.

Дослідження механізмів загибелі неонатальних кардіоміоцитів щура в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації: роль протеасомного протеолізу (авто

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
128 2945
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Нагібін Василь Сергійович

УДК 616.1 : 612.223 + 576.385 + 575.113.2 + 577.152.1

Дослідження механізмів загибелі неонатальних кардіоміоцитів щура в
культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації:

роль протеасомного протеолізу

Спеціальність 14.03.04. – Патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної та молекулярної патофізіології
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця Національної Академії наук
України (м. Київ)

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор, академік НАН України

Мойбенко Олексій Олексійович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу загальної та молекулярної патофізіології;

Офіційні опоненти: доктор медичних наук

Маньковська Ірина Микитівна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу з вивчення гіпоксичних станів;

доктор медичних наук, професор

Братусь Віктор Васильович,

Національний науковий центр “Інститут кардіології ім. академіка М.Д.
Стражеско” АМН України,

головний науковий співробітник лабораторії експериментальної
кардіології.

Захист відбудеться 30.10.2007 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,
4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано 27.09.2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Однією з основних причин смертності у світі на
сьогодняшній день є різні форми ішемічної хвороби серця [Доповідь ВООЗ,
2003]. Головною ланкою патогенезу цього захворювання є тимчасове
припинення кровопостачання ділянки серця (ішемія міокарду) з можливим
подальшим його відновленням (реперфузія). При цьому відбувається
загибель кардіоміоцитів, що може реалізуватися кількома шляхами:
незапрограмованим (некроз) та запрограмованим (апоптоз, аутофагічна
клітинна смерть). Поряд з некротичною загибеллю клітин під час
ішемії-реперфузії досить вивченими на сьогодні є також ряд механізмів
реалізації саме запрограмованих шляхів клітинної смерті у
кардіоміоцитах. Більш широко описана апоптотична клітинна смерть,
пов?язана, зокрема, з ушкодженням мітохондрій і відкриттям так званої
мітохондріальної пори, що є особливо важливим при ішемічній хворобі
серця [Zimmermann K.C., 2001, Scarabelli T.M., 2003, Сагач, В.Ф., 2005].
Цей шлях загибелі кардіоміоцитів спостерігається переважно в
периішемічній ділянці та за умов хронічної ішемії. Іншим шляхом
програмованої загибелі клітин є аутофагічна клітинна смерть (АКС), що
хоча й вивчена досить детально, описана переважно в патогенезі
нейродегенеративних захворювань, і практично не досліджувалася при
патології серцево-судинної системи. Окремі роботи вказують на те, що
аутофагічна деструкція клітин серця може розглядатися як один із
важливих механізмів загибелі кардіоміоцитів при ремоделюванні міокарда
під час гіпертрофії, при кардіоміопатіях та за умов дії кардіотоксичних
антибіотиків [Семенов Д.Е., 2001, Shimomura H., 2001, Hein S., 2002,
Kostin S., 2003, Aki T, 2003]. Що ж стосується значення АКС у патогенезі
ішемічної хвороби серця, то прямі дані стосовно цього в літературі
відсутні.

Розповсюдженість програмованих варіантів клітинної загибелі при
ішемії-реперфузії міокарду, їх принципова оборотність та певний час, що
необхідний для їх реалізації, дозволяє впливати на розвиток цих шляхів
при ішемічній хворобі серця з терапевтичною та профілактичною метою.
Одним з варіантів попередження загибелі кардіоміоцитів при
ішемії-реперфузії є явища ендогенної кардіопротекції [Murry C.E., 1986,
Schott R.J., 1990, HYPERLINK
“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itoo
l=pubmed_Abstract&term=%22Vinten%2DJohansen+J%22%5BAuthor%5D”
Vinten-Johansen J ., 2005]. Розкриття механізмів їх реалізації та
регуляції створює широкі можливості для розроблення методів профілактики
та лікування ішемічної хвороби серця.

