.

Вплив радіаційних, термічних та хімічних чинників на різних стадіях онтогенезу на тривалість життя та біологічний вік Drosophila melanogaster

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
136 3038
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

КОШЕЛЬ НАТАЛІЯ МИХАЙЛІВНА

УДК 612.68-019:577.95:577.71

Вплив радіаційних, термічних та хімічних чинників на різних стадіях
онтогенезу на тривалість життя та біологічний вік Drosophila
melanogaster

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Войтенко Володимир Платонович,

Інститут геронтології АМН України (м. Київ),

завідувач лабораторії математичного моделювання

процесів старіння.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Коробейніков Георгій Валерійович,

Державний науково-дослідний інститут фізичної культури і спорту (м.
Київ),

заступник директора з науково-дослідної роботи;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ільїн Володимир Миколайович,

Національний університет фізичного виховання та спорту України (м.
Київ),

завідувач кафедри біології людини.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра фізіології людини і тварин.

Захист відбудеться “ 19 ” квітня 2006 р. о 14 : 00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського
національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і
науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства
освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий “ 15 ” березня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.І. Падалко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз механізмів старіння є одним з перспективних
напрямків досліджень в експериментальній біології і медицині, від якого
можна чекати розкриття нових фундаментальних механізмів життєдіяльності
і розробки методів спрямованої корекції функціональної активності систем
цілісного організму. У зв’язку із загостренням демографічної кризи в
Україні та підвищенням рівня забрудненості територій (зокрема, внаслідок
аварії на ЧАЕС) зросла потреба у проведенні досліджень, присвячених
вивченню впливу чинників оточуючого середовища на життєздатність та темп
старіння організмів.

В останні роки з’являється все більша кількість робіт, присвячених
математичному моделюванню процесів старіння. У контексті даного напрямку
досліджень безсумнівний інтерес представляє комплексна оцінка впливу
широкого спектру факторів навколишнього середовища, що детермінують
вікову смертність (температура, радіація, тощо), з використанням
сучасних статистичних методів. Зазвичай подібні роботи проводяться за
матеріалами демографічних таблиць смертності. Такий підхід має ряд
недоліків, що, насамперед, пов’язано з неможливістю здійснення на людині
прямого експерименту по вивченню різних впливів, що модифікують
старіння. У рамках даного напрямку додаткові можливості для одержання
інформації може надати вивчення вікової смертності лабораторних тварин
при різних експериментальних впливах. Одна з проблем аналізу вікової
смертності з використанням сучасних статистичних підходів полягає у
виборі адекватного модельного організму. Чи не найпоширенішим з-поміж
модельних об’єктів для проведення досліджень по вивченню впливу чинників
навколишнього середовища на життєздатність організму, зокрема, його
біологічний вік (БВ), репродуктивний потенціал, смертність та тривалість
життя (ТЖ), є дрозофіла.

Дуже важливими є дослідження, присвячені пошуку засобів адаптації
організму до дії ушкоджуючих факторів. Одним з таких факторів є
рентгенівське опромінення, особливу увагу до якого прикуто після аварії
на ЧАЕС. Саме рентгенівське опромінення найчастіше використовується з
метою моделювання темпу старіння. Це пов’язане з неспецифічним
характером його впливу на різні системи організму. Висловлюється
припущення, що рентгенівське опромінення може призводити до прискорення
старіння організму (Виленчик М.М., 1987, Фролькис В.В., Мурадян Х.К.,
1992). Одним з засобів протидії впливу ушкоджуючих чинників, і, зокрема,
радіації, є реалізація механізму адаптивного відгуку, який полягає в
тому, що попередня експозиція в умовах м’якого стресу може збільшувати
виживання після сильного стресу (Krebs R.A., Loeschke V. 1994, Smirnova
O.A., Yonezawa M., 2003). У зв’язку з цим велике значення має пошук
засобів активізації механізму адаптивного відгуку з метою нівелювання
шкідливих ефектів певних факторів оточення.

