.

Теплопродукція піко- і фемтопланктону (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
156 3840
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАїНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ

ім. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО

МУХАНОВ

Володимир Сергійович

УДК 574.583 (262.5)

Теплопродукція піко- і фемтопланктону

03.00.17 – гідробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Севастополь – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології південних морів

ім. О.О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Полікарпов Ігор Геннадійович,

Інститут біології
південних морів НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

провідний науковий співробітник

Олейник Галина Миколаївна,

Інститут гідробіології НАН України

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

зав. відділом біологічного тестування

Рябушко Віталій Іванович,

Інститут біології південних морів НАН України

Захист дисертації відбудеться “12” грудня 2007 р. о 14 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 Інституту біології
південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр.
Нахімова, 2

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біології
південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр.
Нахімова, 2

Автореферат розісланий “_04_” __листопада__ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д50.214.01

доктор біологічних наук,

професор
А.В. Гаєвська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Застосування мікрокалоріметрії в екологічних
дослідженнях, і, зокрема, у водній мікробіології, є виключно
перспективним, оскільки цей метод дозволяє безпосередньо вимірювати
потоки енергії в таких складних біологічних системах, як природні
мікробні угруповання. Затребуваність методу продиктована новими
стандартами й вимогами до оцінки й аналізу вуглецевого й енергетичного
бюджетів морських екосистем. Від якості подібних оцінок, одержуваних для
локальних акваторій, може залежати те, наскільки дбайливо
використовуватимуться їхні ресурси і наскільки буде збережено їхню
екосистему. Однак якість локальних оцінок, безсумнівно, визначає і
якість глобальних апроксимацій (наприклад, глобального циклу вуглецю),
які необхідні людству для вироблення правильної стратегії в збереженні
біосфери, прогнозі й контролі глобальних кліматичних змін.

Мікробна компонента угруповання планктона, функціональні характеристики
якої і є предметом цього дослідження, визначає як значну частину
вторинної продукції, так і процеси мінералізації новоутвореної
органічної речовини в морях і океанах. Утворюючи основу харчової
піраміди, мікроорганізми, по суті, формують і ту продуктивність водних
екосистем, яка безпосередньо експлуатується людством. Вони залучені в
усі найважливіші біогеохімічні процеси у водному середовищі, а мікробний
метаболізм опосередковує глобальні потоки вуглецю й енергії в біосфері.
У зв’язку з цим, вдосконалення методологічної бази прямого вимірювання
потоків енергії у водних мікробних угрупованнях і накопичення даних про
величину потоків і механізми їх регуляції в різних екосистемах є
актуальними завданнями гідробіології.

Мікробні угруповання поєднують у собі просторову компактність зі
структурною і функціональною складністю, властивою всім надорганізменним
системам, що дає можливість досліджувати їх в експерименті в ампулах
малого об’єму. Мікрокалоріметрія мікробних угруповань – єдине на
сьогоднішній день джерело експериментальних даних для розвитку
нерівновагої термодинаміки складних, надорганізмених біологічних систем.
Результати експериментів з піко- і фемтопланктоном, представлені в цій
роботі, — один з перших кроків у цьому напрямі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну
роботу виконано у відділі планктона ІнБПМ НАНУ в рамках бюджетних тем
“Дослідження багаторічної мінливості структурно-функціональної
організації угруповань планктона Чорного та Азовського морів” (державний
реєстраційний номер 0196U022099), “Структурно-функціональні основи
біорізноманіття морських угруповань” (державний реєстраційний номер
0199U001388), міжнародних проектів ІНТАС (INTAS) №№ 96-1961, 99-0139,
03-51-6196 і стипендії ІНТАС для молодих вчених YSF 2002-0361.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягає у вимірюванні
сумарного й питомих потоків енергії в планктонній мікробній “петлі”
мікрокалоріметричним методом. Поставлена мета визначила такі завдання
дослідження:

1. Розробити й оптимізувати метод приготування проб піко- і
фемтопланктона для прямого вимірювання їхньої теплопродукції
мікрокалоріметричним методом.

2. З’ясувати, чи існує зв’язок між розмірною структурою угруповання
гетеротрофного пікопланктона і питомими потоками енергії в ньому,
визначити внесок ультрамікробактерій та епібактерій, що населяють
планктонні агрегати, у сумарний бюджет угруповання.

3. Дослідити природу теплопродукційних процесів у фемтопланктоні, а
саме, диференціювати внутрішньоклітинні (метаболізм) і позаклітинні
джерела теплової енергії, визначивши їхній внесок у сумарну
теплопродукцію фракції.

4. Провести вимірювання теплопродукції гетеротрофного пікопланктона в
різних водних екосистемах з подальшою оцінкою потоків енергії через
мікробне угруповання й ефективності мікробної “петлі”.

Об’єкт дослідження — гетеротрофний пікопланктон, фемтофракція
планктонів.

Предмет дослідження — інтенсивність теплопродукції планктонних бактерій
і потік енергії в мікробній “петлі”.

Метод дослідження. Теплопродукцію мікробного угруповання вимірювали за
допомогою мікрокалоріметричного методу. Чисельність, біооб’єм (біомасу)
і біоповерхню угруповання визначали мікроскопічними методами.
Матеріальний потік через мікробний харчовий ланцюг (виїдання бактерій
найпростішими) вимірювали за допомогою методу розбавлень (Tremaine,
Mills, 1987).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше визначено і детально
описано (у тому числі й засобами імітаційного моделювання) мікробні
процеси, що відбуваються після концентрування угруповання пікопланктона
на нітроцелюлозну мембрану. На основі цих даних оптимізовано протокол
фракціонування й концентрування проб піко- і фемтопланктону для
подальшого вимірювання їхньої теплопродукції за допомогою
мікрокалоріметрії.

Вперше отримано дані про інтенсивність теплопродукції гетеротрофного
пікопланктона в морських екосистемах і гіперсолоній водоймі, досліджено
залежність питомої теплопродукції угруповання (на клітину, одиницю
біооб’єму і біоповерхні) від його розмірної структури, визначено
термодинамічні параметри угруповання (добова продукція ентропії і питома
дисипативна функція), оцінено ефективність мікробної “петлі” у
мінералізації новоутвореної у стовпі води органічної речовини.

Запропоновано оригінальну модифікацію методу розбавлень, що дозволяє
вимірювати питому продукцію і швидкість виїдання бактерій гетеротрофним
нано- і мікропланктоном в планктонних агрегатах. Її успішна апробація в
польовому дослідженні дозволила одержати перші дані для бактеріпланктона
Севастопольської бухти (Чорне море).

Вперше встановлено, що питома (в одиниці об’єму біотопу) теплопродукція
фемтопланктона порівнювана з теплопродукцією пікопланктона. У серії
експериментів показано, що головне джерело теплової енергії у
фемтофракції – позаклітинні процеси (можливо, гідроліз РОВ), а не
бактеріальний метаболізм.

Науково-практична значимість отриманих результатів. Результати
дисертаційної роботи показують, як процедури фільтрації й концентрування
впливають на активність мікроорганізмів, швидкість їх росту і
смертність. Ця інформація може бути використана у прикладних
дослідженнях і біотехнологічних розробках, якщо в таких для
фракціонування і/або концентрування бактеріальних клітин застосовується
мікрофільтрація. Пропонований здобувачем протокол приготування проб
пікопланктона і вимірювання їхньої теплопродукції може бути
використаний як експрес-метод оцінки функціонального стану мікробного
угруповання в досліджуваних акваторіях. Модифікація методу розбавлень,
запропонована в цій роботі, розширює можливості дослідження детритного
харчового ланцюга, а метод повторних циклічних фільтрацій пікопланктона
при його поєднанні з мікрокалоріметрією може служити інструментом
дослідження потоку енергії у вірусній “петлі”.

Особистий внесок здобувача. Планування експериментів, обслуговування
(включаючи калібровку) і частина операторської роботи на
мікрокалоріметрі BAM 2277, лічба мікроорганізмів за допомогою
епіфлуоресцентної мікроскопії (фарбування DAPI), математичне
моделювання, статистична обробка, аналіз і узагальнення результатів
виконані самостійно. Інші роботи проводилися разом з О. Найдановою і О.
Рильковою (лічба і вимірювання мікроорганізмів, накопичувальні культури
гетеротрофного пікопланктона), О. Лопухіною (мікрофільтрація,
операторська робота на ВАМ), М. Кіріним (метод розбавлень), Александре
Анесіо (радіоізотопний метод).

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися автором на
вітчизняних і міжнародних конференціях: III Міждисциплінарному
симпозіумі ІНТАС (INTAS) “Physical General Biochemistry, Biotechnology
and Environment”, Московський державний університет (Москва, 14—17
грудня 2000 р.); IV Міждисциплінарному симпозіумі ІНТАС (INTAS)
“Physical and Chemical Methods in Biology, Medicine and Environment”,
Московський державний університет (Москва, 30 травня — 3 червня 2001
р.); конференції молодих вчених “Понт Евксинський II”: “Проблеми
екології Азово-чорноморського басейну: сучасний стан і прогноз
(Севастополь, 18—20 вересня 2001 р.); VIII міжнародній конференції по
гіперсолоних озерах (Жемчужний, Республіка Хакасія, 23—26 липня 2002
р.); конференції молодих учених з проблем Чорного й Азовського морів
“Понт Евксинський III” (Севастополь, 27—30 травня 2003 р.); XIII
конференції міжнародного товариства біологічної калоріметрії
(International Society for Biological Calorimetry, ISBC) “Energetics of
Adaptation and Development. From Molecular Mechanisms to Clinical
Practice” (Вюрцбург, Німеччина, 27 вересня — 1 жовтня 2003 р.); XIV
конференції ISBC “Energetics of Adaptation and Development” (Гданьск,
Польща, 2—7 червня 2006 р.).

Публікації. По темі дисертації опубликованo 20 наукових праць, з яких 8
статей (з них 4 статті у виданнях, рекомендованих ВАК України) і 12 тез
доповідей у матеріалах міжнародних і регіональних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 163 сторінках
друкованого тексту; складається зі вступу, 8 розділів, висновків і
списку використаних джерел, що включає 171 найменування, містить 12
таблиць і 35 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ.

Вимірювання потоків енергії в планктонних мікробних угрупованнях
(літературний огляд, розділ 1). Розглянуто шляхи інтерпретації
результатів респірометрії в рамках існуючих концепцій енергетичного
балансу водних екосистем. Наводиться огляд робіт, у яких проводилася
кількісна оцінка потоків енергії в планктонних мікробних угрупованнях і
мікробній “петлі”. Серед недоліків респірометричного підходу виділено
такі: а) помилково розглядати аеробне дихання як єдиний катаболічний
процес у стовпі води і, таким чином, ототожнювати результати прямої і
непрямої калоріметрії; б) у водному середовищі можуть відбуватися інші
окислювальні процеси, що споживають кисень. Виникаючих у зв’язку з цим
погрішностей можна уникнути, комбінуючи респірометрію з
мікрокалоріметрією, що дозволяє безпосередньо вимірювати тепловий потік,
продуцований біологічною системою (тобто потік енергії). Дається
пояснення повільної “експансії” мікрокалоріметрії в дослідженнях
планктона.

Матеріал і методи дослідження (розділ 2). Проби морської води відбирали
з поверхневого шару на 4-х станціях у Севастопольській бухті (Чорне
море, південно-західний Крим; станції 1 і 2 на виході з бухти, 3 і 4 — у
її кутовій частини) у різні сезони з 1998 по 2004 р. і в узбережжі м.
Аберістуїта (затока Кардиган, Уельс, Великобританія) у липні-серпні 1999
р. У мілководному гіперсолоному озері на мисі Херсонес
(південно-західний Крим, 44о35’09’ N, 33о23’39’ E) збирали проби води й
плаваючих матів зеленої водорості кладофори у весняні місяці 2002 р.

