.

Каротиногенез у різних штамів дріжджів phaffia rhodozyma та їх застосування у живленні курей-несучок (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
131 2861
Скачать документ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

КАМІНСЬКА МАРТА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.1:579.22:663.12/14:636.087

Каротиногенез у різних штамів дріжджів phaffia rhodozyma та їх
застосування у живленні курей-несучок

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Львів – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор Сологуб Леонід
Ілліч, Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну
речовин.

Офіційні опоненти : доктор сільськогосподарських наук, старший науковий
співробітник

Стапай Петро Васильович,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії фізіолого-біохімічних основ
вовноутворення;

доктор біологічних наук, професор

Гончар Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляторних систем клітини.

Провідна установа – Державний науково-дослідний контрольний інститут
ветпрепаратів і кормових добавок, відділ фармакології та імунології
Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист відбудеться “ 14 ” березня 2006 р.
о “ 10 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої
ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: вул.
Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий “ 13 ” лютого
2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Віщур О. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Організація повноцінного живлення тварин і птиці –
необхідна умова інтенсифікації сучасного тваринництва. Велике значення
при цьому має забезпечення раціонів білково-вітамінними добавками,
ферментними препаратами, амінокислотами та іншими біологічно активними
речовинами (БАР), які прискорюють ріст та підвищують продуктивність
тварин і птиці (Калунянц К. А., Ездаков Н. В., Пивняк И. Г.,1980).

Одним із важливих джерел балансування кормів сільськогосподарських
тварин і птиці є дріжджі. В Україні традиційними кормовими дріжджами є
Saccharomyces cerevisiae i Candida tropicalis. За даними літератури
(Квасников Е.И., Щелокова И.Ф., 1991), добавка їх біомаси до корму не
забезпечує повної його збалансованості за біологічно активними
речовинами. Тому створення нових кормових препаратів залишається
актуальним. Резервом для цього є нетрадиційні дріжджі, які здатні
синтезувати широкий спектр біологічно активних речовин. До них належать,
наприклад, дріжджі Pichia guilliermondii і Candida famata, які здатні
синтезувати підвищені кількості вітаміну В2, та Phaffia rhodozyma,
біомаса яких є джерелом каротиноїдів та інших біологічно активних
речовин.

В Україні виробництво кормових дріжджів, як джерела каротиноїдів не
налагоджено. Біомасу, збагачену каротиноїдами, виготовляють з
використанням як продуцента гетероталічного мукорового гриба Blakeslea
trispora (Феофилова Е. П., 1994). Вартість такої біомаси досить висока,
що робить її малодоступною для більшості господарств. Відомо, що
каротиноїди є важливими компонентами системи антиоксидантного захисту
(САЗ) в організмі тварин (Olson J., 1993). Вони відіграють значну роль в
інактивації активних форм кисню, котрі негативно впливають на організм
(Куртяк Б. М., Янович В. Г., 2004). Тому доцільно селекціонувати штами,
що синтезують підвищені кількості каротиноїдів для збагачення раціону
тварин і птиці цими біологічно активними речовинами.

У літературі є мало даних стосовно селекції та залежності каротиногенезу
від умов вирощування штамів дріжджів P. rhodozyma, їх біохімічної
характеристики та застосування у годівлі тварин, зокрема птахів. Тому
отримання штамів, надсинтетиків каротиноїдів, вибір оптимальних умов
вирощування, біохімічна характеристика селекціонованих штамів та
дослідження впливу біомаси як кормової добавки на організм птиці є
актуальною проблемою для цієї галузі тваринництва.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт лабораторії
мікробіологічного синтезу біологічно активних речовин Інституту біології
тварин УААН і виконувалась у межах таких завдань: “Розробити ефективні
способи отримання нових форм вітамінів, білково-вітамінних препаратів на
основі сучасних біотехнологічних методів та вивчити фізіолого-біохімічні
основи їх використання” (номер держреєстрації 0198U009006); “Селекція
нових штамів мікроорганізмів – продуцентів біологічно активних речовин
та розроблення технології їх виробництва” (номер держреєстрації
0101U003436), в яких автор досліджувала умови селекції та біохімічний
склад біомаси, процеси перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та зміни
стану САЗ у курей за умов використання у раціоні біомаси дріжджів P.
rhodozyma.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було отримати штами дріжджів
P. rhodozyma з підвищеним рівнем синтезу каротиноїдів, встановити
оптимальні умови вирощування для посиленого каротиногенезу, провести їх
біохімічну характеристику, з’ясувати вплив добавки біомаси
селекціонованих штамів на інтенсивність ПОЛ, активність ферментів САЗ в
організмі молодняку і курей-несучок, їх продуктивність та якість яєць.