Відомо, що чутливість тварин до опромінення та інших ушкоджуючих
факторів не є однаковою на різних стадіях онтогенезу (яким відповідають
різні можливості адаптації і гомеостазу) (Кудряшев Ю.Б., 1983; Москалев
Ю.И., 1991). Проте, дані про особливості впливу радіації та інших
чинників оточення на різних стадіях онтогенезу на біологічний вік тварин
та перебіг процесу старіння практично відсутні, що обумовлює
актуальність таких досліджень. Також нову інформацію щодо факторів, які
модифікують темп старіння та смертність, можна отримати завдяки
використанню сучасних статистичних моделей, зокрема, моделей Гомперця та
біологічного віку, а також застосуванню методів багатомірної статистики,
зокрема, моделі факторного аналізу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Базовими для
підготовки та подання дисертаційної роботи, в яких здобувач приймала
участь у проведенні досліджень та аналізі результатів, були такі
науково-дослідні роботи, виконані у межах наукової тематики Інституту
геронтології АМН України:

– Математичне і експериментальне моделювання впливу екологічних факторів
на старіння, вікову смертність та тривалість життя і медико-демографічна
оцінка наслідків аварії на ЧАЕС (1992-1995 рр., номер державної
реєстрації UA01002438P).

– Вплив екологiчних стресiв на розвиток, старiння та тривалiсть життя
Drosophila melanogaster (1996-1998 рр., номер державної реєстрації
0196U001300).

– Вплив стресів у ранньому онтогенезі на біологічний вік, тривалість
життя та структурно-функціональні характеристики геному Drosophila
melanogaster (1999-2001 рр., номер державної реєстрації 0199U000637).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення змін
біологічного віку, смертності та тривалості життя Drosophila
melanogaster, спричинених впливом ушкоджуючих чинників фізичної та
хімічної природи на різних стадіях онтогенезу комах.

Для вирішення поставленої мети були визначені наступні завдання:

– дослідити вплив рентгенівського опромінення на різних стадіях
онтогенезу Drosophila melanogaster (стадії яйця та імаго комах) на
інтенсивність метаболізму, локомоторну активність, репродуктивну
активність, темп старіння та (ТЖ);

– порівняти вплив однакової дози гострого (400 Гр) та фракціонованого
(150 Гр – 30 хв перерви – 250 Гр) опромінення молодих комах на їх БВ та
динаміку смертності;

– дослідити комбінований вплив рентгенівського опромінення та
інкорпорованих радіонуклідів (цезію та стронцію) на темп смертності та
ТЖ дрозофіл;

– вивчити модифікуючий вплив температури на різних стадіях розвитку на
темп смертності та ТЖ опромінених комах;

– дослідити комбінований вплив нітрату алюмінію та опромінення на БВ та
ТЖ комах;

– вивчити вплив ауринтрикарбонової кислоти після опромінення дрозофіл
різними дозами радіації на стадії яйця на БВ та ТЖ комах.

Об’єкт дослідження: біологічний вік, смертність та тривалість життя
Drosophila melanogaster.

Предмет дослідження: зміни темпу старіння аутбредної лабораторної
популяції дрозофіл в залежності від сили впливу ушкоджуючого фактору
(зокрема, іонізуючого опромінення) та стадії розвитку, на якій
здійснюється цей вплив.

Методи дослідження: фізіологічні, морфологічні
(електронно-мікроскопічний аналіз), популяційні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено, що опромінення
молодих імаго дрозофіл може призводити до короткочасної стимуляції їх
фізіологічних показників з подальшим підвищенням (погіршенням)
біологічного віку та смертності комах. Продемонстровано, що опромінення
Drosophila melanogaster на стадії яйця спричинює підвищення рівня
смертності молодих комах, а опромінення дорослих комах (імаго) прискорює
темп старіння. Показано, що опромінення дрозофіл у малій дозі (0,5 Гр)
на стадії яйця викликає розвиток в клітинах мозку імаго дрозофіли
гіперплазію та гіпертрофію мітохондрій, що свідчить про функціональне
напруження внутрішньоклітинних систем, а опромінення дрозофіл у великій
дозі (4 Гр) призводить до виражених деструктивних змін в клітинах мозку
(нейронах та глії), що нагадують вікові. Показано зниження з віком
чутливості дрозофіл до опромінювання на стадії імаго. Виявлено статеві
відмінності реакції комах на стрес: самці демонструють нижчу
толерантність до стресу порівняно із самками, але кращу спроможність у
досягненні гормезисних ефектів. Показано, що застосування теплового шоку
перед опроміненням на стадії імаго спричинює більший радіопротекторний
ефект, ніж після опромінення. Продемонстровано, що застосування хімічних
препаратів (нітрат алюмінію та ауринтрикарбонова кислота) у дозах, що не
чинять негативного впливу на фізіологічні параметри неопромінених комах,
може спричинити токсичні ефекти у опромінених.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані
результати та їх аналіз доповнюють та поглиблюють сучасні уявлення про
характер фізіологічних змін в процесі старіння організму. У роботі
застосовано системний підхід, що полягає в одночасному вивченні
декількох фізіологічних маркерів старіння (з наступним визначенням
такого інтегрального показника, як біологічний вік) і вікової смертності
в експериментальних популяціях. Це дозволило одержати інформацію про
характер впливу навколишнього середовища на процеси, пов’язані зі зміною
фізіологічних систем організму і вікової смертності.