Важливе значення в регуляції життєдіяльності клітин в нормі та патології
має внутрішньоклітинний убіквітин-залежний протеасомний протеоліз [Xie
Y., 2000, Гольдберг А., 2001, Jesenberger V., 2002]. Роль протеасомного
протеолізу в патогенезі серцево-судинних захворювань активно вивчається
останніми роками ( Herrmann J., 2004, Kukan M., 2004, Goldberg А.L.,
2005(. Проте дані, щодо активності протеасоми під час
аноксії-реоксигенації стосуються лише тканин, а не ізольованих клітин
[Bulteau A.-L., 2001]. Дуже суперечливі дані існують в літературі з
приводу впливу інгібіторів протеасомного протеолізу на виживання різних
типів клітин. Роль протеасоми в реалізації феноменів ендогенної
кардіопротекції виявилася абсолютно невивченою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках наукової тематики відділу загальної та молекулярної
патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України:
“Дослідження ролі нових ендогенних біорегуляторів в розвитку
патологічних процесів в серцево-судинній системі; розробка та
впровадження нових методів лікування гострого інфаркту міокарда” (№
держреєстрації 0199U004033), “Дослідження механізмів розвитку та
попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при
ішемічно-реперфузійному синдромі; розробка методів їх корекції” (№
держреєстрації 0102U000827), “Дослідження ендогенних механізмів
кардіопротекції при захворюваннях серця” (№ держреєстрації 0105U003233).

Мета дослідження: Дослідження механізмів загибелі ізольованих
кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації, вивчення процесів,
що лежать в основі розвитку феноменів ендогенної кардіопротекції, та
визначення участі протеасомного протеолізу в цих явищах.

Завдання дослідження:

1.Дослідити співвідношення живих та загиблих різними шляхами клітин в
первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура в
контролі та за умов аноксії-реоксигенації;

2.Визначення активності протеасоми в первинній культурі ізольованих
неонатальних кардіоміоцитів щура в контролі та за умов
аноксії-реоксигенації;

3.Вивчити дозозалежний вплив інгібіторів протеасомного протеолізу на
співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів у
культурі;

4.Дослідити ефективність відтворення ішемічного прекондиціонування та
розробити методику відтворення посткондиціонування на первинній культурі
ізольованих неонатальних кардіоміоцитів;

5.Визначити вплив інгібіторів протеасомного протеолізу на реалізацію
явищ ендогенної кардіопротекції в первинній культурі ізольованих
неонатальних кардіоміоцитів;

6.Дослідити здатність біофлавоноїда кверцетина та його водорозчинної
форми – лікарського препарату „Корвітин” – пригнічувати протеасомну
активність in vitro та у культурі кардіоміоцитів;

7.Дослідити вплив біофлавоноїда кверцетина та його водорозчинної форми –
лікарського препарату „Корвітин” – на співвідношення живих та загиблих
різними шляхами кардіоміоцитів, а також на відтворення явищ ендогенної
кардіопротекції у первинній культурі ізольованих неонатальних
кардіоміоцитів щура.

Об’єкт дослідження – процес запрограмованої та незапрограмованої
загибелі кардіоміоцитів у первинній культурі ізольованих неонатальних
кардіоміоцитів щура при відтворенні аноксії-реоксигенації та його
регуляція, а також механізми реалізації явищ ендогенної кардіопротекції.

Предмет дослідження – участь внутрішньоклітинного, убіквітин-залежного,
протеасомного протеолізу в регуляції та реалізації механізмів клітинної
смерті кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації та його роль
у розвитку явищ ендогенної кардіопротекції.