У задачі роботи входили дослідження:

– факторів, що викликають мутації в напрямку надсинтезу каротиноїдів у
дріжджів P. rhodozyma;

– умов вирощування мутантних штамів для максимальної продукції
каротиноїдів;

– біохімічних параметрів штамів-надсинтетиків;

– впливу добавки каротиносинтезуючих дріжджів на процеси ПОЛ і САЗ у
курей-несучок та молодняку курей, продуктивність та якість яєць.

Об’єкт дослідження. Каротиногенез та селекція у штамів дріжджів P.
rhodozyma – надсинтетиків каротиноїдів, САЗ та ПОЛ у курей-несучок та
молодняку.

Предмет дослідження. Визначення продуктивності культур P. rhodozyma за
кількістю каротиноїдів, визначення продуктів ПОЛ, активності ферментів
САЗ, якості яєць, умов селекції, вирощування штамів-надсинтетиків.

Методи дослідження. Біохімічні – визначення білкового та ліпідного
складу клітин різних штамів, вмісту каротиноїдів, кількісного вмісту
продуктів ПОЛ та показників САЗ; морфометричні – визначення якості яєць;
генетичні – отримання штамів-надсинтетиків; статистичні – оцінки
вірогідності одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті ступінчатої селекції
штамів дріжджів P. rhodozyma отримано нові штами-мутанти, що синтезують
підвищені кількості каротиноїдів (до 1 мг/г сухої маси (мг/г с. м.)).
Підібрано оптимальні умови вирощування селекціонованих штамів для
максимального росту і каротиногенезу.

Вперше досліджено білковий та ліпідний склад штамів дикого типу і
селекціонованих варіантів. При цьому встановлено характерні особливості
у біохімічному складі біомаси дріжджів P. rhodozyma. Для них характерним
є високий вміст лізину (до 5 %) та низький вміст метіоніну (до 0,1 %), а
також високий вміст ненасичених жирних кислот, зокрема олеїнової.

Показано позитивний вплив добавки біомаси дріжджів P. rhodozyma до корму
на процеси ПОЛ і активність ферментів САЗ в тканинах курей,
продуктивність та якість яєць. Встановлено зростання вмісту каротиноїдів
у жовтку яєць у 2,3 раза при заміні 2 % кормових дріжджів такою ж
кількістю каротиносинтезуючих дріжджів селекціонованого штаму.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано штам 6с дріжджів
P. rhodozyma, надсинтетик каротиноїдів, що синтезує близько 1 мг
каро-тиноїдів на грам сухої маси, придатний для промислового
вирощування. Вивчено оптимальні умови культивування для отримання
біомаси з високим вмістом каротиноїдів. Дріжджова біомаса, збагачена
каротиноїдами використана у складі комбікормів для курей-несучок.
Введення 2 % біомаси дріжджів P. rhodozyma до раціону курей підвищує їх
продуктивність, збільшує масу яєць та покращує їх якість.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто підготувала обґрунтування
теми дисертаційної роботи, провела підбір і опрацювання літератури за
темою дисертаційної роботи, розробила методичні підходи до вирішення
поставлених завдань, освоїла необхідні методи досліджень, виконав
експериментальну частину роботи. Планування, аналіз та обговорення
результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної
роботи доповідались на таких наукових конференціях:

– міжнародній конференції “Фізіологія і біохімія сільськогосподарських
тварин”, присвяченій 100-річчю від дня народження професора С. З.
Гжицького (м. Львів, 2000 р.);

– аспірантській конференції, присвяченій 85-річчю від дня народження
професора З. П. Скородинського (м. Львів, 2000 р.);

– науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів
“Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва” (м. Львів,
2003 р.);

– міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю від
дня народження професора П. З. Лагодюка (м. Львів, 2004 р.);

– ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Біотехнологія.
Освіта. Наука” (м. Львів, 2004р.);

– науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів
“Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва” (м. Львів,
2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових
робіт, включаючи 6 статей і 1 тези, з них 4 – у фахових виданнях,
отримано 1 патент на корисну модель.

