Потрібно відзначити, що зміни такого складного процесу, як пластичність
при парній стимуляції, навряд чи регулюються лише якимось одним
чинником. І при подальших дослідженнях слід очікувати прояву не тільки
складних регуляторних процесів, які відбуваються як на пре-, так і на
постсинаптичних ділянках, а й можливих складних взаємодій між ними.
Висновки
За допомогою методів позаклітинної електричної стимуляції та фіксації
потенціалу на мембрані культивованих нейронів гіпокампу було досліджено
короткочасну пластичність гальмівної синаптичної передачі. Показано, що
у регуляції гальмівної синаптичної передачі між культивованими нейронами
гіпокампу приймають участь не тільки ті кальцієві депо ендоплазматичного
ретикулуму, що зосереджені безпосередньо у пресинаптичному закінченні, а
й такі, що розташовані в постсинаптичних клітинах.
За характером короткочасної синаптичної пластичності при парній
стимуляції ГАМК-ергічні зв’язки між культивованими нейронами можна
розділити на дві групи, одна з яких демонструє депресію, а друга –
полегшення. При цьому параметри викликаних гальмівних постсинаптичних
струмів у цих групах не відрізняються.
Показано, що пластичність залежить від агоніст-активованого спустошення
ріанодин-чутливих кальцієвих депо. Вичерпання запасів депонованого
кальцію збільшує ступінь депресії при парній стимуляції у відповідній
групі клітин. В той самий час кофеїн-індуковане спустошення депо,
пригнічуючи постсинаптичні струми, не змінює пластичності синаптичної
передачі, залежної від використання, в жодній з груп клітин.
На поодиноких синаптичних терміналях за нормальних умов спостерігається
тільки депресія при парній стимуляції. Зовнішньоклітинна концентрація
іонів кальцію істотно впливає на характер короткочасної пластичності
синаптичних зв’язків між культивованими нейронами гіпокампу: її
підвищення здатне збільшувати ступінь депресії при парній стимуляції
поодинокої терміналі, а зниження – інвертувати депресію у полегшення.
При цьому зміна величини деполяризації поодинокої синаптичної терміналі
якісно не впливає на форму короткочасної пластичності за використаних
зовнішньоклітинних концентрацій кальцію.
Спустошення ретикулярних кальцієвих депо при стимуляції як поодинокої
терміналі, так і багатьох закінчень одного аксона за допомогою кофеїну
пригнічує постсинаптичні струми, проте ефективність синаптичного зв’язку
залишається на тому самому рівні. Постсинаптичні струми, викликані
стимуляцію поодинокої терміналі, пригнічуються у меншій мірі в
порівнянні з такими, що виникають при активації багатьох синаптичних
закінчень одночасно.
Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації
Статті
Kravchenko, M.O., Moskalyuk, A.O., Kolodin, Yu.O., Veselovsky, N.S.,
Fedulova, S.A. Activation of ryanodine receptors influences the
pair-pulsed depression in cultured rat hippocampal neurons //
Фізіологічний журнал.- 2004.-Т.50, №4.- С. 50-56.
Kravchenko, M.O., Moskalyuk, A.O., Fedulova, S.A., Veselovsky, N.S.
Calcium-dependent changes of paired-pulse modulation at single GABAergic
synapses // Neuroscience Letters.- 2006.- Vol.395,№2.– P.133-137
Кравченко Н.А, Москалюк А.А, Федулова С.А., Веселовский Н.С. Влияние
внеклеточной концентрации кальция и силы стимуляции на кратковременную
пластичность в одиночных тормозных синапсах в культуре нейронов
гиппокампа // Нейрофизиология/Neurophysiology.– 2006.- Т.38, №2. – С.
96-102
Тези доповідей
Kravchenko, M., Moskalyuk, A., Fedulova, S., Veselovsky, N. Modulation
of GABA-mediated currents by CICR // Proc. of Second Kiev Symposium
“Smooth Muscle Physiology and Biophysics”.- Kiev
(Ukraine).-Neirofiziologiya/Neurophysiology.-2003.- Vol.35, №3/4.- P.
356.
Kravchenko, M., Moskalyuk, A., Kolodin, Yu., Fedulova, S., Veselovsky,
M. Influence of caffeine on inhibitory synaptic transmission in cultured
hippocampal neurons // Proc. of Conference for Young Scientists
“Perspective directions of scientific investigations”.- Kiev (Ukraine).-
Neirofiziologiya/Neurophysiology.- 2004.- Vol.36, №1.- P. 81-82.
