.

Особливості катаболічних процесів у стійких до антибіотиків штамів neisseria gonorrhoeae (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
142 3372
Скачать документ

Національна Академія Наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

крисенко олександр Володимирович

УДК 579.222.6

Особливості катаболічних процесів у стійких до антибіотиків штамів
neisseria gonorrhoeae

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології
Дніпропетровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Вінніков Альберт Іванович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри мікробіології та вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Варбанець Людмила Дмитрівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор медичних наук

Поліщук Олена Іванівна,

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України,

завідувач лабораторії загальної мікробіології

Провідна організація: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “20 ” вересня 2006 року о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту дисертацій при
Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
за адресою: Д 03680 Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології

і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 Київ
ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “18“ серпня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Пуріш Л.М.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема розповсюдження стійких до антибіотиків
штамів патогенних бактерій належить до числа найгостріших в сучасній
медицині та біології, оскільки саме антибіотики є найбільш ефективним, а
часто єдиним інструментом в боротьбі із мікробними збудниками
захворювань. Гонокок в цьому плані не є виключенням – відомо про
стійкість гонококів до антибіотиків всіх основних класів (Ray at al.,
2005), включаючи нещодавно запроваджені в медичну практику, а також
множинну резистентність гонококів (Van Duynhoven, 1999). Слід
відзначити, що гонококова інфекція є одним із чинників, що впливає на
репродуктивне здоров’я, а відтак певною мірою і на демографічний стан в
країні. Все це зумовлює окрім суто науково-практичної значимості,
соціально-економічну актуальність проблеми.

Одним із шляхів вирішення проблеми є пошук та впровадження нових
антибіотиків, однак цей підхід не дозволяє остаточно вирішити проблему,
оскільки антибіотикорезистентність у мікроорганізмів формується досить
швидко. Ще одним підходом є застосування одночасно з антибіотиками
препаратів, що пригнічували б ферменти, які забезпечують резистентність
завдяки інактивації антибіотика, проте такий підхід не дає змогу
подолати стійкість, зумовлену іншими механізмами (модифікація мішені,
зниження проникності поверхневих структур клітини та інші). Таким чином,
незважаючи на значну кількість досліджень, проблема залишається далекою
від вирішення.

На сьогодні не викликає сумніву те, що для розв’язання проблеми
антибіотикорезистентності є необхідним детальне дослідження всіх
аспектів, пов’язаних з антибіотикорезистентністю, зокрема метаболізму
бактеріальної клітини. Очевидним є те, що реалізація механізмів
антибіотикостійкості пов’язана як із специфічними, так і загальними
структурно-функціональними змінами в бактеріальній клітині. Все це
зумовлює необхідність найбільш широкого порівняльного вивчення різних
ланок метаболізму чутливих та стійких до антибіотиків штамів, з метою
встановлення метаболічних особливостей, пов’язаних із стійкістю до
антибіотиків. Особливої уваги заслуговують процеси катаболічного обміну,
оскільки і реалізація механізмів стійкості, і розповсюдження генетичних
детермінант антибіотикорезистентності пов’язані з енергозалежними
процесами (Вінніков, 1988).

В цьому плані Neisseria gonorrhoeae залишається недостатньо вивченим
об’єктом. Дані про особливості метаболізму гонококів в зв’язку із
стійкістю до антибіотиків практично відсутні. Все це значно ускладнює
розробку раціональних підходів використання антибіотиків при терапії
гонококових інфекцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження,
представлені в роботі, виконані на кафедрі мікробіології та вірусології
Дніпропетровського національного університету, в межах програми
науково-дослідної держбюджетної теми № 4-031-03 “Фізіолого-біохімічні
процеси, які лежать в основі синтезу біологічно активних сполук,
патогенності та взаємовідносин у мікроорганізмів” (№ державної
реєстрації 0103U000560), яка координується планом науково-дослідних тем
Міністерства освіти та науки України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи був порівняльний аналіз основних
процесів катаболічного обміну у чутливого та стійких до антибіотиків
штамів N. gonorrhoeae.

