.

Біохімічні, структурно-функціональні та метаболічні зміни консервованої крові людини в процесі зберігання при позитивній температурі (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
137 5469
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МАЛИШ ПАВЛО МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.12+612.12]:615.387

Біохімічні, структурно-функціональні та метаболічні зміни консервованої
крові людини в процесі зберігання при позитивній температурі

14.01.32 – медична біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора медичних наук

Луганськ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ
України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Комарєвцева Ірина Олександрівна,
завідуюча кафедри медичної хімії Луганського державного медичного
університету МОЗ України.

Офіційні опоненти:

член-кореспондент АМН України, засл. діяч науки і техніки України,
доктор медичних наук, професор Губський Юрій Іванович, завідувач кафедри
біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного
медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (Київ);

доктор медичних наук, професор Мечетний Юрій Миколайович, завідувач
кафедри проблем людини та філософії здоров’я Східноукраїнського
національного університету ім. В. Даля МОН України (Луганськ);

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, директор
державної установи “Український науково-дослідний інститут медицини
транспорту” МОЗ України (Одеса).

Захист дисертації відбудеться 24 січня 2008 р. о 13.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 при Луганському
державному медичному університеті МОЗ України (м. Луганськ, кв. 50-річчя
Оборони Луганська, 1Г).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного
медичного університету МОЗ України (м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1Г).

Автореферат розісланий “___”__________2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради І.А. Вишницька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Донорська кров – обмежений національний ресурс, і у
зв’язку з цим проблема підвищення об’ємів заготівлі гемотрансфузійних
засобів на цей час є актуальною. Гостро необхідним є приріст донорського
контингенту [Перехрестенко П.М., Назарчук Л.В., Чугрієв А.М., 2003], що
у силу соціально-економічних умов, які мають місце в останні роки,
сформувати непросто. У зв’язку з цим служба крові країни стоїть перед
необхідністю проведення науково-дослідних робіт в області конструювання
нових вітчизняних гемоконсервантів, здатних продовжити термін зберігання
нативних властивостей еритроцитів людини в умовах, що не вимагають
складного й коштовного встаткування, а саме: при позитивній температурі,
з використанням звичайних рефрижераторів, адже гемоконсерванти
“Глюгіцир” (“ГГЦ”) (Росія) і “ЦФДА-1” (США), які найбільш широко
застосовуються в службі крові України, не в змозі забезпечити
функціональну й морфологічну повноцінність основної маси еритроцитів
після 21-ї доби зберігання [Малиш П.М., Орлова О.А., Комарєвцева І.О.,
2004]. У даному аспекті актуальність розробленої теми полягає в
необхідності: а) детального вивчення метаболічних і біохімічних
аспектів “старіння” і загибелі консервованих еритроцитів із
застосуванням сучасних методів дослідження; б) визначення тригерів і
ланок ланцюга альтерацій, на які можливо впливати підбором
коригуючих/моделюючих додатків у рецептуру гемоконсервантів.
Дисертаційна робота в кінцевому її підсумку спрямована на благо здоров’я
нації: створення гемостабілізаторів з досконалішими властивостями щодо
збереження морфофункціональної цілісності консервованих еритроцитів буде
сприяти забезпеченню високої якості гемотрансфузійних середовищ, отже,
ефективній трансфузіологічній допомозі хворим.

Мета дослідження. Визначити роль альтераційних і регуляторних систем у
регламентуванні строку адекватного функціонування консервованих
еритроцитів людини шляхом вивчення біохімічних,
структурно-функціональних і метаболічних змін у процесі зберігання
консервованої крові при позитивній температурі. Виявлення сигнальних
шляхів ушкодження й загибелі еритроцитів консервованої крові.

Завдання дослідження:

З використанням автоматичного гематологічного аналізатора й
люмінесцентної мікроскопії визначити морфологічні й морфометричні зміни
еритроцитів на етапах зберігання консервованої крові.

Простежити динаміку реологічних властивостей консервованої крові та її
залежність від природи й архітектури мікроагрегатів, що утворюються.

Оцінити стан вуглеводного обміну консервованого еритроцита по змінах
показників метаболізму глюкози в еритроциті й плазмі консервованої крові
на етапах зберігання. Визначити вплив різних концентрацій глюкози в
рецептурі гемоконсервантів на ступінь глікозилювання гемоглобіну.

Виявити й оцінити поетапні зміни енергетичної забезпеченості
консервованих еритроцитів, провести кореляційний аналіз їх зв’язку з
морфометричними показниками.