Мікрофільтрація. Залежно від завдання дослідження проби води
фракціонували і концентрували (мал. 1, А) за допомогою фільтрувального
устаткування Sartorius (Німеччина), нітроцелюлозних (Sartorius) або
трекових (ядерних) мембран (Дубна, Росія) відразу ж після їх доставки в
лабораторію. Для визначення оптимального протоколу приготування проб
застосовували різні об’єми фільтрації (70—1000 мл), номінальний розмір
пор на етапі фракціонування (3 або 12 мкм), тривалість експерименту (від
30 хв. до 80 год.). Протокол, застосовувана далі в польових
дослідженнях, був такий: фракціонували проби за допомогою 12 мкм (море)
або 3,0 мкм (озеро) нітроцелюлозних мембран (відповідно, SM 12500-047 і
SM 11302-047), концентрували — на 0,2 мкм нітроцелюлозну мембрану (SM
11307-047), об’єм фільтрації — 100 мл.

Для дослідження внеску литичної інфекції у смертність ПБ на мембрані
проби фільтрат 0,2
мкм). У кожному з експериментів додатково досліджували агреговані
бактерії, або епібактерії (розмірна фракція >5 мкм), і “вільні”, або
суспендовані, бактерії (фракція 0,2-5 мкм). Епібактерії вловлювали і
рахували за допомогою ядерних фільтрів з діаметром пор 5 мкм. Через
неможливість фільтраційними методами сепарувати епібактерії, що
населяють планктонні агрегати, від нано- і мікропланктона для подальшого
вимірювання їхньої теплопродукції, швидкість їх метаболізму в одиницях
енергії розраховували з величин питомої і добової продукції.

Імітаційне моделювання мікробних процесів у вимірювальній ампулі. Вид
кінетичної моделі бактеріального росту відновлювали на основі
експериментальних даних (зворотне кінетичне завдання). За основу взяті
такі положення (мал. 1, Б): бактеріальний ріст, що спостерігався в
ампулі, задовольняв класичну модель Моно з константою спорідненості
субстрату до мікроорганізму Ks і максимальною питомою швидкістю росту
(або питомою продукцією) ?m; ріст бактеріальних клітин, сконцентрованих
на нітроцелюлозній мембрані (“прикріплені бактерії”, ПБ; XПБ – біомаса
ПБ), придушувався пропорційно до збільшення концентрації клітин на
мембрані (повне неконкурентне інгібування з коефіцієнтом ? і константою
Kx); чисельність ПБ зменшувалася згодом внаслідок лізису клітин (?) та
їх експорту у воду (?); у фільтраті навколо мембрани бактерії формували
швидко зростаючу “популяцію” суспендованих, або “вільних”, бактерій (ВБ;
XВБ – біомаса ВБ); харчовий субстрат (S – його концентрація) споживався
пропорційно приросту бактеріальної біомаси при постійному в часі
економічному коефіцієнті YX/S: d/dt = -?X/YX/S, де X – біомаса бактерій.
Як і в мікрокалоріметричних експериментах, початкова чисельність ПБ у
моделі обиралася в діапазоні між 108 і 2 ( 109 кл. (тобто на мембрану
або на ампулу, амп.-1), що відповідає біомасі в одиницях вуглецю від 5,6
до 112,0 мкг. Кінетика бактеріального росту в моделі описувалася питомою
продукцією біомаси (1/X)(d/dt), інтенсивністю дихання (1/X)(dCoxygen) і
теплопродукції (1/X)(d/dt), де Coxygen – концентрація кисню, Q –
кількість теплоти.