Kravchenko, M., Moskalyuk, A., Kolodin, Yu., Fedulova, S., Veselovsky,
N. Influence of ryanodine-receptor agonists on short-term depression in
cultured rat hippocampal neurons // Proc. of First (Inaugural) Ukrainian
Congress for Cell Biology.- Lviv (Ukraine).- 2004.- P. 312.
Kravchenko, M., Moskalyuk, A., Kolodin, Yu., Veselovsky, N., Fedulova,
S. Agonists of Endoplasmic Reticular Ryanodine-Receptors Inhibit
Synaptic Transmission in Cultured Rat Hippocampal Neurons // Proc. of
International Workshop in Cell Physiology “Transport Mechanisms Across
Cell Membranes: Channels and Pumps”.- St.Petersburg (Russia).- 2004.-
P.39.
Кравченко М.О., Москалюк А.О., Федулова С.А., Веселовський М.С.
Регуляція короткочасної синаптичної пластичності за рахунок спустошення
кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму // Матеріали ІІ
науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні
проблеми фармакології та токсикології”.- Київ. – К.: Архетип, 2005. – С.
31-32.
Анотація
Кравченко М.О. “Кальцієва регуляція гальмівної синаптичної передачі між
нейронами культури гіпокампу”. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.02 – біофізика – Інститут фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006
Дисертація присвячена дослідженню впливу кальцієвих депо
ендоплазматичного ретикулуму на короткочасну пластичність гальмівної
синаптичної передачі між культивованими нейронами гіпокампу щура.
Використання методик електричної позаклітинної стимуляції нервового
волокна та поодинокого синаптичного закінчення в комбінації з фіксацією
мембранного потенціалу, а також швидкою локальною суперфузією дало змогу
дослідити характеристики постсинаптичних струмів і пластичність при
парній стимуляції. На прикладі розгляду популяції культивованих нейронів
гіпокампу новонароджених щурів було продемонстровано наявність двох груп
клітин, для яких характерні різні види пластичності при парній
стимуляції – депресія та полегшення. Показано, що спустошення
ретикулярних кальцієвих депо пригнічує не тільки амплітуду ГАМК-ергічних
постсинаптичних струмів, а й регулює силу короткочасної синаптичної
пластичності, але в той самий час не змінює якісно її характеру й не
впливає на кінетичні характеристики гальмівних струмів. Вивчено
залежності параметрів ГАМК-ергічних струмів при парній стимуляції
поодинокої пресинаптичної терміналі від амплітуди стимулюючої напруги та
зовнішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Було зроблено висновок
про те, що як пре-, так і постсинаптичні кальцієві депо
ендоплазматичного ретикулуму можуть відігравати суттєву роль у регуляції
викликаних гальмівних постсинаптичних струмів.
Ключові слова: Кальцієві депо, короткочасна синаптична пластичність,
викликані гальмівні постсинаптичні струми, культура нейронів гіпокампу.
Аннотация
Кравченко Н.А. “Кальциевая регуляция тормозной синаптической передачи
между нейронами культуры гиппокампа”. – Рукопись
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.02.– биофизика – Институт физиологии им.
А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006.
Диссертация посвящена исследованию влияния кальциевых депо
эндоплазматического ретикулума на кратковременную пластичность тормозной
синаптической передачи между культивированными нейронами гиппокампа
крысы. Использование методик электрической внеклеточной стимуляции
нервного волокна и одиночного синаптического окончания в комбинации с
фиксацией мембранного потенциала, а также быстрой локальной суперфузии
дало возможность изучить характеристики постсинаптических токов и
пластичность при парной стимуляции. На примере рассмотрения популяции
культивированных нейронов гиппокампа новорожденных крыс было
продемонстрировано наличие двух групп клеток, для которых характерны
различные виды пластичности при парной стимуляции – депрессия и
фасилитация. Показано, что опустошение ретикулярных кальциевых депо
угнетает не только амплитуду ГАМК-эргических постсинаптических токов, а
и изменяет силу кратковременной синаптической пластичности, и в то же
самое время не изменяет качественно ее характера и не влияет на
кинетические характеристики тормозных токов. Изучены зависимости
параметров ГАМК-эргических токов при парной стимуляции одиночной
пресинаптической терминали от амплитуды стимулирующего напряжения и
внеклеточной концентрации ионов кальция. Был сделан вывод о том, что как
пре-, так и постсинаптические кальциевые депо эндоплазматического
ретикулума могут играть существенную роль в регуляции вызванных
тормозных постсинаптических токов.