Визначити зміни водно-іонного гомеостазу консервованого еритроцита, для
чого вивчити ЯМР-релаксацію протонів внутрішньоеритроцитарної води та її
кореляційний зв’язок із транспортом іонів через плазматичну мембрану на
етапах зберігання консервованої крові.

Виявити ознаки дестабілізації плазматичної мембрани еритроцита,
вивчивши стан її фосфоліпідної складової, рівень цитозольних ферментів у
плазмі, резистентність консервованих еритроцитів.

Установити наявність фосфоліпідів внутрішнього моношару мембрани на
поверхні консервованого еритроцита з використанням біохімічного набору
для детекції апоптозу.

Установити зміни показників дихальних газів (кисень, діоксид карбону) у
консервованій крові на етапах її зберігання.

Оцінити стан L-аргінін-NO-системи консервованих еритроцитів за
допомогою вивчення змін концентрації нітрит- і нітрат-аніонів при
“старінні” донорської крові.

Простежити сигнальні шляхи загибелі консервованого еритроцита. Визначити
можливість застосування флуоресцентного барвника Lucifer yellow для
підрахунку “тіней” еритроцитів.

Оцінити ступінь антиоксидантного захисту консервованих еритроцитів на
етапах спостерігання.

У завдання даної роботи входило не тільки одержання й обговорення
конкретних лабораторних і клінічних матеріалів, але й розгляд окремих
методичних підходів до оцінки морфофункціонального стану консервованого
еритроцита, і, на основі цього, – до можливості вдосконалення
консервуючих розчинів, вибору гемоконсерванта при заготівлі компонентів
і препаратів з донорської крові, призначених для лікування тих або
інших патологічних станів.

Наукова новизна отриманих результатів. Всі отримані нами дані не тільки
сприяли розвитку розуміння теорії виникнення пошкоджень, що відбуваються
в консервованому еритроциті в міру його “старіння”, але й надали
можливості визначити етапи, на яких реальна корекція альтерацій.

Уперше ми одержали відомості про морфометричні показники консервованих
еритроцитів, обмірювані методом проточної цитометрії.

Уперше встановлений зв’язок механізмів зміни клітинного об’єму зі
змінами кількості протонів води, розрахованих з використанням показників
ЯМР-релаксометрії.

Уперше екстерналізацію фосфатидилетаноламіну в мембрані консервованого
еритроцита розцінено як ознаку апоптичних змін, так само як
екстерналізацію фосфатидилсеріну, виявлену при флуоресцентній
мікроскопії. Уперше показано кореляційний зв’язок визначеної методом
тонкошарової хроматографії елюації фосфоліпідів мембрани еритроцита в
плазму з гематокритом і питомою вагою необоротно змінених форм
еритроцитів на етапах спостерігання.

Уперше встановлено, що ключова роль у формуванні реологічних
властивостей консервованої крові належить еритроцитам. Уточнено
архітектуру агрегатів еритроцитів, з’ясовано, що перехід асоціації
еритроцитів в “монетні стовпчики” до структур більш високого порядку
підвищує в’язкість консервованої крові.

Уперше простежено динаміку дихальних газів на етапах зберігання
консервованій крові, що надало можливості уточнити механізм розвитку
оксидативного стресу й припустити, що однією з основних причин
ушкодження структур еритроцитів (зокрема, ліпідного шару мембрани,
гемоглобіну) є генерація й дія активних форм кисню (АФК).

Уперше для консервованого еритроцита показаний біфункціональний характер
впливу оксиду азоту (NO), низькі концентрації якого грають компенсаторну
антиоксидантну роль, а його гіперпродукція при “старінні” консервованої
крові справляє на еритроцити токсичний вплив, що підтверджено
констатацією виникнення й накопичення тілець Гейнца-Эрліха.

Уперше для консервованого еритроцита встановлена активація метаболічного
шляху монооксиду вуглецю (СО), що дозволило судити про активність
системи гемоксигеназа-СО й зробити висновок про антиоксидантну дію
ферменту гемоксигеназа-1 (ГО-1). Виявлено використання консервованим
еритроцитом і інших природних антиоксидантів, як ферментів
(супероксиддисмутаза (СОД), глутатіонредуктаза (ГР), каталаза), так і
неферментної природи (відновлений глутатіон (ВГ), білірубін (Bi),
сечовина, СО).