Структура і об’єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів, власних досліджень, аналізу і
узагальнення результатів досліджень, висновків і пропозицій виробництву,
списку використаних джерел літератури. Обсяг дисертації – 144 сторінки,
в тому числі 30 таблиць і 5 рисунків (13 сторінок). Список використаних
джерел включає 273 публікації, у тому числі 187 – закордонних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Складається з 3 підрозділів, у яких наведено дані
літератури стосовно використання каротиноїдів у різних сферах
життєдіяльності людини, годівлі тварин, характеристиці та використанню
каротиносинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma.

Загальна методика та основні методи досліджень. При виконанні роботи
використовували штами дріжджів Phaffia rhodozyma: ВКМ 2274 – штам дикого
типу з Всесоюзної колекції мікроорганізмів; NRRL Y-10921 – штам дикого
типу, люб’язно наданий доктором біологічних наук, професором, п. М. В.
Гончаром (Інститут біології клітини, м. Львів). Дріжджі P. rhodozyma
штаму ВКМ-2274 культивувались у середовищі такого складу: КН2РО4 – 2
г/л; МgSO4x7H2O – 1 г/л; (NH4)2SO4 – 1 г/л; сахароза – 20 г/л; вітамін
В1 – 200 мкг/л, у колбах Ерленмейера об’ємом 500 мл із 100 мл середовища
при температурі 24 °С і постійному перемішуванні протягом 5-и діб. Для
штаму NRRL Y-10921 та його похідних використовувалось середовище такого
складу: КН2РО4 – 1 г/л; МgSO4x7H2O – 0,5 г/л; (NH4)2SO4 – 2 г/л; CaCl2
х6 Н2О – 0,1 г/л, дріжджовий екстракт – 2 г/л, сахароза – 20 г/л, біотин
– 2 г/л, до якого для окремих дослідів вносили у відповідних
концентраціях джерела вуглецю й азоту. Для приготування середовищ з
промисловими субстратами використовували профільтровану післяспиртову
барду, мелясу і пивне сусло. Культивування проводилось у колбах
Ерленмейера на 500 мл із 100 мл середовища при температурі 20 °С і
постійному перемішуванні протягом 5 діб.

Дослідження умов культивування (температури, аерації) проводились у
апараті неперервного культивування АНКУМ-2М (загальний об’єм ферментера
20 л, робочий – 10 л) з мішалкою (300 об/хв). Засів проводили інокулятом
2-добової культури з розрахунку 0,3 – 0,5 г клітин/л середовища.

Для досягнення поставленої мети нами було проведено чотири етапи
досліджень.

На перших етапах вивчали умови мутагенезу (тип мутагену, час дії), які
забезпечили отримання штамів-надсинтетиків за ознакою каротиногенез.
Визначали летальну та мутагенну дію мутагенів (нітрозогуанідин,
УФ-промені) методом макроколоній (Суденко В. І., Квасников Є. І., 1977;
Стент Г., Кэлиндар Р., 1981). Досліджували залежність виживання клітин
після обробки УФ-променями від вмісту в них каротиноїдів.

У другій серії дослідів вивчали каротиногенез за оптимальних умов
вирощування штаму-надсинтетика (вибір джерела вуглецю, азоту,
промислових середовищ, кількості посівного матеріалу, температури,
аерації, динаміки росту). Після вирощування культури визначали біомасу
дріжджів (Егоров Н. С., 1986), вміст каротиноїдів (Крицкий М. С.,
Чернышева и др.,1977) та продуктивність культури.

