.

Застосування кріоконсервованих ембріональних та стромальних клітин кісткового мозку при експериментальній епілепсії (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
164 2814
Скачать документ

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ ІМЕНІ АКАДЕМІКА А. П. РОМОДАНОВА

КОЧІН Олег Валерійович

УДК: 616. 853 – 085. 36] – 092

Застосування кріоконсервованих ембріональних та стромальних клітин
кісткового мозку при експериментальній епілепсії

14.01.05. – нейрохірургія

Автореферат дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії імені академіка А. П.
Ромоданова АМН України

Науковий керівник: член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук,
професор Цимбалюк Віталій Іванович, заступник директора Інституту
нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України, завідувач
кафедри нейрохірургії Національного медичного університету ім. О.О.
Богомольця МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Лапоногов Олег
Олексанрович, завідувач відділення функціональної нейрохірургії
Інституту нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова АМН України

доктор медичних наук, професор Смоланка Володимир Іванович, завідувач
кафедри нервових хвороб та психіатрії з курсом нейрохірургії
Ужгородського національного університету МОН України

Провідна установа: Дніпропетровська державна медична академія, МОЗ
України, кафедра нервових хвороб та нейрохірургії, м. Дніпропетровськ

Захист відбудеться 24 жовтня 2006 р. о 12 годині на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 26.557.01 в Інституті нейрохірургії імені
академіка А. П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул.
Мануїльського 32, конференц-зал)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту нейрохірургії
імені академіка А. П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул.
Мануїльського 32)

Автореферат розісланий “23”вересня 2006 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор _________________________ Чеботарьова
Л. Л.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Епілепсія є одним з найпоширеніших захворювань центральної нервової
системи, важким за плином, але потенційно виліковним [Дзяк Л. А. із
спіавт., 2001]. У світі на епілепсію страждає близько 40 млн. чоловік. В
20-30% пацієнтів з епілепсією не вдається домогтися фармакологічного
контролю над судорогами [Polkey C. E. et al., 1993].

Хірургічному лікуванню підлягають хворі із частими важкими епілептичними
припадками або важкими когнітивними й поведінковими порушеннями, які не
піддаються консервативному лікуванню. Відповідно до рекомендацій ILAE
[International League Against Epilepsy], рекомендований термін
хірургічного втручання при резистентній до медикаментозної терапії
епілепсії – не більше 2 років безуспішної фармакологічної терапії
[Bittar R. G. et al., 2002; Greenberg M. S., 2001].

З огляду на складність патогенезу епілепсії, на сьогодні накопичений
великий арсенал різноманітних протиепілептичних хірургічних втручань,
спрямованих на припинення або різке зниження частоти епілептичних
припадків. Однак, всі вони не позбавлені певних недоліків. Так, відкрита
резекція скроневої частки, що широко застосовується в лікуванні
скроневої епілепсії, сама по собі є високо травматичною операцією з
видаленням великого об’єму мозкової тканини, та такою, що призводить до
різноманітних ускладнень. Стереотаксична нейрохірургія розглядається
як метод вибору в хірургічному лікуванні епілепсії. Спектр мозкових
структур, які можуть стати мішенями для такого втручання, досить
широкий. Відносно мала травматичність даних втручань значно розширює
групи хворих, в яких може бути застосований стереотаксичний метод.
Істотним недоліком подібних операцій можна вважати їхній деструктивний
вплив на структури мозку зі збільшенням вже існуючих внаслідок
прогресування епілептичного процесу, дегенеративних змін головного
мозку. Так, тривала електростимуляція голівки хвостатого ядра та
зубчастого ядра мозочку приводить до пригнічення епілептичної активності
головного мозку, але, у той же час викликає дегенеративні зміни в зоні
розташування електродів. У зв’язку із цим ряд авторів рекомендує
обмежити застосування цього методу.

Виходячи з вищесказаного, залишається актуальним пошук недеструктивних
методів хірургічного лікування епілепсії. Таким методом, цілком
імовірно, може стати трансплантація стовбурних нервових клітин (НСК).

Дослідження можливостей застосування НСК у хірургічному лікуванні
епілепсії проводяться досить широко. D. Barry at al. (1987, 1989) та
Bengzon J. et al. (1992, 1993) для нейротрансплатації використовували ті
частини ембріонального мозку, які у великій кількості виробляють
норадреналін. Лапоногов О. О. зі співавт. (1998, 2002, 2003) відзначили
високу ефективність ізольованої трансплантації фрагментів ембріональної
нервової тканини, а також її комбінації із кріоамігдалотмією при важкій
епілепсії в дітей. Показаннями до операції були різного виду часті
епілептичні припадки, що не піддаються консервативному лікуванню, а
також психічні й інтелектуально-мнестичні порушення. Після операцій у
хворих було відзначено зниження кількості нападів та поліпшення
інтелектуально-мнестичних функцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконана в межах державної теми №0102U002026 “Вивчення
морфофункціональних особливостей регіональних стовбурних клітин
ембріонів, їх кріочутливості та механізмів реалізації біологічної
активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних
станів” Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України
(Харків).