На основі результатів дослідження розроблено експериментальну модель,
яка дозволяє оцінювати вплив чинників будь-якої природи на темп
старіння. Ця модель може бути використана в
експериментально-геронтологічних дослідженнях з метою вивчення
механізмів дії стресуючих факторів на організм. Опрацьовано метод
визначення біологічного віку Drosophila melanogaster, який може бути
використаний в експериментальній геронтології для оцінки інтегральної
життєздатності (біологічного віку) комах при вивченні експериментальних
модифікацій темпу старіння.

Застосування системного підходу при вивченні експериментальних
модифікацій темп старіння дрозофіли, що полягає в одночасному вивченні
смертності і біологічного віку мух, представляє суттєве теоретичне та
практичне значення, та дає змогу використовувати дрозофілу як
перспективний модельний об’єкт для експериментальних досліджень процесів
старіння на популяційному рівні.

Особистий внесок здобувача полягає у підготовці та проведенні
експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Усі
експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при
безпосередній участі автора роботи. Головна ідея роботи була
запропонована науковим керівником, а її практичне виконання належить
дисертанту. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено пошук та
аналіз наукової літератури, статистична обробка результатів досліджень,
аналіз та узагальнення одержаних даних, сформульовані основні положення
та висновки, апробація результатів дослідження та підготовка до друку
робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації, оприлюднені на засіданнях сектору біології старіння
Інституту геронтології АМН України, науковій конференції “Прискорене
старіння: зв’язок з віковою патологією” (Київ, 1992); на конференціях
молодих вчених в Інституті геронтології АМН України (1993, 1999-2005);
на II з’їзді медичних генетиків України (Львів, 1995),
науково-практичній конференції “Застосування геропротекторів для
попередження прискореного старіння” (Київ, 1996 р.), міжнародних
симпозіумах “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1998, 2000, 2002,
2004 рр.), ІІ Європейському конгресі по біогеронтології (м.
Санкт-Петербург, 2000 р.), ІІ Українському з’їзді геронтологів та
геріатрів (2000 р.), на засіданні Харківського відділення Українського
товариства геронтологів та геріатрів (Харків, 2002). Результати
дослідження увійшли у звіти лабораторії.

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені в 14
статтях, 6 препринтах та 18 тезах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 173 сторінках
машинописного тексту, ілюстрована 34 рисунками, 25 таблицями. Вона
складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого опису
об’єктів та методів дослідження, 4 розділів, в яких викладено результати
досліджень, розділу, присвяченого аналізу і узагальненню отриманих
результатів, висновків та списку використаних джерел із 281 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведено на аутбредній лабораторній популяції Drosophila
melanogaster лінії Oregon-R. Виживаність комах на передімагінальних
стадіях визначали як частку мух, які пройшли повний цикл розвитку (від
яйця до імаго). Для визначення імагінальної ТЖ використовували по
100-200 комах у кожній з експериментальних груп. Для кожної групи
розраховували середню ТЖ (СТЖ) і максимальну ТЖ (МТЖ) (яку розраховували
як СТЖ останніх 10 % мух, що вижили (Дубина Т.Л., Разумович А.Н.,
1975)).

Визначення біологічного віку мух здійснювали за допомогою батареї тестів
(Вайсерман О.М., 1992), до складу якої входили такі показники:

індукована локомоторна активність (фототаксис);

стійкість до теплового шоку;

стійкість до позбавлення корму.

Інтенсивність смертності визначали як логарифм кількості померлих комах
за певний проміжок часу (ln (Rt)). Рівняння Гомперця (Гаврилов Л.А.,
1987) має вигляд:

ln (Rt) = ( (КВ) + C,

де Rt – смертність популяції, ( – коефіціент (кут нахилу прямої, який
характеризує швидкість вимирання), КВ – календарний вік, С – вільний
член рівняння (вихідний рівень пошкоджень).

