АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА
КАЛІНІЧЕНКО СВІТЛАНА ВІКТОРІВНА
УДК 537.868.047:579.871.1(043.3)
Вплив електромагнітних полів на біологічні властивості токсиноутворюючих
коринебактерій
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового
ступеня кандидата медичних наук
Харків – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім.
І.І.Мечникова АМН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Бабич Євген Михайлович,
Інститут мікробіології та імунології
ім. І.І. Мечникова АМН України,
завідувач лабораторії специфічної
профілактики краплинних інфекцій
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Мінухін Валерій Володимирович,
Харківський державний медичний університет
МОЗ України, професор кафедри мікробіології,
вірусології та імунології
доктор біологічних наук, професор
Варбанець Людмила Дмитрівна,
Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України,
завідуюча відділом біохімії мікроорганізмів
Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім Л.В. Громашевського АМН України, м.Київ
Захист дисертації відбудеться “ 22 ” червня 2006 р. о 13.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті
мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м.
Харків, вул. Пушкінська, 14/16).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул.
Пушкінська, 14/16).
Автореферат розісланий “ 17 ” травня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01
к.мед.н., с.н.с.
Бруснік С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Реалізація епідемічного процесу дифтерійної інфекції
на тлі вакцинопрофілактики відбувається переважно у вигляді
бактеріоносійства, рівень якого може суттєво змінюватись (Деміховська
О.В., Чудна Л.М., 1999; Мохорт Г.А., та співав., 2001). Різна
інтенсивність циркуляції штамів пов’язана з періодичними формуваннями
епідемічно значущих, тобто більш вірулентних та пристосованих до
колонізації епітелію популяцій збудника (Онищенко Т.Є., Мірошниченко
В.П., 2002; Мельников В.Г. и соавт., 2004).
Передача патогенів від інфікованих до здорових осіб у значній мірі
обумовлена здатністю бактерій проникати через природні бар’єри та
протидіяти неспецифічним факторам захисту організму людини (Волянський
Ю.Л., Бабич Є.М. і співав., 1999; Young D. et al., 2002; Беляев Н.Е.,
2004).
Ключовим механізмом заселення є адгезія бактерій, у той час як інвазію
мікробів у міжклітинні прошарки обумовлюють, насамперед, гіалуронідаза і
нейрамінідаза, а також антикомплементарні властивості бактерій (Бухарин
О.В., 2000; Klemm P., Schembri M.A., 2000; Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. и
соавт., 2003).
Ступінь активності прояву вказаних ознак обумовлює в значній мірі
епідемічну значущість циркулюючих штамів (Костюкова Н.Н., 2001). У
зв’язку з цим важливо знати, які фактори сприяють формуванню популяцій
збудника дифтерії з різною здатністю бактерій до персистенції.
Найбільш обґрунтованою є точка зору про наявність зв’язку між
популяційними змінами патогенних бактерій, у тому числі і
коринебактерій, та циклічною діяльністю Сонця (Чижевський А.Л., 1931;
Вельховер С.Т., 1937; Чернощеков К.А., Лепехин А.В., 1993). Так, у роки
з мінімальною сонячною активністю, в більшості країн Європи
спостерігалось підвищення питомої ваги штамів токсиноутворюючих
коринебактерій і ріст випадків захворювань на дифтерію. Ця тенденція
відмічена і іншими вченими по відношенню до геомагнітних збурень (Sister
F.D., Senftle F.E., 1961). Послідуючі роботи по вивченню впливу різних
фізичних чинників на біологічні властивості збудників дифтерії показали,
що оптичні (лазерні) та ультрафіолетові промені, зокрема, можуть
викликати активацію гену токсигенності, зниження адгезивних
властивостей, зміну антикомплементарної та антилізоцимної активності у
досліджених бактерій (Мироненко Л.Г., 2001; Бирюкова С.В. и соавт.,
2003; Волянський Ю.Л. та співав., 2004).