Метою дослідження є оцінка ефективності застосування кріоконсервованих
ембріональних нервових клітин (КЕНК) і нейробластів, диференційованих з
клітин строми кісткового мозку (КСКМ), у хірургічному лікуванні
епілепсії в експерименті.

Задачі дослідження:

Вивчити оптимальні строки та умови застосування кріоконсервованих
ембріональних нервових клітин та клітин строми кісткового мозку,
диференційованих у нейробласти, у хірургічному лікуванні епілепсії в
експерименті.

Обґрунтувати придатність пеніцилінової моделі епілепсії для апробації
методів її хірургічного лікування.

Вивчити мікроморфологічні, електрофізіологічні та біохімічні зміни в
головному мозку епілептизованих щурів після введення кріоконсервованих
ембріональних нервових клітин в ділянку експериментального епілептичного
вогнища.

Вивчити мікроморфологічні, електрофізіологічні та біохімічні зміни в
головному мозку епілептизованих щурів після введення клітин строми
кісткового мозку, диференційованих у нейробласти, в ділянку
експериментального епілептичного вогнища.

Провести порівняльну оцінку ефектів застосування кріоконсервованих
ембріональних нервових клітин та клітин строми кісткового мозку,
диференційованих у нейробласти, у хірургічному лікуванні епілепсії в
експерименті.

Об’єкт дослідження: самці щурів лінії Вістар у віці 6 місяців, яким була
виконана операція відтворення епілепсії та зроблена трансплантація
суспензії КЕНК та КСКМ в ділянку експериментального епілептичного
вогнища.

Предмет дослідження: динаміка мікроморфологічних, біохімічних та
електрофізіологічних зрушень у головному мозку епілептизованих щурів
після трансплантацій КЕНК та КСКМ.

Методи дослідження: мікроморфологічні – для вивчення динаміки змін у
зоні трансплантації КЕНК і КСКМ; біохімічні – для дослідження коливань
вмісту ГАМК і біогенних амінів у стовбурі головного мозку
епілептизованих щурів після трансплантації КЕНК і КСКМ;
електрофізіологічні – для дослідження змін електричної активності
гіпокампів епілептизованих щурів після трансплантації.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше були встановлені
оптимальні строки трансплантації НСК в експериментальне пеніцилінове
епілептичне вогнище після операції відтворення епілепсії. Показано, що
гострі запальні зміни в зоні операції відтворення епілепсії стихають
протягом 15 діб, а вплив медіаторів запалення, що спричиняє ушкодження
клітин трансплантату, є мінімальним, якщо виконувати трансплантацію
після зазначеного терміну.

Вперше показано, на підставі дослідження динаміки мікроморфологічних,
біохімічних та електрофізіологічних змін в центральній нервовій системі
епілептизованих щурів, що трансплантації КЕНК та КСКМ в епілептичне
вогнище є однаково ефективними.

Доведено, що трансплантація КЕНК і КСКМ у ділянку епілептичного вогнища
істотно та односпрямовано впливає на динаміку вмісту ГАМК, серотоніну,
норадреналіну, дофаміну та адреналіну у стовбурі головного мозку щурів.

Вперше встановлено, що трансплантації КЕНК і КСКМ у ділянку
епілептичного вогнища приводить до відновлення фізіологічного для
ссавців типу електричної активності гіпокампу – и-ритму.

Практичне значення отриманих результатів. Показано, що пеніцилінова
модель придатна для розробки методів хірургічного лікування епілепсії.
Встановлені оптимальні строки проведення хірургічного лікування.

Отримані в роботі дані про динаміку мікроморфологічних, біохімічних та
електрофізіологічних змін у центральній нервовій системі епілептизованих
щурів після трансплантації КЕНК та КСКМ, диференційованих у нейробласти,
можуть бути використані при розробці способів хірургічного лікування
епілепсії.

Особистий внесок здобувача. Автором проведені аналіз а узагальнення
літературних даних, сформульовані мета й завдання дослідження,
підібрані адекватні методи організації та проведення досліджень,
виконані оперативні втручання на тваринах, виконані обробка, аналіз та
опис отриманих результатів. Автором не були використані наукові
результати й ідеї, що належать співавторам опублікованих робіт.