Реалізація поставленої мети здійснювалась виконанням таких задач:

встановити інтенсивність накопичення кінцевих продуктів шляхів
катаболізму глюкози та вплив на ці процеси специфічного інгібітора
гліколізу;

визначити активність основних ферментів гліколізу, пентозо-фосфатного
циклу, шляху Ентнера-Дудорова;

визначити загальну інтенсивність циклу трикарбонових кислот,
інтенсивність окислювальних, анаплеротичних реакцій та реакцій, що
пов’язують цикл з конструктивним обміном;

дослідити окислювальну активність клітин та мембранних препаратів,
особливості функціонування дихального ланцюга та вплив специфічних
інгібіторів;

встановити показник ліпід-білкового співвідношення в цитоплазматичній
мембрані у стійких та чутливих до антибіотиків штамів гонококів, що
досліджувались.

Об’єктом дослідження були штами N. gonorrhoeae, серед яких чутливий та
стійкі до антибіотиків, антибіотикорезистентність, ферменти та
структурні компоненти клітини.

Предмет дослідження – основні процеси катаболічного обміну та
структурно-функціональні показники цитоплазматичної мембрани чутливого
та стійких до антибіотиків штамів гонококів.

Методи дослідження – мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні,
хімічні.

Наукова новизна роботи. Вперше проведено порівняльне дослідження
основних катаболічних процесів: гліколізу, пентозофосфатного циклу,
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатного шляху, циклу трикарбонових кислот в
аеробних та анаеробних умовах у стійких та чутливого до антибіотиків
штамів гонококів.

Вперше показано загальну інтенсифікацію катаболізму глюкози, встановлено
зміну співвідношення шляхів катаболізму глюкози у множинностійких штамів
гонококів: посилення ролі шляху Ентнера-Дудорова та гліколізу, зниження
активності окислювальної ланки пентозофосфатного циклу.

Встановлено зниження загальної інтенсивності циклу трикарбонових кислот
та окислювальних реакцій циклу, водночас із посиленням протоку
інтермедіатів циклу на біосинтетичні процеси у полірезистентних штамів
N. gonorrhoeae, по відношенню до чутливого штаму.

Вперше визначено значення показника співвідношення ліпід/білок
мембранних препаратів гонококів та показано підвищення цього показника у
множинностійких штамів порівняно з чутливим.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати
вказують на відмінності процесів катаболічного обміну та центрального
метаболізму у стійких до антибіотиків штамів гонококів, а тому можуть
стати основою для розробки нових підходів у вирішенні проблеми подолання
антибіотикорезистентності, зокрема застосуванню препаратів, які б
специфічно впливали на окремі метаболічні ланки мікробної клітини, в
першу чергу на процеси енергетичного обміну. Це є підставою для розробки
та вдосконалення схем раціональної антибіотикотерапії, які завдяки
комбінованій дії антибіотиків та препаратів, що впливають на метаболізм
бактеріальної клітини, були б високоефективними по відношенню до стійких
штамів.

Матеріали дисертації увійшли в навчальні програми ряду курсів кафедри
мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного
університету: “мікробіологія”, “медична мікробіологія”, “вчення про
антибіотики”, “фізико-хімічні методи в мікробіології”, “сучасні методи
діагностики інфекційних захворювань”.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на кафедрі
мікробіології та вірусології ДНУ під керівництвом доктора біологічних
наук, професора Віннікова А.І. Автором особисто проведено аналіз
літературних даних щодо проблем, висвітлених у роботі, здійснено
експериментальні, лабораторні дослідження, аналіз, узагальнення та
обговорення отриманих результатів. Автором самостійно визначена
інтенсивність процесів катаболічного обміну, зокрема, початкових шляхів
катаболізму глюкози (гліколізу, пентозофосфатного циклу, схеми
Ентнера-Дудорова), циклу трикарбонових кислот та анаболічних реакцій,
пов’язаних з циклом у N. gonorrhoeae. Досліджено особливості
функціонування дихального ланцюга, вплив інгібіторів дихання, визначено
співвідношення ліпід/білок в мембранних препаратах. Визначення
чутливості до антибіотиків та культурально-фізіологічних властивостей
досліджених штамів N. gonorrhoeae проведено спільно з ас. Скляр Т.В.,
визначення окислювальної активності проведено спільно з к.б.н., доц.
Голодок Л.П., які є співавторами відповідних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на V Міжнародній Конференції “Альянс Франсез”
(Дніпропетровськ, 1998), І Міжнародному конгресі “Актуальні питання
інфектології в акушерстві та гінекології” (Донецьк, 1998), ІІ
Міжнародному конгресі “Актуальні питання інфектології в акушерстві та
гінекології” (Донецьк, 1999), ІІ з’їзді Українського мікробіологічного
товариства (Чернігів, 2000), ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002); VІ Міжнародній Конференції “Наука і освіта” –
2003 (Дніпропетровськ-2003); Х з’їзді Товариства мікробіологів України
(Одеса, 2004), VІІ Міжнародній Конференції “Наука і освіта” – 2005
(Дніпропетровськ, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них –
6 статей у фахових виданнях та 8 тез конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури (3 розділи), експериментальної частини (4 розділи),
обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, який
включає 218 найменувань (з яких – 176 іноземні). Робота викладена на
131 стор. машинописного тексту, ілюстрована 18 рисунками і 13 таблицями.