Приведені роботи присвячені дослідженням адаптуючих змін лише окремих
ознак патогенів, що сприяють персистенції збудника. Не визначені
особливості дії фізичних факторів на продукцію коринебактеріями
гіалуронідази та нейрамінідази, які забезпечують високі інвазивні
властивості, не розкритими залишаються питання впливу хвильових чинників
на кінетику росту та антикомплементарну активність штамів. Кожна із
перелічених ознак не може охарактеризувати персистуючу здатність
циркулюючих штамів. В роботі вперше за основу взятий комплексний підхід
до вивчення впливу фізичних індукторів на формування епідемічно значущих
варіантів збудника дифтерії. Друга методична особливість роботи полягає
в тому, що для експериментальних досліджень були застосовані
низькоенергетичні фізичні чинники, які за частотним діапазоном та
потужністю потоку близькі окремим складовим природного електромагнітного
фону. До найбільш перспективних з них відносяться міліметрові
випромінювання, мішенню для яких, частіше всього, є клітинні мембрани та
їх окремі ділянки, які знаходяться в природному збудженому стані в
частотному діапазоні 30-300 ГГц (Девятков Н.Д. и соавт., 1968; Frцhlich
H., 1980; Кивва Ф.В., 1999).
Вивчення впливу низькоенергетичних електромагнітних факторів на окремі
біооб’єкти (ентеробактерії, неферментуючі грам-негативні бактерії,
Candida spp., Staphylococcus spp., та ін.) дозволило виявити найбільш
активні індуктори, до яких віднесені міліметрові хвилі в частотних
діапазонах 40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц та 64,5 ГГц.
Вони з успіхом застосовуються для прискорення накопичення маси
біотехнологічно значимих мікроорганізмів, стимулювання продукції
клітинами корисних сполук, стимуляції транспорту іонів тощо (Гемба В.Н.,
1991; Baranski S., Czerski P., 1996; Чалий О.В., 2001; Byrd E.A., 2002;
Тамбиев А.Х. и соавт., 2003; Майбородин А.В. и соавт., 2004; Самуилов
В.Д., 2005).
Приведені результати послужили орієнтиром при виборі фізичних чинників
для опромінення токсиноутворюючих коринебактерій. На сьогоднішній день
питання про вплив їх на біологічні властивості даних патогенів
залишаються не повністю з’ясованими. Обраний напрямок досліджень може
стати перспективним не тільки для з’ясування в експериментах окремих
особливостей формування епідемічно значущих популяцій збудника дифтерії,
але й для розробки технологій одержання штамів коринебактерій із
заданими біологічними властивостями.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
фрагментом планової науково-дослідної роботи ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН
України „Вплив електромагнітних полів в широкому діапазоні частот на
біологічні властивості збудників дифтерії та кашлюку” № держреєстрації
0103U001403. Дисертант є співвиконавцем вказаної наукової роботи.
Мета й завдання дослідження. Мета роботи – вивчити ефективність
застосування низькоенергетичних міліметрових хвиль як індукторів
цілеспрямованих змін біологічних властивостей токсиноутворюючих
коринебактерій.
Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:
Вивчити вплив надзвичайновисокочастотного (НЗВЧ) опромінення на кінетику
росту та процеси токсиноутворення у патогенних коринебактерій.
З’ясувати характер змін інвазивних властивостей коринебактерій після
впливу на них НЗВЧ-опромінення.
Дослідити вплив НЗВЧ-опромінення на адгезивні властивості
токсиноутворюючих коринебактерій.
Вивчити вплив НЗВЧ-опромінення на антикомплементарні властивості
патогенних коринебактерій
Провести дослідження репаративних процесів у коринебактерій при
застосуванні міліметрових хвиль різного частотного діапазону.
Об’єкт дослідження: токсиноутворюючі коринебактерії, ферменти
коринебактерій, фізичні чинники впливу.
Предмет дослідження: біологічні властивості коринебактерій (кінетика
росту, ферментативна активність, токсиноутворення, адгезивна активність
мікроорганізмів, фактори інвазії, захисні процеси).
Методи дослідження: мікробіологічні, фізичні, біохімічні,
математико-статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначені особливості
впливу міліметрових хвиль різних частотних діапазонів (40,0 ГГц; 42,2
ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц та 64,5 ГГц) на кінетику росту
токсиноутворюючих коринебактерій, динаміку підвищення та зниження
адгезивних властивостей опромінених тест-культур у порівнянні з
неопроміненими, формування штамів з різними інвазивними властивостями за
гіалуронідазною, нейрамінідазною активностями та антикомплементарною
здатністю.
Встановлено, що зазначені фізичні чинники викликають адаптивні зміни
захисних реакцій у біооб’єктів та стимулюють процеси по відновленню
втрачених властивостей у патогенних коринебактерій, як то розщеплення
глюкози, крохмалю, наявність каталазної активності.