Уперше простежено сигнальні шляхи загибелі консервованого еритроцита, що
включають зміни, типові для апоптозу ядерних клітин – оксидативний і
осмотичний стрес (знайдено окремі причини розвитку останнього в
консервованому еритроциті, – залежне від часу накопичення глюкози,
катіонів натрію (Na+) й кальцію (Ca2+)), експресія на поверхні мембрани
фосфоліпідів (ФЛ) внутрішнього моношару, зменшення об’єму клітини.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі показані переваги
вміщуючих у рецептурі аденін і неорганічний фосфат гемоконсервантів, у
тому числі нового гемоконсерванту “Адглюфоцит” (“АГЦ”), створеного
вченими України. Результати досліджень дозволили стверджувати, що
“АГЦ”, маючи необхідні стабілізуючі й консервуючі властивості, протягом
установленого строку зберігання гемотрансфузійного середовища більш
успішно, ніж “ГГЦ”, і в не меншому ступені, ніж “ЦФДА-1”, зберігає
морфофункціональні характеристики еритроцитів. Тому, застосовуючи в
практичній діяльності “АГЦ”, служба крові країни могла б забезпечити
лікувальну мережу високоякісними й ефективними компонентами донорської
крові. Після проведення клінічних випробувань і впровадження
вітчизняного гемоконсерванту очікуються ефекти: а) науково-технічний,
якому сприяють оптимальна збалансованість рецептури, високий рівень
якості й сучасна технологія виробництва; б) економічний, завдяки якому
можливі імпортозаміщення, можливість експорту. Менша технологічна
собівартість нового гемоконсерванту дозволить закладам служби крові
заощаджувати близько 40% коштів, призначених для придбання видаткових
матеріалів; в) соціальний: використання “АГЦ” буде сприяти забезпеченню
високої якості трансфузіологічної допомоги хворим, і в остаточному
підсумку – оздоровленню нації.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора.
Дисертант особисто сформулював мету й завдання дослідження, здійснив
інформаційний пошук і аналіз літературних джерел. Автор самостійно
зробив відбір зразків донорської крові для досліджень, постановку
біохімічних тестів, їхній аналіз. Інтерпретація отриманих
результатів, основні положення й висновки, представлені на
захист, належать авторові. Здобувач особисто провів статистичну обробку
результатів досліджень, підготував до публікації матеріали дисертаційної
роботи, сформулював практичні рекомендації. Опубліковано самостійні, а
також створені в співавторстві роботи.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень, що ввійшли в
дисертацію, апробовані на науково-практичній конференції “Сучасні
проблеми трансфузіології” (Харків, 2004), науковому симпозіумі
“Актуальні й невирішені питання гематології й трансфузіології” (Київ,
2006), семінарі з міжнародною участю “Державна реєстрація, технологія
виробництва, контроль якості й клінічне застосування препаратів
крові” (Луганськ, 2006), II-му міжнародному симпозіумі “Гемостаз –
проблеми та перспективи” (Київ, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 34 наукових працях, у
тому числі 30 статтях, з них 8 без співавторів. Публікації основного
змісту дисертації здійснені в наукових виданнях, затверджених ВАК
України.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 5 розділів, 30
підрозділів, висновків, списку літератури. Викладена на 300 сторінках,
містить 72 таблиці, ілюстрована 50 малюнками. Список літератури включає
530 найменувань.

Робота виконана на кафедрі медичної хімії Луганського державного
медичного університету (зав. кафедри д.мед.н., проф. І.О. Комарєвцева).

ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкт дослідження. Дози консервованої крові здорових донорів однієї
статі (чоловіки), вікової категорії (20-36 років), групи крові (0(I)), у
контейнерах з полівінілхлориду з гемостабілізаторами “ЦФДА-1” (Польща),
“АГЦ” (Україна), і “ГГЦ” (Росія), що зберігалися при температурі (+4 –
+8)0С.

Таблиця 1.

Рецептура гемоконсервантів

Компонент Кількість, г

ГГЦ ЦФДА-1 АГЦ

Натрію цитрату дігидрат 20,0 26,3 16,0

Лимонної кислоти моногідрат

3,27

Глюкози моногідрат 30,0 31,9 30,0

Натрію фосфат одноосновний

2,22 5,0

Аденін

0,275 0,3

Вода для ін’єкцій до 1000 мл до 1000 мл до 1000 мл

Вибір статі донорів, віку й групи крові (з найменшим вмістом
еритроцитарних групових антигенів) здійснювали з метою максимальної
стандартизації випробуваних зразків консервованих еритроцитів.
Спостерігання здійснювали з першого по сорок другий день, з часовими
проміжками в 7 діб.