Методи дослідження: виділення та культивування кардіоміоцитів 2-3-денних
щурів; визначення живих клітин, клітин, що загинули шляхом некрозу та
апоптозу цитологічним методом за допомогою флюорисцентних ядерних
барвників „Hoechst” (біз-бензимід) і пропідіум іодид, а також клітин, що
загинули шляхом АКС за допомогою флюорисцентного барвника
монодансилкадаверин; визначення живих та загиблих різними шляхами
кардіоміоцитів за допомогою електронно-мікроскопічних досліджень;
визначення активності протеасомного протеолізу в культурі за допомогою
спектрофлюориметричного методу з використанням специфічних флюорогенних
субстратів протеасоми; методика моделювання аноксії-реоксигенації на
культурі кардіоміоцитів і відтворення явищ прекондиціонування та
посткондиціонування на цій культурі.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених
експериментів отримані дані, що дозволяють певною мірою пояснити участь
протеасоми в реалізації програм клітинної смерті та явищ ендогенної
кардіопротекції. Нами вперше визначено всі три види протеолітичної
активності протеасоми (трипсиноподібна, хімотрипсиноподібна та
пептидилглутаміл-пептидгідролазна) в первинній культурі ізольованих
неонатальних кардіоміоцитів щура і продемонстровані їх зміни за умов
відтворення аноксії та реоксигенації. Нами вперше виявлений дозозалежний
ефект протеасомних інгібіторів на виживання та співвідношення різних
варіантів клітинної смерті у первинній культурі ізольованих неонатальних
кардіоміоцитів щура. Також нами вперше отримано дані, щодо впливу
інгібіторів протеасомного протеолізу на розвиток явищ ендогенної
кардіопротекції. Отримані нові дані про вплив біофлавоноїду кверцетину
та його водорозчинної форми, лікарського засобу „Корвітин” на активність
протеасоми в культурі кардіоміоцитів та на перебіг явищ ендогенної
кардіопротекції.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у даній роботі дані
обумовлюють можливість використання інгібіторів протеасомного протеолізу
в малих дозах (1.5 – 2.5 мкМ) як засобів для відтворення явищ ендогенної
кардіопротекції, що відкриває перспективи для профілактики ішемічної
хвороби серця. Крім того в ході даної роботи відпрацьована методика
відтворення явища посткондиціонування на культурі ізольованих
неонатальних кардіоміоцитів щура за допомогою коротких періодів
реоксигенації після довгого періоду аноксії. Ця методика дозволить
проводити подальші дослідження цього феномену на культурі клітин і може
отримати застосування у науковій роботі. Нами також отримані дані щодо
нової властивості відомого лікарського препарату „Корвітин”, а саме
встановлена його здатність пригнічувати протеасомний протеоліз. Це
дозволяє використовувати його (або власне біофлавоноїд кверцетин) як
порівняно дешевий та ефективний протеасомний інгібітор з лікувальною та
профілактичною метою.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем виконано пошук літератури за
темою дисертації, отримання та культивування ізольованих неонатальних
кардіоміоцитів щура, відтворення явищ прекондиціонування та
посткондиціонування на цій культурі, дослідження впливу інгібіторів
протеасомного протеолізу, кверцетину і „Корвітину” на кардіоміоцити в
контролі та при моделюванні аноксії-реоксигенації, а також статистична
обробка отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації.

Отримані в дисертаційній роботі дані були апробовані на:

Семінарі cектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця
(2007);

Конгресі товариства патофізіологів України (м. Чернівці, 2004 р.);

Засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця (19 червня 2007 р.);

Піроговській студентській науковій конференції Російського державного
медичного Університету (Москва, 20 березня 2003 р.);

Київській фармакологічній конференції студентів та молодих вчених
Національного медичного Університету ім. О.О. Богомольця (Київ, 12
квітня 2003 р.);

58-ій науково-практичній конференції студентів та молодих вчених
Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця „Актуальні
проблеми сучасної медицини” (Київ, 28-30 жовтня 2003 р.);

Конференції молодих вчених Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН
України “Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (Київ,
17-18 листопада 2003 року);

Workshop in cardiovascular physiology “Signal trunsduction in
cardio-vascular system” (Warsaw, 13-16 травня 2004 р.);

59 Harden конференції європейського товариства молекулярної біології
“The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester,
6-10 Sept., 2004);

Конференції Міжнародного товариства по вивченню серця (Dresden, 2004);

Конференціях Міжнародного товариства по вивченню серця (Tromso, 2005;
Manchester, 2006);

Європейській конференції по вивченню апоптоза “Death next to the sea”
(Chania, 17-20 вересня, 2004)

Європейській конференції по вивченню апоптоза “Survival on the Danube”
(Budapest, 1-4 жовтня, 2005)

Європейській конференції по вивченню апоптоза “Death or Survival: fate
on the Sardinia” (Cagliari, 29 вересня – 2 жовтня, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 21 робота, у тому
числі 11 статей у наукових журналах.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й
узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних
джерел із 224 найменувань. Робота викладена на 123 сторінках, містить 9
таблиць та проілюстрована 20 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експерименти виконано на первинній культурі ізольованих неонатальних
кардіоміоцитів, отриманих із міокарда шлуночків 2-3-денних щурів лінії
Вістар. Газові суміші для моделювання аноксії та реоксигенації
виготовлялися та заправлялися в балони в Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця. Всі реактиви, що використовувалися в процесі виконання
роботи, виготовлені компанією Sigma Aldrich. Вимірювання флюорисценції
проводилося на спектрофлюориметрі НІТАСНІ 4000. Мікроскопічне
дослідження клітин проводилося на флюорисцентному мікроскопі МЛ-2.
Електронно мікроскопічні дослідження проводилися на електронному
мікроскопі Jem – 100 CX (Японія). Руйнування та диспергування клітин
проводилося за допомогою ультразвукового диспергатора УЗД А. Виділення
клітин проводилося за стерільних умов у ламінарній шафі. Культивування
клітин відбувалося у СО2 – інкубаторі УЛІ 2.