Після вибору оптимальних умов вирощування клітин штаму-надсинтетика
отриману біомасу досліджували за біохімічним складом: вмістом сирого
протеїну (Остапець Н. Г., Романська Н. М., 1974), амінокислотним складом
(Алексеенко, 1964), вмістом загальних ліпідів (Folch J., Lee M. е. a.,
1957), співвідношенням окремих класів ліпідів (Кирхнер Ю., 1981),
жирнокислотним складом ліпідів (Кейтс, 1975). У біомасі дріжджів
визначали перетравність клітин мутантного штаму (Остапець Н. Г.,
Романська Н. М., 1974) у порівнянні з вихідним штамом та традиційними
кормовими дріжджами.

З метою з’ясування впливу згодовування у складі комбікормів біомаси
дріжджів надсинтетиків каротиноїдів Phaffia rhodozyma на організм курей
і якість яєць проведено два досліди.

Перший дослід проведено у віварії Інституту біології тварин УААН на
молодняку курей яєчного напряму продуктивності кросу Ломанн Браун
починаючи з 30-денного віку. Було сформовано дві групи курей (контрольну
і дослідну) по 20 голів у кожній, яким згодовували комбікорм ПК 3-4 ДСТУ
№ 18221-72. Для дослідної групи 2 % кормових дріжджів заміняли
відповідною кількістю дріжджів Phaffia rhodozyma штаму 6с. Утримання і
годівля курчат відповідали загальноприйнятій технології утримання
молодняку курей. Контрольний і дослідний комбікорми були
ізопротеїновими, ізокалорійними та збалансованими за основними
елементами живлення. Тривалість досліду – 60 днів. У кінці досліду
проведено забій птиці по 5 голів з групи і забір тканин для проведення
біохімічних досліджень. У крові, тканинах печінки, підшлункової залози,
слизової 12-палої кишки та яйцепроводу визначали вміст гідропероксидів
ліпідів (Мирончик В. В., 1984) і малонового діальдегіду (Мартинюк В. Б.
та ін., 1991).

Другий дослід проведено у господарстві ВАТ “Птахофабрика “Львівська” (с.
Заставне, Буський р-н, Львівська обл.) на двох групах (контрольній і
дослідній) курей-несучок кросу Ломанн Браун по 50 голів у кожній, віком
180 днів. Утримання і годівля курей відповідали загальноприйнятій
технології кліткового утримання птиці з вільним доступом до корму і
води. Курям контрольної та дослідної груп згодовували комбікорми ПК 1-18
ДСТУ № 18221-72.

Аналогічно досліду, проведеному на молодняку курей, у дослідному
комбікормі замінювали 2 % кормових дріжджів відповідною кількістю
каротиносинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma. Комбікорми були
збалансованими за основними елементами живлення.

Тривалість досліду – 60 днів. Протягом досліду вели облік яєчної
продуктивності. У кінці досліду провели забій птиці по 5 голів з групи
і взяли тканини для проведення біохімічних досліджень. У крові і тканині
печінки визначали вміст гідропероксидів ліпідів (Мирончик В. В., 1984) і
малонового діальдегіду (Мартинюк В. Б. та ін., 1991), а також
активність антиоксидантних ферментів: супероксиддисмутази КФ 1.15.1.1
(Дубініна Е. Е. та ін., 1983), каталази КФ 1.11.1.6 (Королюк М. А. та
ін., 1988), глутатіонпероксидази КФ 1.11.1.9 (Моин В. М., 1986). Для
визначення якості яєць з кожної групи було відібрано по 10 яєць, у яких
досліджували вміст каротиноїдів (Маслієва О. І., 1975), вітамінів А і Е
(Скуріхін В. Н., 1991) та морфометричні показники яєць (Методики
досліджень з фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин, 1998).

Біометричну обробку одержаних результатів проводили на ПК за допомогою
програми Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Отримання мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma – надсинтетиків
каротиноїдів за допомогою нітрозогуанідину та УФ-опромінення. Методом
ступінчастої селекції з використанням нітрозогуанідину, коли відібраний
мутант на першому етапі служить вихідним штамом на наступному етапі,
отримано штами-надсинтетики, що синтезували приблизно у 3 – 4 рази
більше каротиноїдів, ніж дикий штам. Однак, із кожним наступним етапом
селекції спостерігається зменшення ефективності мутагенезу (у 3,5 та 1,7
раза відповідно на II та III етапах селекції).