Практичне значення одержаних результатів. Встановлення стимулюючого
впливу міліметрових хвиль на кінетику росту коринебактерій має практичне
значення щодо розробки фізичних технологій в разі необхідності
накопичення мікробної маси та одержання окремих продуктів метаболізму.
Отримані експериментальні дані, щодо стимулювання міліметровими хвилями
захисних систем коринебактерій та процесів відновлення втрачених
біологічних властивостей, відкривають перспективу застосування
міліметрових хвиль в частотному діапазоні 61,0 ГГц для забезпечення
стабільності біологічних властивостей штамів-продуцентів.
На основі вивчення впливу міліметрових хвиль на адгезивні процеси автор
розробив спосіб модуляції адгезивних властивостей мікроорганізмів та
отримав позитивне рішення про видачу патенту України на винахід (№ а
2005 07329, від 22.07.05 р.).
Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно-інформаційний
пошук й аналіз літератури за темою дисертації. Особисто виконано
практичну та експериментальну частини роботи: зокрема вивчення
біологічних властивостей токсиноутворюючих коринебактерій; дослідження
впливу різних діапазонів міліметрових хвиль на кінетику росту,
токсиноутворення, адгезивну активність, патогенні властивості,
проведення статистичної обробки результатів досліджень та оформлення
дисертації. Розділи роботи, які пов’язані з вивченням впливу фізичних
факторів на збудників дифтерії, виконані здобувачем на базах Інституту
радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, біохімічні –
біохімічної лабораторії Державного наукового-експертного фармакопейного
центру, бактеріологічної і санітарно-гігієнічної лабораторій СЕС
Орджонікідзевського району м. Харкова. Постановка мети, завдань та
обговорення одержаних результатів проводилась спільно з науковим
керівником та співробітниками Інституту радіофізики та електроніки ім.
О.Я. Усикова НАН України.
Автор висловлює щиру подяку лікарям-бактеріологам СЕС
Орджонікідзевського, Червонозаводського, Комінтернівського, Жовтневого
районів м. Харкова та міської СЕС за допомогу в наданні клінічного
матеріалу для досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації
доповідались та обговорювались на Міжнародній науковій конференції
“Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (м. Харків,
23-24 жовтня 2003 р.); 6-ій підсумковій регіональній конференції,
присвяченій 80-річчю санепідемслужби України (м. Харків, 19-20 грудня
2003 р.); Міжвузівській конференції молодих вчених “Медицина третього
тисячоліття” (м. Харків, 20 січня 2004 р.); X з’їзді Товариства
мікробіологів України (м. Одеса, 15-17 вересня 2004 р.); ХІV з’їзді
мікробіологів, епідеміологів та паразитологів України (м. Полтава, 2004
р.); 7-ій підсумковій регіональній конференції, присвяченій 200-річчю
Харківської вищої медицинської школи (м. Харків, 20-21 грудня 2004 р.);
2-му Міжнародному радіоелектронному форумі “Прикладная радиоэлектроника.
Состояние и перспективы развития” (м. Харків, 19-23 вересня 2005 р.);
Міжнародній науковій конференції “Актуальные вопросы борьбы с
инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине” (Харків,
28-30 листопада 2005 р.).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць, у тому
числі 6 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, із них 4
самостійно.
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 166 сторінках
машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень,
аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків. Робота
ілюстрована 37 таблицями та 17 рисунками. Список використаних джерел,
який викладено на 27 сторінках, містить 255 посилань, серед яких
українською та російською мовами 155 та 100 робіт іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
Огляд літератури включає 3 підрозділи, в яких розглянуто характеристику
патогенних представників роду Corynebacterium, як чинників різних
захворювань, та умови їх персистенції в організмі людини; проаналізовано
дані щодо впливу електромагнітних полів на біооб’єкти, в тому числі і на
мікроорганізми, охарактеризовано можливі механізми біологічної дії
низькоенергетичних електромагнітних полів.
Матеріали і методи досліджень. Взято в досліди 98 циркулюючих та 14
музейних штамів токсиноутворюючих коринебактерій, одержаних із
бактеріологічних лабораторій СЕС м. Харкова.
Джерелами мікрохвильового випромінювання служили стандартні
високочастотні генератори Г4-141 і Г4-142 з діапазоном частот для
Г4-141: f1=37,5-53,57 ГГц; для Г4-142: f2=53,57-78,33 ГГц та середньою
щільністю потоку потужності енергії – 0,1 мВт/см2. У якості фактору
ушкодження мікробних клітин використовували ртутно-кварцеву лампу ПРК-4,
яка забезпечує діапазон ультрафіолетового опромінення (УФО, л=240-578
нм). Усі використані в дослідах прилади фізичних індукторів були надані
Інститутом радіофізики і електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України згідно
з “Договором о научно-техническом сотрудничестве между Институтом
радиофизики и электроники им. А.Я. Усикова НАН Украины и Институтом
микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины” від 31
жовтня 2003 р. (атестат акредитації № 100-1573/2004, дійсний до
25.11.2007 р., виданий Державним комітетом України з питань технічного
регулювання та споживчої політики).
Опромінення проводили за наведеною нижче методикою: скляні пробірки, що
містили мікробну суспензію у фізіологічному розчині (рН=7,2), при
кімнатній температурі, без перемішування, розташовували на невеликій
відстані від розкриву рупорної антени. Умови проведення досліджень
змінювали за діапазоном та тривалістю опромінення.
В експериментах проведено вивчення впливу НЗВЧ-опромінення (міліметрові
хвилі) певних діапазонів частот (40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц;
61,0 ГГц та 64,5 ГГц) на кінетику росту коринебактерій – 60 штамів, на
швидкість розщеплення глюкози – 30 штамів, на активність окремих
ферментів енергетичного обміну (НАД-залежної дегідрогенази і
цитратсинтетази) – 20 штамів, інвазивні та патогенні властивості
коринебактерій (токсиноутворення, адгезивні процеси, антикомплементарна
активність, активність гіалуронідази, нейрамінідази й уреази) – 101
штам, а у 14 штамів проведено вивчення протекторної дії міліметрових
хвиль. Синхронізацію культур проводили за допомогою дії низької
температури (Баснакьян И.А., 1992).
Виділення мікробів проводили у відповідності з Наказом №192 від
03.08.1999 р. МОЗ України. Ідентифікацію коринебактерій здійснювали за
допомогою мікротест-систем ММТ D (PLIVA-Lachema а.s., Чехія).
Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією
мікробних клітин проводили за допомогою електронного приладу
Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema а.s., Чехія) по шкалі McFarland згідно з
інструкцією до приладу. Кінетику росту вивчали за приростом біомаси за
визначену кількість часу (S. John Pirt, 1975).
Для визначення впливу міліметрових хвиль на кінетику росту
коринебактерій проводили опромінення тест-культур засіяних у бульйонний
субстрат, тест-культур у фізіологічному розчині та незасіяного
бульйонного субстрату. Після впливу фізичних чинників опромінені
тест-культури засівали в неопромінений бульйон, а в зразки опроміненого
рідкого живильного середовища вносили неопромінені культури
мікроорганізмів. Контролями служили не оброблені фізичними індукторами
тест-культури, засіяні в неопромінений бульйонний субстрат. Усі види
експериментальних зразків, разом з контрольними, вирощували при 37 0С.
Концентрацію мікробних клітин визначали через 4, 8 та 18 годин
культивування.
Швидкість розщеплення глюкози вивчали за часом зміни забарвлення
субстрату з індикатором (Герхардт Ф., 1984). Продукцію екзотоксину
визначали за допомогою методу дискодифузії у агаровому гелі, згідно з
“Методическими рекомендациями по применению модифицированной среды Пизу
и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического
типирования и определения токсигенности дифтерийных бактерий” (Ю.Г.
Фельдман та ін., 1988).
Адгезивні властивості токсиноутворюючих коринебактерій вивчали за
методикою Брилиса В.И. та ін. (1986).
Активність уреази визначали за швидкістю розщеплення відповідного
субстрату за стандартною методикою (Герхардт Ф., 1984). Гіалуронідазну
активність виявляли за схемою McClean у модифікації Кур’яти Н.В. (2005),
в якості субстрату використовували комерційний препарат гіалуронової
кислоти (OXOID Ld, England). Вивчення нейрамінідазної активності
здійснювали із використанням комерційних тест-систем NEIRAMINOtest (API
bioMerieux, France). При визначені ступеню активності даного ензиму
користувалися шкалою, згідно якої активність ферменту оцінювалась як
низька за показниками в межах 0–2,0 ммоль/мл, середня – 2,1-8,9
ммоль/мл, висока – 9,0-16,0 ммоль/мл, дуже висока – 16,1 ммоль/мл і вище
(Вишнякова Л.А., Резцова Ю.В., 1990).
Антикомплементарну активність (АКА) штамів коринебактерій визначали за
допомогою фотометричного методу (Брудастов Ю.А., 1992; Лабинская, 2004).
Вивчення ферментів, асоційованих з циклом трикарбонових кислот,
здійснювали у безклітинному гомогенаті стандартними методиками (Atkinson
D.E., 1977; Muller-Kraft G., Babel W., 1983).
Визначення кількості життєздатних мікроорганізмів проводили шляхом
підрахунку колонієутворюючих одиниць (КУО) у відповідній кількості
посівного матеріалу (Турьянова М.Х., Каппа М., 1995).
Досліди проводили в трьох – чотирьох повтореннях. Результати аналізували
статистично (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Гельман В.Я., 2002) за
допомогою комп’ютерних програм Microsoft Excel 2000 та “Biostat-4”
(Лапач С.Н. та співавт., 2000).
Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень
викладено в третьому-шостому розділах.
Виходячи з даних літератури відносно того, що міліметрові хвилі
частотних діапазонів 40,0 ГГц; 42,2 ГГц; 50,3 ГГц; 58,0 ГГц; 61,0 ГГц і
64,5 ГГц припустимо орієнтовані на активацію енергії збудження атомів та
є найбільш активними індукторами, які застосовуються в біотехнологічних
процесах, у роботі проведено, в першу чергу, вивчення впливу цих
фізичних чинників на біологічні властивості токсиноутворюючих
коринебактерій (кінетику росту, розщеплення глюкози, активність
ферментів, адгезивні властивості, фактори патогенності і інвазії та
процеси відновлення захисних систем після застосування ушкоджуючого
впливу).
Встановлено, що зміни біологічних властивостей токсиноутворюючих
коринебактерій відбувались при впливі фізичних чинників на біооб’єкти
впродовж 8-ми годин.
Дослідження показали, що на кінетику росту впливали міліметрові хвилі
двох із шести досліджених частотних діапазонів – 42,2 ГГц та 61,0 ГГц.
Причому зміни інтенсивності росту патогенних коринебактерій відбувались
тільки в перші 8 годин їх вирощування. Через 18 годин культивування
біооб’єктів показники концентрації мікробних клітин (конц. мк. кл.) в
усіх досліджених зразках статистично не відрізнялись (табл. 1).
Застосування міліметрових хвиль у частотному діапазоні 61,0 ГГц
приводило до стимулювання ростових процесів. Темпи приросту біомаси були
найбільш високими в перші 4 години. Показники концентрації мікробних
клітин в усіх дослідних зразках перевищували в 2,0-2,2 рази відповідні
характеристики контрольних проб (р
Таблиця 1
Вплив міліметрових хвиль у частотних діапазонах 42,2 ГГц і 61,0 ГГц на
кінетику росту токсиноутворюючих коринебактерій
Час
вирощування Середні показники (M±m)
конц. мк. кл. неопромінених бактерій в бульйоні (контроль) Середні
показники (M±m) конц. мк. кл. бульйонної культури після опромінення:
тест-культури
в діапазоні бульйону
в діапазоні тест-культури і бульйону
в діапазоні
42,2 ГГц 61,0 ГГц 42,2 ГГц 61,0 ГГц 42,2 ГГц 61,0 ГГц
4 години
0,053 ± 0,003 0,033 ± 0,004** 0,11 ± 0,006** 0,029 ± 0,003** 0,12 ±
0,007** 0,027 ± 0,002** 0,12 ± 0,007**
8
годин
0,105 ± 0,003 0,084 ± 0,003* 0,123 ± 0,004* 0,076 ± 0,004* 0,136 ±
0,007* 0,075 ± 0,003* 0,121 ± 0,007*
18 годин
0,307 ± 0,016 0,308 ± 0,005 0,314 ± 0,02 0,297 ± 0,015 0,320 ± 0,014
0,311 ± 0,008 0,321 ± 0,012
Примітки:
* - різниця достовірна, рl‚
¦
ae
"
$
?
O
6p?u>
?
‚
ae
„O
^„O
„1/4
„^„1/4
„E
„^„E
??????????
?98 – 89,0±1,11)% проти (68,8±0,88 – 78,2±0,87)% (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