Отримання та культивування ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура.
Культура отримувалася за методикою, коротко викладеною у роботі Reinecke
H. et al. (1998) з деякими модифікаціями. Шляхом цервікальної дислокації
щури знерухомлювалися. Після цього через передній поздовжній розріз
виймалося серце. Шлуночки відокремлювалися від передсердь, двічі
відмивалися у стерильному буферному сольовому розчині (рН 7.4) та
механічно подрібнювалися ножицями до отримання шматків тканини розміром
близько 1мм3. Ці шматки міокарду підлягали ферментативному розщепленню у
середовищі виділення, яке на основі зазначеного буферу містило
колагеназу ІІ типу (95 ОД/мл) та панкреатин (0.6 мг/мл). Перетравлення
відбувалося у п?ять циклів по десять хвилин кожний. Після кожного з
циклів шматочкам міокарду давали осісти, а надосадове середовище
зливали, клітини осаджували шляхом центрифугування при 400 g протягом 1
хвилини, після чого відмивали від залишків колагенази, шляхом такого ж
центрифугування у чистому буфері. Отримані клітини додатково очищували
від неміокардіальних елементів, нашаровуючи на заздалегідь підготовлений
градієнтний розчин перкола, який складався з 3 шарів з відносною
густиною 54 %, 45 % та 36 % відповідно. Центрифугування клітин у цьому
градієнті проводили при 900 g, протягом 15 хвилин. При цьому
кардіоміоцити виявлялися між другим і третім шаром. Кардіоміоцити
збирали та, відмивши від перколу шляхом центрифугування у зазначеному
буфері при 400 g протягом однієї хвилини, ресуспендували у живільному
середовищі. Кількість живих та некротичних клітин визначалася за
допомогою методу виключення 0.2 % розчину трипанового синього.

Отримані клітини розміщували на скельця, покриті 2 % розчином желатину
із щільністю 120 000 на 1 см2. Культивування проводилося протягом 1 – 2
діб у живильному середовищі культивування при 37(С у газовому середовищі
– 5% СО2 та 95% атмосферного повітря.

Моделювання аноксії-реоксигенації та явищ прекондиціонування й
посткондиціонування. Аноксія моделювалася шляхом аерації клітин
безкисневою газовою сумішшю, що включала 5% СО2 та 95% Ar протягом 30
хвилин у ексикаторі з щільно притертою кришкою, куди зазначена газова
суміш подавалася через стерилізуючий фільтр та шар стерильної води
налитий на дно ексикатора. Для моделювання реоксигенації після аноксії
проводилася заміна живильного середовища та культивування клітин за
вихідних умов протягом 60 хвилин.

Для моделювання явищ ендогенної кардіопротекції ми також використовували
аноксичну газову суміш та газову суміш, яка відтворювала звичайні умови
(5% СО2 та 95% атмосферного повітря). Явище прекондиціонування
відтворювалося шляхом піддання клітин трьом коротким періодам аноксії,
що були розмежовані трьома періодами реоксигенації відповідної
тривалості. Кожен з цих періодів тривав 3 хвилини.

Явище посткондиціонування відтворювалося на культурі кардіоміоцитів
вперше. За аналогією з методикою відтворення прекондиціонування, ми
проводили короткі періоди реоксигенації після звичайної,
тридцятихвилинної аноксії. Між періодами реоксигенації відбувалися
періоди аноксії відповідної тривалості. Після цих циклів проводилася
звичайна реоксигенація тривалістю 60 хвилин. Для вибору найбільш
ефективної методики та визначення необхідної тривалості періодів
реоксигенації ми проводили досліди, в яких кожен з цих періодів тривав
5, 3 чи 1 хвилину.