Ключевые слова: Кальциевые депо, кратковременная синаптическая
пластичность, вызванные тормозные постсинаптические токи, культура
нейронов гиппокампа.
annotation
Kravchenko M.O. Calcium regulation of inhibitory synaptic transmission
between neurons in hippocampal culture. – Manuscript
Thesis for Candidate of Sciences degree in speciality 03.00.02 –
biophysics – Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of
Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.
This work is devoted to investigation of influence of calcium stores of
endoplasmic reticulum on short-term plasticity of inhibitory synaptic
transmission between cultured rat hippocampal neurons. Using such
techniques like electrical external stimulation of the nerve fiber and
of a single synaptic ending together with patch-clamp and fast local
superfusion techniques allowed the studying of characteristics of evoked
inhibitory postsynaptic currents (eIPSCs) and their paired-pulse
modulation. Experiments with consecutive excluding of postsynaptic
(investigation of spontaneous activity) and presynaptic factors
((-aminobutyric acid-induced currents) allowed to conclude that either
pre- or postsynaptic calcium stores may play an essential role in
regulation of evoked inhibitory postsynaptic currents.
By the example of examination of population of cultured hippocampal
neurons taken form newborn rats the existence of two cell groups
distinguished by different short-term synaptic plasticity patterns –
paired-pulse depression (PPD, 64% of cases) and facilitation (PPF, 36%
of cases)– was shown. Differences of parameters of eIPSCs between groups
were evaluated and found to be not statistically significant. On the
basis of literature data analysis it was concluded that differing
paired-pulse modulation patterns are due to origin of presynaptic cells
in culture from various regions of the hippocampus.
It was demonstrated that emptying of reticular calcium stores by
initiating of calcium-induced calcium release (extracellular application
of either caffeine or ryanodine) not only inhibits the amplitude of
GABAergic postsynaptic currents but also modulates the strength of
short-term synaptic plasticity. At the same time, neither its pattern
nor kinetic properties of inhibitory currents were subjects to change.
Depletion of calcium stores, evoked by ryanodine application, produced
more pronounced depression in a group of cells with paired-pulse ratio
less than 1. At the same time caffeine-induced depletion, inhibiting
postsynaptic currents, did not changed the use-dependent plasticity in
any group of cells.
Dependencies of parameters of GABAergic currents evoked by paired-pulse
stimulation of a single presynaptic terminal on amplitude of the
stimulus voltage and extracellular concentration of calcium ions
([Ca2+]o) were examined. Under normal conditions only paired-pulse
depression was observed in neurons. Inverse U-shaped eIPSCs amplitude vs
stimulus strength relationships were obtained and attributed to
peculiarities of voltage dependencies of Ca2+ channels in presynaptic
terminals. It appeared that increasing of [Ca2+]o led to more pronounced
form of paired-pulse depression while decreasing induced reversion from
PPD to PPF. The latter was accompanied by dramatic changes of all eIPSCs
parameters in average. The shapes of dependencies of characteristics on
stimulus voltage remained unchanged excluding the probability of release
diagram, which showed saturation effect at high stimulus voltages.
Comparison of effects of caffeine application on IPSCs’ characteristics
during single-terminal or whole-axon stimulation revealed slight
distinctions that could be explained in scope of involvement of
different quantities of synaptic endings in the process of
neurotransmission. In particular, more than two-fold augmentation of
coefficient of variance of amplitudes of eIPSCs for whole axons
(comparing to its decrease for single synapses) was attributed to
possibility of synapses’ location either on proximal or on distal
dendrites of the neuron in the first case. Invariability of such an
essential characteristic like paired-pulse ratio during depletion of
internal calcium stores of endoplasmic reticulum indicates that
mechanisms responsible for recovery of readily-releasable pool of
vesicles in presynaptic terminal are not influenced by caffeine.
The data reported essentially broaden the up-to-date knowledge about the
mechanisms responsible for calcium-dependent regulation of efficiency of
inhibitory synaptic connections in central nervous system.
Keywords: Calcium stores, short-term synaptic plasticity, evoked
inhibitory postsynaptic currents, cultured hippocampal neurons.
PAGE 1
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter