Міністерство охорони здоров’я України
Луганський державний медичний університет
Косенко Юрій Валерійович
УДК 616-002.3-097:579:6/2.1
Патогенетичні механізми взаємодії ліпополісахаридів бактерій з
моноцитами і лімфоцитами крові людини in vitro
14.03.04 – патологічна фізіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Луганськ-2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ
України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Флегонтова Вероніка
Валентинівна, Луганський державний медичний університет МОЗ України,
професор кафедр патофізіології та мікробіології
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський
державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри клінічної
імунології, алергології та ендокринології
доктор медичних наук, професор Файфура Василь Васильович, Тернопільський
державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України,
професор кафедри патологічної фізіології
Провідна установа: Кафедра загальної та клінічної патологічної
фізіології ім. В.В. Підвисоцького, Одеський державний медичний
університет МОЗ України, м. Одеса
Захист відбудеться “03” листопада 2006 р. об 11.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 29.600.02 при Луганському державному
медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного
медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони
Луганська, 1)
Автореферат розісланий “02” жовтня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько
В.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В другій половині ХХ сторіччя декілька разів
відбувалася зміна видового складу мікрофлори, яка викликає
гнійно-запальні захворювання (Бєлобородов В.Б., 2001). У 1940-50-х рр. з
гнійних осередків виділяли переважно грампозитивні коки і кишкову
паличку; з 1980-90-х рр. головне значення набули умовно-патогенні
грамнегативні бактерії та неспорові анаероби (Гайдаш І.С. і ін., 2000;
Martin C., 1997; Sugawara S. et al., 2000). Ці етіологічні агенти,
виділені з осередків, як правило, асоціюють з аеробними та анаеробними
споровими бактеріями.
У формуванні захисних, компенсаторних і адаптаційних реакцій організму
істотна роль належить системі мононуклеарних фагоцитів (Хаитов Р.М.,
Пинегин Б.В., 1995; Мазуров Д.В. та ін., 2001). У зв’язку з цим
зрозумілий закономірний інтерес дослідників до вивчення фагоцитарної
активності моноцитів периферійної крові при різних патологічних процесах
бактеріальної етіології (Aderem A., 1999). Спочатку імунні порушення
створюють сприятливі умови для адаптації і розмноження бактерій, надалі
ж сприяють поширенню осередків враження і хронічного перебігу процесу
(Хаитов Р.М. і ін., 1998; Карпова М.Р., 1999; Бєлобородова Н.В.,
Бачинская Е.Н., 2000). У фагоцитозі беруть участь, в основному, 2 групи
клітин: гранулоцити і моноцити (макрофаги). Роль макрофагів складається
в розпізнаванні, фагоцитозі, процесінгу і тривалій презентації
детермінант етіологічних агентів інфекційних захворювань (Ярилин А.А.,
1998). Одночасно з антигенною презентацією відбувається синтез
цитокінів, зокрема, інтерлейкіну-1 (ІЛ-1). Цитокіни у високих
концентраціях при виході в кров забезпечують сигнальні функції,
пов’язані з формуванням генералізованої запальної реакції (Cuzzola M. et
al., 2000).
Екологічні катастрофи останніх років призвели до істотного зниження
резистентності організму людей, що, природно, викликало зміну
сформованих мікробіоценозів різних відкритих порожнин організму людини,
у тому числі і ротової порожнині (Кисельова А.Ф. та ін., 1994; Бірюкова
С.В., 1999). На фоні цих процесів генетично детерміновані властивості
патогенності і вірулентності бактерій одержали свій фенотипний розвиток
у напрямку їх посилення. Вірулентні мікроорганізми в ході свого
еволюційного розвитку виробили спеціальну систему пристосувань,
спрямованих на пригнічення фагоцитарної активності організму. Одним із
цих факторів є ліпополісахарид (ЛПС) – структурний компонент клітинної
стінки грамнегативних бактерій (Борисова Е.В., 1999). ЛПС виконує дві
важливі функції: визначає антигенну специфічність і є головним фактором
патогенності – це компонент ендотоксину (Васильєв Н.В. та ін., 1984).