У клінічній частині роботи групу спостерігання склали 48 хворих
гематологічного відділення Луганської обласної клінічної лікарні, у віці
60±7 років, з дифузно-осередковою формою множинної мієломи. У всіх
пацієнтів, крім основного захворювання, був анемічний синдром з
рівнем гемоглобіну 70-89г/л, що проявлявся як змінами в загальному
аналізі крові, так і клінічно. З метою корекції анемії здійснювалися
гемотрансфузії: 50% хворих одержали еритроцитну масу (ЕМ), виділену з
крові, консервованої “ЦФДА-1”; 50% – ЕМ із крові, консервованої “ГГЦ”.
Строк зберігання ЕМ з моменту ексфузії донорської крові не перевищував 3
доби. Переливання ЕМ здійснювалися трикратно: на 2, 4 і 6 добу після
надходження пацієнтів. Сумарна доза перелитої ЕМ склала 750±50 мл на 1
хворого.

Предмет дослідження. Ознаки дезінтеграції й загибелі консервованих
еритроцитів протягом строку зберігання консервованої крові; використання
консервованим еритроцитом резервів, як природних (вихідні інгредієнти
крові донора, зокрема, антиоксиданти), так і штучних (хімічні складові
гемостабілізатора) для підтримки власної морфофункціональної
стабільності протягом строку зберігання. Зазначені процеси, що
породжують проблемну ситуацію (необхідність конструювання вдосконалених
вітчизняних розчинів, які мають максимальні стабілізуючі та консервуючі
властивості щодо забезпечення тривалої життєздатності клітин крові,
їхньої приживлюваності і успішного виконання специфічних функцій у
кровоносному руслі реципієнта), обумовили вибір предмета дослідження.

Методи досліджень. Для вивчення морфології й оцінки морфометричних змін
еритроцитів консервованої крові на етапах зберігання
застосовували автоматичний гематологічний аналізатор АВХ Micros 60 OT
18.

Для визначення кількості живих еритроцитів й тих, що дезінтегрували,
використовували біохімічний набір “Apoptosis Detection Kit, Annexin
V-CY3” (“Sigma-Aldrich”, США). Загиблі еритроцити вивчали за допомогою
люмінесцентного мікроскопа Olympus AX70. Фарбування відмитих тричі
еритроцитів у нативному препараті виконували барвником люмінесцентним
Fits Lucifer yellow (“US Biological”, США), застосовували світлофільтр
із діапазоном довжини хвилі 460-490 нм.

Визначення осмотичної резистентності еритроцитів (ОРКЕ) проводили
методом Яновського Д. Н. (1957), а також за уніфікованою методикою в
модифікації Ідельсона Л. І. (1974). Механічну резистентність вивчали за
методом Ham T.H., Shen S.C., Fleming E.M. and Castle W.B. (1948),
кислотну – за методом Терськова І.А. і Гітельзона І.І. (1959) у
модифікації Воробйова А.І. (1960) з використанням фотоелектроколориметра
ФЕК-56М (Росія).

Парціальну напругу газів (рО2, рСО2) і концентрацію Н+ у консервованій
крові визначали з використанням газоаналізатора Medica EasyBloodGas
(США).

Зміст глікозильованого гемоглобіну (Hb1c) в консервованих еритроцитах
визначали з використанням набору реактивів “Гликозилированный гемоглобин
(GHB 100)” (“Біо-Ла-Тест”, Чехія).

Концентрацію фосфоліпідів у плазмі визначали методом тонкошарової
хроматографії з використанням хроматографа рідинного мікроколонкового
“Міліхром-А 02” (“Эконова”, Росія); колонок нормальнофазових із
силікагелем “Silasorb 600” (“Медикант”, Росія), діаметр пор 5 мкм,
80х2мм.

Динаміку внутрішньоклітинного й позаклітинного об’єму води в концентраті
еритроцитів вивчали методом ЯМР-релаксометрії на ядрах 1Н за допомогою
ЯМР-релаксометра “Minispec” (“Bruker”, Німеччина) з робочою частотою 25
Мгц.

Концентрацію неорганічного фосфору, аденозинтрифосфату (АТФ) і
2,3-діфосфогліцерату (2,3-ДФГ) визначали колориметричним методом
Виноградової І.Л., Багрянцева С.Ю., Дервіз Г.В. (1980) у модифікації
Камишнікова В.С. (2003).

Рівень лужних (натрій, калій) металів в еритроцитах і плазмі визначали
фотометрією полум’яною емісійною з використанням ПАЖ-3 (Україна).

Концентрацію СО визначали по Chalmers (1991) за допомогою
спектрофотометра СФ-46 (Росія) при довжині хвилі 541 і 555 нм.

Зміст NO визначали по його стабільних метаболітах – нітрит- та нітрат-
аніонах (NO2-, NO3-), методом Green L.C., Wagner D.A., Glogowski, J. еt
al. (1985) у модифікації Орлової О.А., Комарєвцевої І.О., Комарєвцева
В.М. (2002).

Активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначали в плазмі крові в ході
зворотної реакції відновлення пірувата в лактат за Артюховим В.Г.,
Наквасиній М.А. (2000).

Визначення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ДФГ) у плазмі й
еритроцитах консервованої крові проводили спектрофотометричним методом
із використанням “Набору для визначення глюкозо-6-фосфатдегідрогенази”
(“Sentinel”, Італія).

Активність  каталази в плазмі визначали за  Карпищенко А. І. (1999).

Рівень активності СОД в еритроцитах  визначали за допомогою набору “SOD
Assay Kit-WST” (“Fluka”, Німеччина).

Активність ГР вивчали з використанням набору “Glutathione Reductase
Colorimetric Assay Kit” (“Sigma-Aldrich”, США), шляхом колориметричної
детекції при довжині хвилі 412 нм.

Активність глутатіонпероксидази (ГП)  оцінювали за допомогою кольорової
реакції з 5′,5′-дітіо-біс-2 (нітробензойної) кислотою (ДТНБ)
(Карпищенко А. И., 1999).

Концентрацію загального, зв’язаного й вільного Bi визначали в плазмі
фотометрично за допомогою “Набору реактивів для визначення загального,
прямого білірубіна в сироватці крові (за методикою Єндрашика)”
(“Філісіт-Діагностика”, Україна).

Концентрацію ВГ визначали спектрофотометричним методом, заснованим на
здатності низькомолекулярних тіолів при взаємодії з ДТНБ утворювати
пофарбовану сполуку – тіо-2-нітробензойну кислоту (Карпищенко А.И.,
1999).

Визначення малонового діальдегіда (МДА) виконували
спектрофотометричним методом, заснованим на взаємодії
тіобарбітурової кислоти з низькомолекулярними діальдегідами з
утворенням пофарбованого комплексу, що має максимум світлопоглинання при
довжині хвилі 535 нм (Карпищенко А.И., 1999).

Статистичний аналіз даних проводили з використанням пакета програми
Statistica v.6. Вірогідність розходжень середніх оцінювали з
використанням t-критерію Стьюдента-Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Морфологічні й морфометричні характеристики консервованих еритроцитів
на етапах зберігання. Результати досліджень показали, що кількість
еритроцитів у консервованій крові поетапно зменшувалась, змінювалася
форма від дискоцитів через оборотні (ехіноцити, стоматоцити) варіанти в
необоротні (акантоцити, сфероцити) з наступною дезінтеграцією. У першу
добу спостерігання в крові, заготовленій на всіх випробуваних
гемоконсервантах, дискоїдні форми еритроцитів становили 92%, змінені –
8%. У структурі останніх основна частина становила оборотні форми
еритроцитів – стоматоцити й ехіноцити. Сфероцити, клітини в термінальній
стадії життя, становили 0,8% (“АГЦ”); 1% (“ГГЦ”); 1,2% (“ЦФДА-1”) від
усієї кількості клітин. Дисксферотрансформація еритроцитів в “ГГЦ”-
крові протікала з поетапним зменшенням об’єму клітин. У крові,
консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, накопиченню сфероцитів передував етап
збільшення діаметра клітин на 14 – 21-шу добу спостерігання, про що
свідчить другий пік кривих Прайс-Джонса (рис.1).

Рис. 1. Еритроцитометрична крива Прайс-Джонса на 14-ту добу
спостерігання

Виявили, що гемоконсерванти “ГГЦ” з 14-ї доби, а “ЦФДА-1” – з 21-ї доби
не зберігали нормальний морфологічний статус основної маси еритроцитів.
На 35-ту добу в крові, консервованій “ГГЦ”, були відзначені
дегенеративні форми, “осколки” клітин, сфероцити, одиночні акантоцити,
які в сумі становили 49,8% всіх клітин; дискоцити були відсутні. В цей
час “ЦФДА-1”-крові в наявності 51,8% дискоцитів і оборотно змінених
форм клітин, в “АГЦ”- крові їх 57,8%.