Апроксимації і допущення, використовувані в моделі і польових
дослідженнях. Коефіцієнт перелічування сухої біомаси морських бактерій у
вуглець взято за такий, що дорівнює 0,5 (Sorokin, Kadota, 1972).
Економічний коефіцієнт YX/S постійний у часі й дорівнює 1 г сух. в. г-1
С (Harwood, Pirt, 1972), що відповідає валовій ефективності росту К1 =
50%. У тих випадках, коли вимірювання бактеріальних клітин не проводили,
їхню питому вагу (?) ?рали такими, що дорівнює 0,56 пг С мкм-3 (Bratbak,
1985), а бактеріальну біомасу розраховували як X = ?VN, де N –
чисельність бактерій, V = 0,1 мкм3 – середній об’єм клітини (дані для
Чорного моря, Чепурнова та ін., 1993). Дихання (1/X)(dCoxygen) і
теплопродукцію (1/X)(d/dt) апроксимували в моделі, виходячи з таких
допущень: (1) економічний коефіцієнт по кисню (YX/oxygen) дорівнює 1 г
сух. в. г-1 О2) (Pirt, 1957, 1975); (2) кисень використовується виключно
як акцептор електронів в енергодаючих процесах (Hernandez, Johnson,
1967); (3) оксі-калорійний коефіцієнт = –450 кДж моль-1 О2 (Gnaiger,
Kemp, 1990); (4) аеробний метаболізм. Енергію, акумульовану угрупованням
у вигляді біомаси (запас енергії, standing stock, SS), розраховували за
допомогою коефіцієнта 43,5 і 44,17 Дж мг-1 С, відповідно для бактерій і
мікроводоростей (Duboc et al., 1999). Добовий оборот біомаси (або запасу
енергії) розраховували як відношення запас/продукція (доб.-1).

Статопрацювання і моделювання. Базову статистику (середні, 95% довірчі
інтервали, стандартні відхилення, парний t-тест) і крос-кореляційні
коефіцієнти розраховували в пакеті STATISTICA 5.5 (StatSoft, Inc.),
побудова графіків і регресійний аналіз – SigmaPlot 4.0 і Grapher 2.0,
моделювання – Turbo Basic і Visual Basic 6.0.

Мікробні процеси у вимірювальній ампулі і шляхи оптимізації вимірювань
теплового потоку пікопланктона (розділ 3). По даним мікроскопії
чисельність ПБ зменшувалася в довгострокових експериментах внаслідок
того, що швидкість втрати клітин на мембрані (смертність + еміграція)
перевищувала швидкість їх заповнення за рахунок росту (мал. 2, А).
Чисельність ВБ, навпаки, росла приблизно до 108 клітин, у тому числі й
за рахунок “імпорту” ПБ. Ці результати були відбиті в концептуальній
схемі (див. вище мал. 1, Б) і імітаційної моделі мікробних процесів у
вимірювальній ампулі.

Фільтрація пікопланктона в повторних циклах вела до збільшення продукції
вірусоподібних часток (ВПЧ) (1,39 ( 0,06 проти 0,29 ( 0,10 ( 108 ВПЧ
мл-1 у контролі, зазначені станд. відхил.; t-тест: p 0,97
для всіх проб на мал. 3, А). Таким чином, представлена залежність може
бути використана для оцінки інтенсивності теплопродукції (Pi) бактерій,
сконцентрованих на мембрану, з виправленням на придушення їхнього
метаболізму.

Якщо чисельність сконцентрованих бактерій (No) не перевищувала 108 кл.
(що відповідало об’єму фільтрації 100 мл для морських проб), помилка
визначення Pi була невелика (залежність Po від No близька до лінійного,
мал. 3, А), і виправлення на інгібування метаболізму бактерій не була
потрібна. Важливо підкреслити, що мета з’ясувати точну природу
інгібування, чи то ефект скупченості чи інша причина, не ставилася,
оскільки це не є принциповим для математичного опису феномена й
одержання поправочних коефіцієнтів на основі цього опису.