З метою вивченням комбінованого впливу чинників оточення на ТЖ та БВ
комах використовували:

температурний стрес на стадії яйця дрозофіл (37ОС протягом 1 год, 7ОС
протягом 1 год), на стадії імаго дрозофіл (35,5 ( 0,5 ОС протягом 2
год);

додавання геропромотору нітрату алюмінію (Al (NO3)3 * 9H2O) у
концентрації 20 г/л корму на стадії імаго дрозофіл протягом трьох діб (у
віці 3-6 діб);

додавання інгібітору апоптозу ауринтрикарбонової кислоти (Mogil R.J.,
Shi Y., et al., 1994) у концентрації 100 мг/л корму на стадії личинки
дрозофіл.

Рентгенівське опромінення здійснювали одноразово на стадії яйця (у дозах
0,1; 0,3; 0,5; 1; 2 та 4 Гр) та імаго (у дозах 56; 108; 160; 240 та 400
Гр). Співвідношення рентгена з міжнародною одиницею: 1Р = 2,58 ( 10-4
Кл/кг, оскільки 1 Гр = 100 Р, то 1 Гр = 2,58 ( 10-2 Кл/кг.

Для оцінки життєздатності мух у кожній з експериментальних груп
визначали:

масу тіла;

інтенсивність метаболізму (по концентрації СО2);

індуковану локомоторну активність (фототаксис та геотаксис);

стійкість до позбавлення корму;

стійкість до теплового шоку;

репродуктивну активність самок (фекандильність та фертильність).

Для порівняльної характеристики змін, спричинених опроміненням з такими
при нормальному старінні дрозофіл, нами було проведено
електронно-мікроскопічне дослідження мозку дрозофіл: інтактних різного
віку (дорослих та старих) та дорослих комах після радіаційного
опромінення на стадії яйця (0,5 та 4 Гр). Оцінку ультраструктурних змін
мозку дрозофіл проводили із застосуванням методів електронної
мікроскопії співробітниками лабораторії морфології Інституту
геронтології АМН України під керівництвом Квітницької-Рижової Т.Ю.
Об’єктом ультраструктурного аналізу були обрані lamina ganglionaris –
медіальна частина мозку, що межує з оком, а також центральні частини
мозку, що входять до складу так званих “грибовидних тіл”, що беруть
початок з pedunculus і формують декілька долей, та ділянки, особливо
багаті на клітини, що оточують “грибовидні тіла” (Crittenden J., et al.,
1998; Ito K., et al., 1998). Для електронномікроскопічних досліджень
ультратонкі зрізи голови комах фіксували у 2,5% розчині глютаральдегіду
на фосфатному буфері (рН 7,4) протягом 4 годин при температурі +4(С.
Дофіксація в 2% розчині осмієвої кислоти на такому ж буфері протягом 2
годин і подальше заливання в епон-аралдитну суміш виконувались за
загальноприйнятими методами (Уикли Б., 1975). Ультратонкі зрізи готували
на ультратомі LKB- III (Швеція).

Для статистичного опрацювання отриманих результатів використовували
регресійний, кореляційний, дисперсійний і факторний методи статистичного
аналізу за допомогою програм “STATGRAPHICS” (STATGRAPHICS, 1987),
“STATISTICA 5.0” (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1997) та
спеціалізованих програм, написаних в лабораторії математичного
моделювання процесів старіння Інституту геронтології для розрахунку
біологічного віку та тривалості життя. Достовірність відхилень середніх
значень показників оцінювали за допомогою критерію Ст’юдента, для
визначення достовірності відхилень кривих вимирання застосовували
непараметричний критерій Колмогорова-Смирнова.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив рентгенівського опромінення на різних стадіях онтогенезу на
життєздатність та темп старіння Drosophila melanogaster

Вплив опромінення на стадії яйця на життєздатність та тривалість життя
імаго Drosophila melanogaster та їх нащадків. Підвищення інтересу до
проблеми віддалених наслідків опромінення, а також ствердження деяких
авторів про те, що потенціал ТЖ визначається на ранніх стадіях життя
(Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С., 1991; Yonemura et al., 1991) спонукало
нас до вивчення впливу опромінення на передімагінальних стадіях на
життєздатність імаго дрозофіл та нащадків першого покоління. Мух на
стадії яйця опромінювали рентгенівськими променями у дозах 0,1; 0,3;
0,5; 1; 2 і 4 Гр. Виявлено достовірне зниження смертності на
передімагінальних стадіях у мух, опромінених у дозі 0,1 Гр (в 3 рази у
порівнянні з контролем), а у мух, опромінених у дозах 1 Гр, 2 Гр та 4 Гр
– виявлено підвищення смертності в 2, 3 та 4 рази відповідно у
порівнянні з контролем. СТЖ самців, опромінених на стадії яйця (рис.1)
вже починаючи з дози 0,1 Гр достовірно знижується у порівнянні з
контролем. МТЖ також знижується у самців, опромінених у дозах 0,3; 1 та
2 Гр. У самців, що зазнали опромінення у дозах 2 та 4 Гр, спостерігали
підвищення маси тіла, підвищення інтенсивності метаболізму (табл.1).
Зниження локомоторної активності у порівнянні з контролем спостерігали у
комах, опромінених у дозі 1 Гр та більше (табл.1, табл.2). Менші дози
опромінення (0,1, 0,3 та 0,5 Гр) достовірно не вплинули на показники
життєздатності. В поколінні F1 виявлено гормезис (збільшення ТЖ) у
самців, батьки яких були опромінені у дозах менше 1 Гр.