Апробація отриманих результатів. Основні положення дисертації
доповідалися та обговорювалися на III Російському конгресі
патофізіологів з міжнародною участю “Дизрегуляторная патология органов и
систем”, (Москва, 2004), Міжнародній науково-технічній конференції
студентів, аспірантів та вчених “Молодь та сучасні проблеми радіотехніки
та телекмунікацій” (Севастополь, 2006), Конференції нейрохірургів
України “Нові технології в нейрохірургії” (Ужгород, 2006), Ювілейній
Всеросійській науково-практичній конференціі “Поленовские чтения”
(Санкт-Петербург, 2006).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 7 наукових працях, з
них 3 статті в журналах, 4 тези доповідей у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу,
літературного огляду, опису матеріалу та методів дослідження,
результатів та аналізу досліджень, закінчення, висновків та списку
літератури (46 вітчизняних та 260 закордонних джерел). Ілюстративний
матеріал представлений 21 таблицею та 64 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження. У дослідженні було використано 203
самця щурів лінії Вістар у віці 6 місяців масою 200-250 г з низькою
початковою аудіогенною судорожною готовністю. Поріг судорожної
готовності визначався за методикою, запропонованою Поповою О. Н. зі
співавт. (1999), що складалася у звуковому подразненні, гучністю 100 дБ,
тривалістю 2 хв., з 3-4 кратним повторюванням. В експерименті
використовувалися тварини, у яких після триразового звукового впливу
судорожний припадок не розвивався.

Дослідження проводилося в три етапи. На першому етапі було виконане
вивчення мікроморфологічних, біохімічних та електрофізіологічних змін у
головному мозку щурів після моделювання епілепсії.

На другому етапі вивчена динаміка морфологічних та
електрофізіологічних змін у гіпокампах білатерально, а також біохімічних
змін у стовбурі головного мозку щурів зі змодельованою епілепсією після
трансплантації кріоконсервованих ембріональних нервових клітин у зону
експериментального епілептичного вогнища.

На третьому етапі дослідження було проведене вивчення динаміки
мікроморфологічних й електрофізіологічних зрушень у гіпокампі, та
динаміки вмісту біогенних амінів та ГАМК у стовбурі головного мозку
щурів після трансплантації клітин строми кісткового мозку,
диференційованих у нейробласти, у ділянку експериментального
епілептичного вогнища.

Окремо була виділена група з 24 тварин, яким у зону епілептичного
вогнища була виконана трансплантація суспензії ембріональних клітин
печінки. У даній групі тварин дослідження вмісту ГАМК та біогенних
амінів проведене на 10-у, 30-у та 60-у добу після трансплантації, також
вивчено рівень аудіогенної судорожної готовності з метою з’ясування
впливу на динаміку епілептичного процесу трансплантації не нейрогенного
клітинного матеріалу в епілептичне вогнище.

Епілепсія у тварин моделювалася шляхом стереотаксичної ін’єкції
пеніциліну у гіпокамп. Скелетотопічними орієнтирами для операції на
черепі тварини служили вінцевий та стрілоподібний шви, брегма (точка
перетинання зазначених швів), а також ламбда (точка перетинання
стрілоподібного та ламбдаподібного швів). Після внутрішньоочеревинного
введення розчину тіопенталу (0,012 мг/100 г маси тварини) голову тварини
фіксували в стереотаксичній установці за верхні різці та зовнішні
слухові проходи так, щоб сагітальна площина проходила строго через
верхні різці та стрілоподібний шов. Лінійний розріз м’яких тканин
довжиною до 2 см у проекції стрілоподібного шва починали на 0,5 см
ззаду від лінії, проведеної через верхні краї орбіт. Кістку скелетували
для достатньої візуалізації брегми, ламбди та стрлоподібного шва. Після
видалення м’яких тканин з черепа робили корекцію положення голови в
стереотаксичній установці так, щоб брегма розташовувалася на 1 мм вище
ламбди. Стереотаксичні координати гіпокампа визначали за атласом
Fifkova та Marsala (1967) на 3 мм каудальніше (AP3), на 2 мм
латеральніше брегми та на 3,4 мм вентральніше поверхні кістки.
Фрезьовий отвір робили на 3 мм позаду від брегми та на 2 мм лівіше
стрілоподібного шва. Розчин натрієвої солі пеніциліну у дозі 100 ОД
об’ємом 1 мкл за допомогою мікроін’єктра, жорстко закріпленого на
стереотаксичному апараті, вводили зі швидкістю 0,5 мкл/хв. Потім голка
витягалася, рана ушивалася двома вузловими швами.