Визначення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних клітин.
Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин оцінювали
цитологічно за допомогою забарвлення кардіоміоцитів біс-бензимідом
(Hoeсhst 33342) та пропідіум йодидом в однаковій концентрації 8.75
мкМ/л. Для виявлення аутофагічних вакуолей застосовували специфічний
барвник монодансилкадаверин в концентрації 50 мкМ (прижиттєве
забарвлення клітин). Пофарбовані клітини вивчали за допомогою
флюорисцентного мікроскопу МЛ-2. Для електронно-мікроскопічних
досліджень використовувався рутинний метод заливки тканин в епоксидні
смоли з фіксацією зразків в 2,5% глютаральдегіді на какодилатному буфері
та постфіксацією 1 % осмієвою кислотою. Ультратонкі зрізи
контрастувалися в уранілацетаті та цитраті свинцю. Матеріал вивчався на
електронному мікроскопі Jem – 100 CX (Японія).

Вимірювання протеасомної активності. Для біохімічного дослідження
клітини диспергували за допомогою скребка й руйнували шляхом озвучування
в ультразвуковому диспергаторі УЗДН А з максимальною інтенсивністю
протягом трьох хвилин. Клітини, що лишилися нелізованими, мембрани та
ядра видалялися шляхом центрифугування при 900 g протягом 10 хвилин.
Супернатант інкубувався у буфері з відповідним флюорогенним субстратом
для визначення різних видів протеолітичних активностей протеасоми. Після
цього проводилася реєстрація флюорисценції продуктів гідролізу (довжина
хвилі збудження/емісії – 360/440) на спектрофлюориметрі Hitachi-4000.
Специфичність протеасомного гідролізу підтверджувалася за допомогою
специфічних інгібіторів протеасоми. Відсоток пригнічення активності
гідролизу відповідних субстратів під дією цих інгібіторів трактували як
протеасомну активність.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Співвідношення живих некротичних апоптотичних та аутофагічних
кардіоміоцитів в контрольних умовах. При використанні методу подвійного
фарбування клітин флюорисцентними барвниками „Hoechst” та пропідіум
іодид було встановлено, що співвідношення живих, некротичних (пропідіум
іодид позитивних) та апоптотичних (пропідіум іодид негативних з
фрагментованим ядром) клітин у контролі становить 89.8 % ± 0.90, 3.2 % ±
0.33 та 5.8 % ± 0.73 відповідно (n = 10). При дослідженні культури з
використанням специфічного для аутофагічних вакуолей флюорисцентного
барвника монодансилкадаверину було з?ясовано, що кількість клітин з
ознаками АКС у контролі становить 4.3 % ± 0.23 (n = 10) по відношенню до
загальної кількості клітин (рис. 1).

Співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних
кардіоміоцитів в умовах аноксії-реоксигенації. Після відтворення аноксії
протягом тридцяти хвилин кількість живих клітин зменшувалася до 80 ±
1.31 % (Р 0.05, n=7). Кількість живих
кардіоміоцитів знижувалася до 76.12 ± 1.83 % (PСписок опублікованих праць за темою дисертації Веремеенко К.Н., Досенко В.Е., Нагибин В.С., Кизим А.И., Мойбенко А.А. Протеолитические ферменты и апоптоз // Укр. биохимический журнал.–2003.-Т., №4.-С.20-34. Здобувачем виконано підготування статті до друку. Нагібін В.С., Досенко В.Є., Пивовар С.М., Мойбенко О.О., Ягупольский Л.М. Фторований аналог діазоксиду попереджує апоптоз неонатальних кардіоміоцитів під час аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, № 3.-С.3-9. Здобувачем виконано пошук літератури, отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, визначення живих та загиблих клітин, підготування статті до друку. Тумановська Л.В., Досенко В.Є., Нагібін В.С., Макогон Н.В., Мойбенко О.О. Апоптотична, аутофагічна та онкотична загибель кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, №5.-С.11-18. Здобувачем виконано пошук літератури, отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Нагибін В.С., Тумановська Л.В. Особливості клітинної смерті кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Клінічна та експериментальна патологія.-2004.-Т.ІІІ, №2.-С.30-32. Здобувачем виконано отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture // Фізіологічний журнал.-2005.Т.51.- №3.-С.12-17. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації, визначення живих та загиблих клітин, підготування статті до друку. Мойбенко А.А., Досенко В.E., Нагибин В.С. Ферментативные механизмы апоптоза // Пат. физиология и экспериментальная терапия.-2005.-№3.-С.17-26. Здобувачем виконано підготування статті до друку. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Нагибин В.С., Мойбенко А.А. Влияние N-3-метиладенина на пептидазную и рибонуклеазную активность протеасомы // Укр. биохимический журнал.-2005.-Т.77, №5.-С.52-56. Здобувачем виконано пошук та аналіз літератури та підготування статті до друку. Досенко В.Є., Нагибин В.С., Тумановская Л.В., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние кверцетина на активность 20S, 26S протеасомы и протеасомную активность в изолированных кардиомиоцитах // Биомедицинская химия.- 2006.-Т.52, №2.-С.138-145. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, визначення протеасомної активності. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Proteasomal proteolysis in anoxia-reoxygenation, preconditioning and postconditioning of isolated cardiomyocytes // Pathophysiology.-2006.-Vol. 13, N2.-P.119-125. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, визначення протеасомної активності, підготування статті. HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&T ermToSearch=16874046&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pub med_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum" Dosenko VE, Nagibin VS, Tumanovska LV, Moibenko AA. Protective effect of autophagy in anoxia-reoxygenation of isolated cardiomyocytes? // Autophagy.-2006.-Vol.2.-Issue.4.-P.305-6. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, підготування статті до друку. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Moibenko A.A. Phosphocreatine (neoton) prevents necrotic and apoptotic death of cardiomyocytes in modelling of anoxia-reoxygenation // J. Mol. Cell. Cardiol.-2004.-Vol.36.-Issue 5.-P.746. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Proteasomal activity in isolated neonatal cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.13. Nagibin V.S. xe "Nagibin, V. S." , Dosenko V.E. xe "Dosenko, V. E." , Tumanovskaya L.V. xe "Tumanovskaya, L. V." , Moibenko xe "Moibenko, O. O." O.O. Apoptotic and autophagic death of cardiomyocytes in anoxia–reoxygenation and at inhibition of proteasome activity // Abstracts of 12th Euroconference on apoptosis, (Chania, 17-20 Sept. 2004).-P.117. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Autophagic cell death of cardiomyocytes in anoxia–reoxygenation is prevented by postconditioning. KATP-channels dependent effect // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.58. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A. Proteasome inhibitors as agents of pharmacological preconditioning // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.161. Dosenko V., Nagibin V., Tumanovskaya L., Yuzkiv M., Moybenko A., Vaage J. Postconditioning in cultured cardiomyocytes: role of proteasomal proteolysis and ATP-sensing K+ channels // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromso, June 21-25, 2005).-Р.1017. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovska L.V., Moybenko A.A., Vaage J. Proteasome inhibitors reproduce preconditioning and postconditioning in cardiomyocyte culture // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 40, Abstracts 26th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Manchester, June 14-17, 2006).-Р.936. Анотації Нагібін В.С. Дослідження механізмів загибелі неонатальних кардіоміоцитів щура в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації: роль протеасомного протеолізу.-Рукопис Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04-патологічна фізіологія. Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2007. Дисертація присвячена вивченню механізмів загибелі кардіоміоцитів в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації та методам попередження цієї загибелі, зокрема явищам ендогенної кардіопротекції. Встановлено, що при відтворенні аноксії-реоксигенації на культурі неонатальних кардіоміоцитів вібувається загибель цих клітин як шляхом некрозу, так і запрограмованими шляхами загибелі клітин: апоптозом та аутофагічною клітинною смертю. Намагання зменшити пошкодження міокарду за рахунок попередження саме запрограмованих варіантів загибелі кардіоміоцитів призводить до значного підвищення некротичних клітин і, вірогідно, не є перспективним напрямком в кардіопротекції. Нами вперше показане зменшення всіх трьох видів протеолітичної активності протеасоми (трипсиноподібна, хімотрипсиноподібна та пептидилглутаміл пептидгідролазна) при аноксії та їх неповне відновлення при реоксигенації. Застосування інгібіторів протеасоми (класто-лактацистін ?