Огляд літератури

Розділ 1. Загальні біологічні властивості N. gonorrhoeae.

Представлено дані щодо морфології, ультраструктури, культуральних та
фізіологічних особливостей гонокока.

Розділ 2. Метаболічні особливості гонококів.

У розділі розглянуто особливості метаболізму гонококів, зокрема шляхи
катаболізму глюкози (гліколіз, пенозофосфатний шлях, шлях
Ентнера-Дудорова), центральний метаболізм (цикл трикарбонових кислот),
структуру дихального ланцюга.

Розділ 3. Резистентність гонококів до антимікробних препаратів.

Представлено біохімічні механізми стійкості N. gonorrhoeae до основних
класів антимікробних препаратів. Розглянуто генетичні аспекти
антибіотикорезистентності (хромосомна, плазмідна резистентність,
поширення детермінант стійкості).

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 4. Матеріали та методи досліджень

Характеристика штамів, що досліджувались. Об’єктом досліджень були штами
N. gonorrhoeae: А, B, C, D, E, що відрізняються за рівнями та спектром
чутливості до антибіотиків, із колекції культур кафедри мікробіології та
вірусології Дніпропетровського національного університету (табл. 1). Всі
штами містять криптичну плазміду (4,2 kb), штам D додатково містить
кон’югативну плазміду (38,9 kb), штам E – Африканську (5,1 kb).

Штами характеризувались типовими для N. gonorrhoeae морфологічними,
фізіологічними та біохімічними ознаками (позитивна оксидазна реакція,
відсутність жовтуватого пігменту, ферментація глюкози з утворенням
кислоти та нездатність до ферментації, мальтози, фруктози, сахарози,
маннози, лактози, відсутність гемолізу, нездатність відновлювати NO3-
здатність синтезувати полісахариди із сахарози).

Визначення мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) антибіотиків
методом серійних розведень та інтерпретацію результатів проводили за
методикою, описаною Lind, 1984.

Таблиця 1

МПК ряду антибіотиків по відношенню до штамів N. gonorrhoeae,

що досліджувались

Штами

Примітка: – – стійкіcть до антибіотика; – помірна
стійкість.

Тс – тетрациклін, Cm – хлорамфенікол, Pn – пеніцилін,

Str – стрептоміцин, Sp – спектиноміцин,

Cfk – цефокситін, Cfr – цефуроксим.

* – штам продукує в-лактамазу

Накопичення біомаси гонококів, одержання суспензії клітин, безклiтинних
гомогенатiв та мембранних препаратів. Культивування та накопичення
біомаси гонококів проводили у рідкому живильному середовищі (бульйон на
основі екстракту бичачого серця, pH 7,2, 1% пептону, 20% сироватки
великої рогатої худоби, 2% гідролізату казеїну, 2% екстракту дріжджів,
глюкози – 2 г/л) при струшуванні та на твердому агаризованому середовищі
аналогічного складу. Культивування проводили при температурі 37 0С в
атмосфері з 10% вмістом СО2 (Овчинніков, 1987). Анаеробне культивування
проводили в анаеростаті в атмосфері 5% СO2, 10% H2, 85% N2, до складу
живильного середовища додатково вносили NaNO2 (5 mМ) в якості кінцевого
акцептора електронів.

Для отримання суспензії “спочиваючих” клітин по досягненні середини
логарифмічної фази росту, клітини осаджували та два рази промивали (0,04
М трис-НСl буфером рН 7,4) центрифугуванням (4000g протягом 15 хвилин),
потiм ресуспендували в тому ж буферi з 5 мМ МgCl2. Отримані суспензії
використовувались в дослідах з визначення інтенсивності дихання та
окислювальної активності. Безклiтинний гомогенат отримували руйнуванням
клiтин на ультразвуковому дезінтеграторi УЗДН-1 з експоненцiальним
випромiнювачем. Застосовували такий режим обробки: акустична потужність
– 20 Вт/см; сила струму 0,28 А; частота коливань 22 кГц, температура
озвучуваної суспензiї не перевищувала 5 оС. Озвучування проводили
протягом 3 хвилин з інтервалами в 30 секунд. Ефективність дезінтеграції
контролювали мікроскопічно. Незруйновані клiтини та фрагменти клiтинної
стiнки осаджували центрифугуванням (22000g протягом 30 хвилин), як
безклітинний гомогенат використовували супернатант. Мембранні препарати
отримували центрифугуванням при 144000 g протягом 70 хвилин, 4 оС. Осад
ресуспендували 0,04 М трис-НСl буфером рН 7,4 з 5 мМ МgCl2.

Визначення інтенсивності накопичення кінцевих продуктів катаболізму
глюкози. Визначення основних метаболітів катаболізму глюкози – ацетату
та лактату – проводили за методами, наведеними у Асатіані (1961).
Визначення інтенсивності накопичення кінцевих продуктів катаболiзму
глюкози в анаеробних умовах проводили при iнкубуваннi в пробiрках
Тунберга (вакуум – 4 мм рт. стовпчика). В експериментах по впливу NаF на
iнтенсивнiсть накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози
iнгiбiтор вносили в iнкубацiйне середовище в концентрацiї 10-3 М.

Визначення активності ферментів. Визначення активності ферментів
проводили у безклітинних гомогенатах. Активнiсть гексокiнази (КФ
2.7.1.1.) визначали по закисленню середовища iнкубацiї за допомогою
iндикатора крезолового червоного, вимiрюючи оптичну густину при 547 нм.
Активнiсть фруктозодифосфатальдолази (КФ 4.1.2.13.) визначали за
швидкістю відновлення НАД+ з використанням додаткової ферментативної
системи, що містила глiцеральдегід-3-фосфатдегiдрогеназу.
Фосфофруктокiназну (КФ 2.7.1.11.) активність визначали за швидкістю
окислення НАДН з використанням суміжних ферментів –
фруктозо-1,6-дифосфатальдолази, гліцерол-3-фосфатдегiдрогенази та
тріозофосфатізомерази. Активність глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази (КФ
1.1.1.49) визначали за методом Kornberg, Horecker (1955), по реакцiї
вiдновлення HAДФ+ при окисленнi глюкозо-6-фосфату. Активнiсть
6-фосфоглюконатдегiдрогенази (КФ 1.1.1.44) визначали за тією ж
методикою, що і глюкозо-6-фосфатдегiдрогенази, як субстрат
використовували натрiєву сiль 6-фосфоглюконату. Активність
фосфоглюкоізомерази (КФ 5.3.1.9) визначали спектрофотометрично за
швидкістю накопичення НАДФН з використанням додаткової ферментної
системи, що містила дегідрогеназу глюкозо-6-фосфату.
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу (КФ 4.1.2.14) визначали за
швидкістю окислення НАДН з використанням додаткової ферментативної
системи, що містила лактатдегідрогеназу. Активнiсть
iзоцитратдегiдрогенази (КФ 1.1.1.42), малік-ензиму (КФ 1.1.1.40),
глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) визначали за швидкiстю вiдновлення
НАДФ+. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7.) визначали за утворенням
вiльних SH-груп при використаннi дитiонiтробензоату (ДТНБ) при 412 нм.
Активнiсть фумаратгiдратази (КФ 4.2.1.2) визначали по накопиченню
фумарової кислоти при 250 нм. Активність сукцинатдегідрогенази (КФ
1.3.99.1) визначали за відновленням ферриціаніду калію, вимірюючи
оптичну густину при 420 нм. (-кетоглутаратдегідрогеназу (КФ 1.2.4.2.)
визначали за швидкістю відновлення НАД+. Малатдегідрогеназу (КФ
1.1.1.37) визначали за швидкiстю вiдновлення НАД+ чи окислення НАДН
залежно від напряму реакції. Активність фосфоенолпіруваткарбоксилази (КФ
4.1.1.31) визначали за швидкістю окислення НАДН з використанням
суміжного ферменту – малатдегідрогенази. Активнiсть
аспартатамiнотрансферази (КФ 2.6.1.1) та аланiнамiнотрансферази (КФ
2.6.1.2) визначали колориметричним динiтрофенiлгiдразиновим методом
(Прохорова, 1982).