У наших дослідженнях при дії УФ-опромінення на клітини дріжджів P.
rhodozyma відзначено значно більшу стійкість до мутагену клітин штамів з
підвищеним у 2,4 раза (р(0,05) вмістом каротиноїдів, ніж штаму вихідного
типу. При опроміненні виживає у 2 рази (рl?af ue th @ B ??f I ????? ??? ??????? ???? ??????? ????! ?? ????? ????? ?!?Характеристика хімічного складу клітин мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma. У клітинах мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma вміст протеїну, порівняно з вихідним штамом дикого типу коливається від 22,8 до 26,9 %. Співставлення амінокислотного складу біомаси дикого та мутантного штаму 6с дріжджів P. rhodozyma вказує, що між ними немає достовірних відмінностей у вмісті окремих амінокислот. Для цих дріжджів характерний високий (до 5 %) вміст лізину, що збільшує цінність біомаси при використанні її як кормової добавки до раціону тварин, та низький (до 0,1 %) вміст метіоніну. У біомасі штаму-надсинтетика 6с в 1,9; 4; 2,5; 1,9; 1,8 раза більший вміст відповідно лізину, гістидину, аргініну, гліцину та лейцину і в 3,8 раза нижчий вміст метіоніну, ніж для кормових дріжджів, що використовуються в раціонах тварин та птиці як джерело амінокислот та вітамінів. Порівнюючи жирнокислотний склад клітин мутантних та вихідного штамів, відзначено менший вміст стеаринової (на 2 – 4 %) та олеїнової (на 5 – 11 %) кислот (табл. 1). Для штамів 3с та 14а характерною виявилась більша кількість ненасичених жирних кислот на 9,5 та 8 % відповідно за рахунок збільшення вмісту лінолевої та ліноленової кислот. Ліпіди біомаси штаму 6с містять на 1,5 % більше насичених жирних кислот, у порівнянні з вихідним штамом. Аналізуючи дані щодо жирнокислотного складу дріжджової біомаси, нами відзначено значний вміст ненасичених жирних кислот, таких як олеїнова, лінолева, ліноленова (сумарно біля 84 %) та насичених таких як пальмітинова. Порівнюючи жирнокислотний склад кормових дріжджів відзначаємо більший вміст у біомасі каротинсинтезуючих дріжджів штаму 6с пальмітинової (в 1,3 раза), стеаринової (в 1,6 раза) та олеїнової (у 2,2 раза) кислот на фоні меншого вмісту лінолевої (в 3,9 раза), що робить таку біомасу цінною ліпідною добавкою до раціонів тварин і птахів. Таблиця 1 Жирнокислотний склад ліпідів дріжджів P.rhodozyma, % (М+m, n=3). Код кис-лоти Штами дріжджів P.rhodozyma 10921 6с 3с 14а Лауринова 12:0 0,08(0,02 0,07(0,02 0,03(0,01 0,02(0,01 Міристинова 14:0 0,50(0,01 0,63(0,02 ** 0,15(0,01 *** 0,26(0,02 *** Пальмітинова 16:0 15,92(0,62 19,45(1,12 11,53(0,73 * 11,20(0,59 ** Пальмітолеїнова 16:1 2,26(0,07 2,26(0,07 0,78(0,06 *** 1,15(0,04 *** Стеаринова 18:0 7,48(0,89 5,29(0,54 2,82(0,45 ** 4,54(0,47 * Олеїнова 18:1 68,99(2,15 63,54(2,86 47,75(0,98 *** 47,77(1,61 ** Лінолева 18:2 3,44(0,30 7,09(0,44 ** 33,06(1,37 *** 29,24(1,19 *** Ліноленова 18:3 1,31(0,08 1,64(0,06 * 3,87(0,16 *** 5,81(0,11 *** ( насичених 23,98 25,44 14,53 16,02 ( ненасичених 76,00 74,54 85,46 83,97 Загальна сума 99,98 99,98 99,99 99,99 Примітка. Різниця в даному показнику і в показнику для штаму 10921 (дикий тип) вірогідна (*– р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020