Результати моделювання. При своїй простоті імітаційна модель добре
апроксимувала бактеріальний ріст в ампулі протягом першої доби
експерименту, незважаючи на те, що вона не враховувала його
багатосубстратну природу і тривалу “залишкову” активність угруповання,
пов’язану з рециклінгом субстратів. Критерієм успішної верифікації
моделі була відповідність абсолютних величин і динаміки зміни модельних
змінних таким в експериментах (мал. 3, Б), у першу чергу, динаміки
чисельності ПБ і ВБ, діапазону змін теплопродукції, форми теплових
патернів як функції No, внеску ПБ і ВБ у сумарну теплопродукцію системи.
Оптимальне співвідношення між параметрами моделі, що визначають кінетику
бактеріального росту, So:Ks:Kx, становило 5:15:1, з абсолютними
значеннями, відповідно, 70, 210 і 13 мкг С. Максимальна питома продукція
(?), швидкості лізису клітин на мембрані (?) і їх експорту у фільтрат
(?) співвідносилися як 30:15:1, тобто роль експорту клітин зводилася
лише до їх “висіву” у більш сприятливі для росту мікроумови.
Альтернативний сценарій передбачав: а) лише незначне інгібування росту
ПБ на мембрані (Kx > 200 мкг С), б) переважання експорту ПБ у фільтрат
над смертністю (? > ?), в) обмежені ресурси для бактеріального росту (So
P?D NP??eF ? o ^J5D F ? o ????????? {iaaa*iEE»»?**E§››* d d d d d d d d occcccccssoccIAI¶??ss d d d d d d d 6о біоповерхні не залежали від середнього об’єму клітин (тобто розмірної структури угруповання). Таким чином, проби з переважанням дрібних клітин не поступалися у величинах питомих потоків енергії пробам з перевагою великих клітин. Це, на перший погляд, суперечило гіпотезі Стевенсона (Stеvenson, 1978) і експериментальним результатам Гезол та ін. (Gazol et al., 1995), згідно з яким УМБ – спочиваючі клітини, здатні в сприятливих умовах відновити ріст і нормальні розміри (що властиво копіотрофам). Разом з тим не було отримано й достовірного підтвердження зворотного припущення, що в УМБ інтенсивність метаболізму в одиниці об'єму клітини вище, ніж у бактерій “нормального” розміру (Button, Robertson, 1989). Застосувавши до наших експериментальних даних модель Гезол та ін. (1995), відповідно до якої ймовірність для морської бактерії бути фізіологічно активною пропорційна її розміру, ми одержали експериментальне підтвердження того, що пул УМБ включає як спочиваючі форми копіотрофів, так і фізіологічно активні клітини. Таким чином, наші результати “примиряють” дві полярні точки зору на природу УМБ. Епібактерії в планктонних агрегатах: високі швидкості росту, смертності і обороту біомаси (розділ 5). Питомі швидкості процесів (питома продукція K і смертність g) і швидкість обороту бактеріальної біомаси в агрегатах були достовірно вищими ніж у навколишній воді (мал. 5). Однак внесок агрегованих бактерій у сумарну чисельність угруповання (N) і, як наслідок, у його добову продукцію (P) і смертність (G) залишався незначним (мал. 5). У эпібактерій, що населяють агрегати, сумарні витрати на обмін і питому швидкість теплопродукції, становили, відповідно, 0,1-0,6 мкВт л-1 й 23-101 фВт кл. -1 проти 5,0-63,5 мкВт л-1 й 14-32 фВт кл. -1 у вільних бактерій у навколишній воді. Установлено, що висока інтенсивність мікробіологічних процесів у планктонних агрегатах може істотно впливати на результати, одержувані традиційним методом розведень: розбіжності у величинах K і g, виміряних для сумарного бактеріопланктона (за допомогою стандартного методу) і тільки вільних бактерій поза агрегатами (за допомогою модифікованого методу), досягали 17% і були статистично достовірними (парний t-тест; p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020