Спектрофотометричні вимiрювання проводили на “Specord uv vis”
(Німеччина) при 30 оС. Активнiсть ферментiв виражали в нмоль
перетвореного субстрату за 1 хвилину на 1 мг бiлка.

Визначення швидкості дихання та окислення субстратів. Швидкість
ендогенного дихання та окислення субстратів визначали за швидкістю
поглинання кисню полярографічним методом з використанням закритого
електроду типу Кларка (Красильников, 1973).

Інфрачервона спектроскопія мембранних препаратів. Метод інфрачервоної
спектроскопії мембран використовували для визначення співвідношення
ліпід/білок. Вимірювання проводили на ІЧ спектрофотометрі Impact 400
(США), в діапазоні 1400 – 1800 см-1 і 2100 – 3100 см-1. Віднесення смуг
проводили за Беламі (1963).

Білок визначали за методом Lowry (1951).

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів 3 – 6
експериментів проводили із застосуванням t-критерію Стьюдента для малих
вибірок на 5% рівні значимості (Лакін, 1990).

Розділ 5. Катаболізм глюкози у чутливого та стійких до антибіотиків
штамів гонокока

Відомо, що кінцевим продуктом аеробного катаболізму глюкози у гонококів
є ацетат, а в анаеробних умовах – ацетат і лактат. Для досліджуваних
штамів швидкість накопичення ацетату в аеробних умовах складала 0,32 –
0,43 мкмоль за 1 год на 1 мг білка, в анаеробних – 0,38 – 0,54 мкмоль за
1 год на 1 мг білка. Швидкість накопичення лактату складала 0,10 – 0,14
мкмоль за 1 год на 1 мг білка (табл. 2). Множинностійкі штами E та D
характеризувались підвищенням швидкості накопичення ацетату на 28,1 –
34,3 % в аеробних та на 39,5 – 42,1 % в анаеробних умовах і лактату на
30,0 – 40,0 % – в анаеробних в порівнянні з чутливим штамом B.

Для з’ясування ролі гліколізу в загальній схемі катаболізму глюкози нами
було досліджено вплив фториду натрію (NaF) в концентрації 10-3 М на
накопичення ацетату і лактату. Присутність NaF пригнічувала накопичення
ацетату в аеробних умовах на 8,3 – 20,9 %, а в анаеробних – на 10,6 –
24,1 % (табл. 2). Накопичення лактату в анаеробних умовах пригнічувалась
на 9,0 – 19,3%. Однак достовірним можна вважати пригнічення накопичення
ацетату та лактату NaF лише для штамів D і Е.

Таблиця 2

Вплив NaF на накопичення кінцевих продуктів катаболізму глюкози цілими
клітинами гонококів за аеробних та анаеробних умов інкубації (M±m)

Штами Neisseria gonorrhoeae

B A C D E

Кількість ацетату, мкмоль за 1 год

на 1 мг білка Аеробні умови NaF 0,29(0,01

0,31(0,02

р( 0,05 0,33(0,01

р( 0,05 0,34(0,02

рJ i i ? H L N t ? o Ff ?????? ????l???? ,1(1,9 26,5(1,7 р( 0,05 24,7(2,1 р( 0,05 19,3(1,8 р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020