Гемоконсервант “АГЦ” ефективніше виявляв консервуючі якості, що знайшло
відображення у пізніших необоротних змінах в популяції донорських
еритроцитів. Так, на 28-му добу питома вага акантоцитів, сфероцитів і
клітин, що дезінтегрували, у крові, консервованій “ГГЦ”, становила
45,6%, в “ЦФДА-1”- крові – 39,0%, у той час як в “АГЦ”- крові – 34,0%;
на 35 добу питома вага необоротно змінених форм складала 49,8, 49,0 і
42,2% відповідно.

Реологічний статус консервованої крові. Відомо, що в’язкість цільної
крові людини визначається різними факторами: пружними й орієнтаційними
властивостями еритроцитів, гематокритом, в’язкістю плазми. Окремі
показники реологічного статусу крові донора властиві й консервованій
крові, однак остання має особливості, створені умовами її існування
[Терехов Н.Т., Петров М.М., 1983; Шафранова Е.И., Снегирева Е.И., 2000;
Гуменюк Н.И., Лишневская В.Ю., 2003; Цветков В.Д., 2004]. Дослідили
в’язкість консервованої крові та її залежність від в’язкості плазми,
гематокрита, морфології еритроцитів, наявності білково-клітинних і
еритроцитарних мікроагрегатів. Виявили немонотонність змін даного
показника: підвищення до 21-ї доби й подальше зниження до кінця строку
спостерігання. Установили, що в’язкість консервованої крові не мала
достовірного причинно-наслідкового зв’язку з поетапним збільшенням
кількості білково-клітинних мікроагрегатів, що виникають під час
“старіння” крові, а також зі змінами в’язкості плазми. Визначили, що
ключова роль у формуванні реологічних властивостей консервованої крові
належить еритроцитам. Перехід асоціації еритроцитів в “монетні
стовпчики” до структур більш високого порядку вірогідно підвищував
в’язкість консервованої крові в період з 1-ї по 21-гу добу після
заготівлі. Зниження в’язкості консервованої крові на етапі 21 – 42-га
доба зберігання було обумовлено а) накопиченням еритроцитів зі
зменшеним діаметром; б) зниженням гематокриту.

Вуглеводний обмін консервованих еритроцитів. Вивчили рівень глюкози в
еритроцитах і плазмі консервованої крові, ефективність її використання
клітинами на етапах зберігання. Установили, що в першу добу після
заготівлі рівень глюкози в еритроцитах і плазмі крові, консервованої
“ЦФДА-1”, найнижчий, і зберігається таким до кінця спостерігання, що
може бути пов’язане з меншою кількістю глюкози в гемоконсерванті, яка
припадає на 1мл заготовленої цільної крові (в “ЦФДА-1”- крові – 0,004
г/мл, в “ГГЦ” і “АГЦ”- крові – 0,008 г/мл), а також з гліколізом, що
протікає ефективно. Виявили більш високий ступінь убування глюкози з
плазми крові, консервованої “ЦФДА-1”, ніж “АГЦ”- і “ГГЦ” (до 14-ї доби
– на 65,5% проти 20,1% і 31,7% відповідно), що можна пояснити
ефективним залученням глюкози до метаболізму еритроцитів. В клітинах
“ГГЦ”- крові відзначене лінійне підвищення рівня глюкози, що свідчить
про менш інтенсивне здійснення гліколізу, а також про дестабілізацію
мембранних структур, яка сприяє надходженню глюкози в еритроцит із
плазми за градієнтом концентрації. Оскільки підвищення
внутрішньоеритроцитарної концентрації глюкози пов’язане з розвитком
осмотичного стресу, можна вважати середовище, створене гемоконсервантом
“ГГЦ”, менш сприятливим для клітин. В еритроцитах “АГЦ”- крові
відзначено тенденцію до поетапного зменшення концентрації глюкози, що
поряд із адекватним зниженням даного показника в плазмі свідчить про
стабільність катаболізму глюкози. Вказане підтверджується динамікою
концентрації лактату. Так, до 21-ї доби спостерігання рівень лактату в
плазмі “ГГЦ”- крові перевищив первісний показник в 2,1 рази; в “ЦФДА-1”-
і “АГЦ”- крові – в 3,1 і 3,4 рази відповідно. До кінця строку
спостерігання рівень лактату в плазмі “АГЦ”- крові був вищим, ніж в
“ЦФДА-1”, на 4,5%, і на 6,3% вищим, ніж у плазмі “ГГЦ”- крові.