Критерієм успішності операції був розвиток у тварин клонічних судорог
тривалістю 3-5 хв. після введення пеніциліну. Летальність тварин після
операції відтворення епілепсії становила 5%. У післяопераційному періоді
судороги в прооперованих тварин провокувалися за допомогою звукового
впливу гучністю 100 дБ, тривалістю до 2 хв.

Джерелом суспензії алогенних кріоконсервованих фетальних нервових
клітин служила нервова тканина плодів щурів 13-14 доби гестації. Плоди
щурів одержували шляхом розкриття черевної порожнини анестезованої
вагітної самки. Витягнуті ембріони промивали в розчині Хенкса, потім
витягали головний мозок і розрізали його на невеликі фрагменти.
Суспензію КЕНК одержували шляхом м’якої дезагрегації фрагментів нервової
тканини в 10-кратному об’ємі розчину Хенкса за допомогою спеціального
вібраційного пристрою. Отриману клітинну суспензію фільтрували, додавали
кріопротектор диметилсульфоксид до кінцевої концентрації 10% і
розливали в пробірки для кріоконсервування фірми Costar (Канада).
Заморожування виконувалося за 3-х етапною програмою охолодження: 1 етап
– зі швидкістю 1оС/хв до -40оС, 2 етап – 10оС/хв до -80оС, 3 етап –
занурення в рідкий азот. Розморожування суспензії КЕНК здійснювалося на
водяній лазні при температурі 40оС. Концентрація клітинної суспензії
становила 16,7-20,5 Ч 106 клітин/мл, життєздатність – не менш 60%.

Клітини строми кісткового мозку щурів витягали шляхом пункції діафізу
стегнової кістки щурів з промиванням їх розчином Хенкса (Sigma) в умовах
внутрішньоочеревинного тіопенталового наркозу. Отриману тканину
ресуспендували та двічі відмивали в розчині Хенкса по 5 хвилин
центрифугуванням при 1000 об./ хв. Відмиті клітини ресуспендували у
культуральному середовищі MEM/F12 (1/1) з 10 % фетальною бичачою
сироваткою (Sigma) та розсіювали по 5 мільйонів клітин на
культуральний посуд (25 см2, Nunc). Через 24 години культивування
середовище з незакріпленими клітинами кісткового мозку видаляли,
додавали свіже середовище та продовжували культивувати
фібробластоподібні клітини ще тиждень для одержання первинної культури
клітин строми кісткового мозку. Для диференціювання отриманих клітин у
нейробласти (попередники нервових клітин) використовували середовище
DMEM/F12 з 2% 10-6 ретиноєвою кислотою. Концентрація клітинної
суспензії, що вводилася, становила 106 кліток/мл. Життєздатність
досягала 100%.

Джерелом суспензії алогенних кріоконсервованих ембріональних клітин
печінки служила печінка ембріонів щурів 13-14 доби гестації. Ембріони
щурів одержували шляхом розкриття черевної порожнини анестезованої
вагітної самки. Витягнуті ембріони промивали в розчині Хенкса, потім
витягали печінку та розрізали її на невеликі фрагменти. Обробку та
заморожування проводили за тією ж програмою. Клітинність суспензії
становила 12 Ч 106/мл.

Трансплантацію здійснювали стереотаксичним методом за допомогою
мікроін’єктора МШ-1М в зону експериментального епілептичного вогнища
(ростральний гіпокамп зліва). Об’єм суспензії, що вводилася, становив
10 мкл, швидкість введення – 0,5 мкл/хв.

Морфологічні дослідження зони введення пеніциліну дозволили встановити,
що гострі травматичні зміни та репаративні процеси з формуванням
гліального рубця в зоні операції стихають не пізніше 15-и діб після
втручання. Можна вважати, що мінімальний термін після операції
відтворення пеніцилінового епілептичного вогнища, коли травматичні й
запальні зміни в зоні операції не вплинуть на результат трансплантації в
нього стовбурових нервових клітин, є 15 діб.

При дослідженні показників ГАМК та біогенних амінів, які виконують
нейротрансмітерную функцію, у стовбурі головного мозку щурів виявлено,
що їх вміст був значно більшим після операції моделювання епілепсії
порівняно з аналогічними показниками в щурів з низькою судорожною
готовністю. Виражене підвищення вмісту ГАМК у стовбурі головного мозку
епілептизированих тварин відзначено вже в ранній термін після
відтворення епілепсії. Розходження між показниками в досліджених групах
були статистично вірогідні протягом усього спостереження (Р * , X Z \ U'x)®/°/E2?4 4E4I4|6N79e:?

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020