-лактон та MG-132) на культурі клітин дозволило встановити, що пригнічення активності цього фермента веде до загибелі клітин переважно шляхом апоптозу та аутофагічної клітинної смерті. Доведена роль протеасоми і в розвитку таких явищ ендогенної кардіопротекції, як пре кондиціонування та пост кондиціонування. Зокрема за допомогою малих доз протеасомних інгібіторів вдалося відтворити позитивні ефекти цих явищ по попередженню апоптозу та некрозу в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації. Крім того нами вперше розроблена методика відтворення явища ішемічного пост кондиціонування на культурі клітин. Досліджено нові властивості такого відомого кардіопротектора, як біофлавоноїд кверцетин та його водорозчинна форма “Корвітин”. Зокрема доведено, що він володіє здатністю пригнічувати активність протеасоми, і поруч із специфічними протеасомними інгібіторами здатен відтворювати явища ендогенної кардіопротекції. Ключові слова: аноксія-реоксигенація, кардіоміоцити, протеасомний протеоліз, ендогенна кардіопротекція, апоптоз, аутофагія. Нагибин В.С. Исследование механизмов гибели неонатальных кардиомиоцитов крысы в культуре при моделировании аноксии-реоксигенации: роль протеасомного протеолиза.-Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины. Киев. 2007. Диссертация посвящена изучению механизмов гибели кардиомиоцитов в культуре при моделировании аноксии-реоксигенации и методам предупреждения этой гибели, вчастности явлениям эндогенной кардиопротекции. Установлено, что при воздействии аноксии-реоксигенации на культуру неонатальны кардиомиоцитов крысы происходит гибель этих клеток как путём некроза, так и запрограммированными путями: апоптозом и аутофагической клеточной смертью. Попытки уменьшить общее повреждение миокарда за счёт предупреждения именно запрограммированных вариантов гибели кардиомиоцитов, однако, приводят к значительному увеличению некротических клеток и, по-видимому, не являются перспективным направлением кардиопротекции. Нами впервые показано снижение всех трёх видов протеолитической активности протеасомы (трипсиноподобная, химотрипсиноподобная и пептидглутамил-пептидгидролазная) при аноксии и их неполное восстановление при реоксигенации. Применение ингибиторов протеасомы (кластолактацистин ?-лактон и MG-132) на культуре клеток позволило установить, что угнетение активности этого фермента ведёт к гибели клеток преимущественно путём апоптоза и аутофагической клеточной смерти. Доказана роль протеасомы и в развитии таких явлений эндогенной кардиопротекции, как прекондиционирование и посткондиционирование. Вчастности при помощи малых доз протеасомных ингибиторов удалось воспроизвести позитивные эффекты этих явлений по предупреждению апоптоза и некроза в культуре при моделировании аноксии-реоксигенации. Кроме того нами впервые разработана методика воспроизведения ишемического посткондиционирования на культуре клеток. Исследованы новые свойства такого известного кардиопротектора, как биофлавоноид кверцетин, и его водорасстворимой формы “Корвитин”. Вчастности показано, что он обладает свойством угнетать активность протеасомы, и наряду с специфическими протеасомными ингибиторами способен воспроизводить явления эндогенной кардиопротекции. Ключевые слова: аноксия-реоксигенация, кардиомиоциты, протеасомный протеолиз, эндогенная кардиопротекция, апоптоз, аутофагия. Nagibin V.S. Mechanisms of rat neonatal cardiomyocytes death in culture at modeling of anoxia-reoxygenation: the role of the proteasomal proteolysis. Thesis for a candidate degree by specialty 14.03.04 – pathophysiology. Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2007. This work is dedicated to the study of rat neonatal cardiomyocytes death in culture at modeling of anoxia-reoxygenation and to the methods of its prevention especially endogenous cardioprotection. It was shown that not only necrotic cell death but also some types of programmed cell death (as apoptosis and autophagic cell death) occur in cardiomyocytes culture at anoxia-reoxygenation modeling. The trying to decrease general myocardium injury by preventing of programmed types of cell death leads to dramatic increase in the number of necrotic cardiomyocytes and is not perspective way in cardioprotection. We first showed that all types of proteolytic activities of proteasome are decreased at anoxia and not completely restored at reoxygenation. The use of proteasomal inhibitors on this culture leads to the development of apoptotic and autophagic cell death programs. The role of the proteasome in the preconditioning and postconditioning development is investigated, and it was shown that small doses of proteasomal inhibitors can reproduce positive effects of these cardioprotective phenomena (decreasing of the number of necrotic and apoptotic but not autophagic cell death). We also have done the method of ischemic postconditioning reproducing in the rat neonatal cardiomyocytes culture. The new properties of well-known cardioprotector biophlavonoid quercetine and its water soluble form “Corvitine” are studied. It was shown that these biophlavonoids can inhibit proteasomal activity and as well as specific inhibitors of proteasome can be used to the pharmacologic reproducing of endogenous cardioprotection phenomena. Keywords: anoxia-reoxygenation, cardiomyocytes, proteasomal proteolysis, endogenous cardioprotection, apoptosis, autophagy. PAGE 23

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020