Рис.1. Характер зміни середньої тривалості життя із збільшенням дози
опромінення дрозофіл на стадії яйця.

Примітка: * – p Реактивні зміни ультраструктури мозку імаго Drosophila melanogaster за умов іонізуючого опромінення у ранньому онтогенезі. Виявлено, що при старінні в клітинах мозку дрозофіли відбуваються вікові зміни ультраструктури, що носять деструктивний, інволютивний характер: ущільнення цито- і каріоплазми клітин, їх набряк та вакуолізація, набряк ядра і цитоплазми нейронів з деструкцією практично усіх внутрішньоцитоплазматичних органел, накопичення в цитоплазмі клітин (як нейронів, так і глії) великої кількості щільних тілець, вторинних лізосом, пігментних гранул, ліпідних включень та мембранних залишків, інтрамітохондріальних кристалічних включень та поліморфних внутрішньоядерних включень, підвищення рівня вірусних включень (як в ядрі, так і в цитоплазмі) у порівнянні з молодими комахами. Під впливом малих доз опромінення (0,5 Гр) в клітинах мозку дрозофіл розвивались помірні деструктивні зміни, що загалом нагадували вікові, та досить демонстративні зміни (насамперед, гіперплазія та гіпертрофія мітохондрій), що свідчили про функціональне напруження та підвищення функціональної активності деяких внутрішньоклітинних систем. Під впливом великої дози опромінення (4 Гр) на стадії яйця в клітинах мозку імаго дрозофіли розвивалися виражені деструктивні зміни, що нагадували вікові, але були більш глибокими та руйнівними. Водночас відбувались і процеси гіперплазії гранулярного ендоплазматичного ретикулуму та рибосом, а також гіпертрофії мітохондрій, збільшувалась кількість ламелярних структур гліального походження, які оточували нейрони, що свідчить про розвиток компенсаторних процесів та збільшення функціональної активності частини клітин на фоні тяжких деструктивних змін іншої частини. - @ V ? X’v ? - >

???>

n

i

?

X–?P

v

AE

¤aa$

??????????

?9

?9

?9

?9

?9

?9

?9

@&a$

?C

знижується.

Рис. 2. Інтенсивність смертності самців дрозофіл, опромінених на стадії
імаго у віці 6, 13 та 20 діб.

Порівняння впливу гострого та фракціонованого рентгенівського
опромiнення на бiологiчний вiк, темп старіння та тривалiсть життя
Drosophila melanogaster. Порівняння однакових доз гострого і
фракціонованого опромінення імаго дрозофіл дозволило виявити, що при
фракціонуванні дози знижується негативний вплив опромінення на ТЖ (рис.
3.). Тоді, як гостре опромiнювання мух в молодому вiцi призводило до
зниження середньої та максимальної ТЖ комах, спричиняло підвищення їх
БВ, прискорювало темп старіння, фракціонування дози опромінення в меншій
мірі знижувало середню ТЖ самців, підвищувало їх БВ і, навіть,
підвищувало середню ТЖ самок та знижувало їх БВ (підвищення витривалості
до стресів) у порівнянні з контролем (що свідчить про кращу
резистентність самок до опромінювання). У опромінених самок спостерігали
пригнічення фекандильності. Виявлено віддалений ефект гострого
опромінення – зміну смертності і БВ через 20-30 діб після опромінення.

Рис. 3. Криві виживання Drosophila melanogaster після опромінення в
гострому та фракціонованому режимах.

Примітка. lx – кількість мух, що дожили до віку х.

Комбінований вплив інкорпорованих радіонуклідів та зовнішнього
опромінення на передімагінальних стадіях на тривалість життя імаго
дрозофіли. Проведено вивчення впливу інкорпорованих радіонуклідів (137Cs
та 90Sr на передімагінальних стадіях) на ТЖ Drosophila melanogaster. Всі
впливи спричиняли достовірне (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020