Відомо, що глюкоза у високій концентрації викликає глікозилювання
гемоглобіну (Hb). Hb1c, як хімічно стійка сполука, втрачає здатність
транспортувати гази крові, відповідно, знижує трансфузіологічну
цінність донорських еритроцитів. Нами було встановлено, що концентрація
Hb1c в еритроцитах на всіх етапах перевищує референтні цифри, особливо в
крові, консервованій “ГГЦ” і “АГЦ”, які містять більшу кількість
глюкози, що обумовлено рецептурою даних гемостабілізаторів. У зв’язку з
цим можна стверджувати, що висока концентрація глюкози в складі
консерванту, поряд з позитивним (резерв субстрату для гліколізу) має й
негативний бік – глікозилювання Hb, яке погіршує якість
гемотрансфузійних еритроцитних середовищ відносно транспорту газів
крові.

Енергетичний статус консервованих еритроцитів. Виявили поетапне зниження
рівня АТФ і 2,3-ДФГ в еритроцитах крові, заготовленої з використанням
всіх зазначених гемоконсервантів, однак у крові, стабілізованій “ЦФДА-1”
і “АГЦ”, що містять у рецептурі аденін і неорганічний фосфат, – у
меншому ступені. Відзначили, що до 14-ї доби – у період найбільшого
використання еритроцитвміщуючих середовищ для переливання хворим – дані
гемоконсерванти підтримували більш високу концентрацію макроергічних
сполук (не менше 90% АТФ і 60% 2,3-ДФГ) отже, віддаляли в часі
дисксферотрансформацію еритроцитів. На цьому етапі використання “ГГЦ”
сприяло збереженню лише 81,4% АТФ і 53,1% 2,3-ДФГ. Показники збереження
АТФ еритроцитів виявили придатність останніх як переносників газів
крові (концентрація  АТФ  не нижче 50% від вихідного рівня) [Технічне
керівництво Американської асоціації банків крові, 2000], в “ГГЦ”-крові
– до 21-ї, “ЦФДА-1” і “АГЦ” – до 35-ї доби, що відповідає вимогам.
Перевагу “ЦФДА-1” і “АГЦ” перед “ГГЦ” відносно збереження
морфофункціональних властивостей донорських еритроцитів обумовлено,
зокрема, наявністю в складі аденіну, який має здатність швидкого
проникнення в еритроцит з утворенням додаткової кількості АТФ. Ми
встановили, що в крові, заготовленій з використанням “ГГЦ”, в 1-шу добу
спостерігання рівень аденіну істотно не відрізняється від такого в
крові, заготовленій на “ЦФДА-1” і “АГЦ”. Парадоксальний, на перший
погляд, результат дослідження можна пояснити високим ступенем
пошкодження еритроцитів донора в момент їхнього переміщення в штучне
середовище консерванту “ГГЦ”. Дезінтеграція структур клітин, що мають у
складі пуринові сполуки, є причиною накопичення аденіну в плазмі. Можна
припустити, що момент “зустрічі” крові з “ЦФДА-1” і “АГЦ” протікає
м’якіше, у противному випадку рівень аденіну істотно перевищував би
такий у плазмі “ГГЦ”- крові. Досліджуючи споживання аденіну
консервованим еритроцитом, установили поетапне зниження його рівня в
плазмі крові, консервованої “ГГЦ”, на 7-му добу спостерігання, а в
плазмі крові, консервованій “АГЦ” і “ЦФДА-1”, які містять цю пуринову
основу, – на 14-ту. Раннє зниження даного показника в “ГГЦ”- крові
можна пояснити більшою потребою клітин в аденіні – наслідком
більш вираженого збитку макроергічних сполук у порівнянні з “ЦФДА-1”- і
“АГЦ”- кров’ю.

Відомо, що дії АТФ і 2,3-ДФГ адитивні відносно збереження стабільності
мембрани еритроцита [Зинчук В. В., 2001; Дедов И.И., Александров А.А.,
2004].

Стан фосфоліпідної складової мембрани консервованого еритроцита. Виявили
елюацію в плазму по мірі “старіння” консервованої крові структурних ФЛ
внутрішнього моношару мембрани – фосфатидилсеріну (ФС) і
фосфатидилетаноламіну (ФЕ). Рівень ФС у плазмі “ГГЦ”- і “ЦФДА-1”- крові
в період 1 – 14-та доба мав тенденцію до підвищення, і вірогідно
перевищив вихідний на 21-шу добу; в плазмі “АГЦ”- крові – на 28-му
добу. Динаміка рівня ФС у плазмі “ГГЦ”- і “АГЦ”- крові була аналогічній
динаміці ФЕ; у плазмі “ЦФДА1”- крові рівень ФС перевищив первісний на
7-му добу (табл.2).

Таблиця 2.

Фосфоліпіди в плазмі консервованої крові на етапах зберігання, мг/мл

Доба Фосфатидилетаноламін Фосфатидилсерін

ГГЦ ЦФДА-1 АГЦ ГГЦ ЦФДА-1 АГЦ

1 0,253±0,048 0,214±0,036 0,167±0,034 0,035±0,020 0,014±0,003
0,015±0,083

7 0,315±0,149 0,267±0,060 0,190±0,044 0,026±0,013 0,038±0,010*
0,027±0,008

14 0,321±0,065 0,254±0,035 0,239±0,084 0,077±0,027 0,040±0,010*
0,058±0,024

21 0,557±0,106* 0,367±0,061* 0,323±0,086 0,233±0,063* 0,126±0,027*
0,126±0,044

28 0,598±0,172* 0,418±0,076* 0,346±0,059* 0,325±0,108* 0,188±0,037*
0,151±0,027*

35 0,543±0,113* 0,484±0,059* 0,379±0,094*
?????????????????????????????????????????????????????????????

*рвідносно 14-ї; у крові, консервованій “ЦФДА-1”, на 50,7%, в “АГЦ”- крові – на 32,0% відносно 21-ї доби). Це могло бути обумовлено: а) гіперпродукцією H2O2 (субстратна інгібіція); б) розривом іонних взаємодій ферменту з мембраною й виходом у плазму при наростанні в мембрані явищ ПОЛ [Верболович В.П., Підгірський Ю.К., Підгірська Л.М., 1989; Терьохіна Н.А., Короваїв В.Г., 2003]; в) дестабілізацією молекули ферменту. Виявили високий ступінь кореляційного зв'язку активності каталази й СОД (“ГГЦ”- еритроцити: r=0,82, р0,05 r=-0,21, p>0,05 r=-0,36,
p>0,05

СО-активність каталази r=-0,93, p0,05 r=-0,71,
p>0,05

Відсутність достовірної корелятивної відповідності зазначених показників
не дала можливості точно визначити “точку дії” СО як антиоксиданту (за
винятком статистично достовірної відповідності СО – активність каталази
в “ГГЦ”- еритроцитах, що, можливо, мала місце через більше накопичення
пероксидів). Підвищений рівень СО в еритроцитах, консервованих
розчинами, що містять аденін і фосфат натрію, свідчив про більш
виражений СО-гемоксигеназний антиоксидантний захист. Починаючи з 21-ї
доби, утворення/витрата СО перебували на практично постійному рівні.
Очевидно, СО активно реалізував свою антиоксидантну функцію в “ГГЦ”-
стабілізованих еритроцитах протягом 2/3 строку їхнього зберігання, в
“ЦФДА-1”- еритроцитах – менше половини строку зберігання, в “АГЦ”-
еритроцитах – до 2/3 строку зберігання. Можливо, потреба у витраті СО
еритроцитами “АГЦ”- крові була нижче, ніж “ЦФДА-1”- і
“ГГЦ”-еритроцитами. Роль СО як антиоксиданту для консервованих
еритроцитів показана нами вперше.

Сечовина консервованої крові як антиоксидант. Відомо, що сечовина 
втримується в крові в частково зв’язаному з гемоглобіном і сироватковим
альбуміном вигляді. Завдяки тропності до металів змінної валентності,
сечовина перешкоджає утворенню metHb [Коровина Н. А., Захарова И. Н.,
Обыночная Е. Г., 2003], а також проявляє антиоксидантні властивості,
скорочуючи число залізовмісних центрів ПОЛ [Гершенович З.С., Кричевская
А.А., Лукаш А.И., 1970].

Ми встановили, що в першу добу після вилучення крові в донора рівень
сечовини в плазмі відповідав нормі; з 7-ї (“ГГЦ”) – 14-ї доби (“ЦФДА-1”
і “АГЦ”) він почав знижуватися. Оскільки в штучних умовах, створених
консервуванням, у донорській крові синтез сечовини неможливий, так само
як і подальший її катаболізм, можна припустити витрату даної речовини як
антиоксиданту, що підтверджується й витратою білірубіну, яка відбувалася
в тісному достовірному кореляційному зв’язку з витратою сечовини:
r=0,96, p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020