Він викликає імунні реакції, у тому числі поліклональну активацію
імунокомпетентних клітин, спроможність стимулювати або пригнічувати
відповідь на антигени, індукувати поліклональну імунну толерантність і
т.п. (Платонов А.Е. і ін., 1999). ЛПС сприяє виділенню моноцитами
цитостатичного фактора білкової природи – фактора некрозу пухлини (ФНП).
Рецептори до ЛПС є на плазматичних мембранах макрофагів, моноцитів,
нейтрофілів і ендотеліоцитів. Ефекти ЛПС характеризуються
дозозалежністю: малі дози стимулюють інтенсивність фагоцитозу, великі –
знижують фагоцитарну активність і діють цитотоксично (Анненков А.Е. та
ін., 1987). ЛПС запускає продукцію ІЛ-1?, -6, -8, -10, ФНП-(,
інтерферону, ейкозаноїдів, фактора активації тромбоцитів та ін.
(Couturier C. et al., 1992; Baqui A.A. et al., 2000). Доведено, що
цитокіни, як основні прозапальні медіатори, індукуються в макроорганізмі
грамнегативними і грампозитивними бактеріями, і визначають “велику”
запальну природу бактеріальних інфекцій. Незважаючи на тотожність
структури, ЛПС різних видів бактерій відрізняються за хімічним складом і
біологічними властивостями. Розчинний ЛПС облігатно патогенних бактерій,
який не пригнічує гіперчутливість уповільненого типу самостійно,
можливо, здатний наділяти імуносупресивними властивостями живі бактерії
(Борисов В.А., Фролов А.Ф., 1990).
Антигенна стимуляція імунокомпетентних клітин, здійснена при дефіциті
факторів, які забезпечують проліферацію, може призвести до
запрограмованої загибелі активованої імунокомпетентної клітини, одним із
механізмів якої є апоптоз (Самохин А.В. та ін., 1997; Маянский Н.А.,
2001). Апоптоз – це фізіологічна, активна, програмована загибель клітин,
інформація про яку закодована в клітинному геномі і піддається
регуляції. Порушення процесу програмованої клітинної загибелі убік
посилення або ослаблення грає істотну роль у патогенезі
імунопатологічних процесів у людини, у тому числі вторинних
імунодефіцитів, автоімунних й онкологічних захворювань, хронічних
запальних процесів, вірусних та інших інфекцій. У культурах клітин
апоптоз спроможні посилювати або послабляти мікроби та їх структурні
компоненти (Казімірко Н.К. та ін., 2000; Талаев В.Ю. і ін., 2001).
У доступній літературі нами не були знайдені дані про комплексне
вивчення дозозалежного і видоспецифічного впливу ЛПС на секреторну
активність його головних мішеней – моноцитів (продукція ІЛ-1?, -6,
ФНП-?) і Тh1-клітин (продукція ІЛ-2); фагоцитарну активність моноцитів;
впливу ЛПС на апоптоз моноцитів і лімфоцитів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом
наукової роботи кафедри патофізіології Луганського державного медичного
університету № державної реєстрації 0198U005713 “Запалення як наслідок
дії бактерій”.
Мета дослідження: Вивчити роль ЛПС грамнегативних бактерій –
етіологічних агентів хронічного пародонтиту в порушеннях функціональної
активності моноцитів і лімфоцитів периферійної крові людини.
Для досягнення мети поставлені такі окремі задачі:
Дослідити in vitro продукцію моноцитами крові людини ІЛ-1?, -6 і ФНП-(
під впливом ЛПС грамнегативних бактерій.
Вивчити секрецію ІЛ-2 Тh1-клітинами під впливом ЛПС грамнегативних
бактерій.
Визначити фагоцитарну активність моноцитів крові людини під впливом ЛПС
грамнегативних бактерій.
Вивчити вплив ЛПС грамнегативних бактерій на апоптоз моноцитів і
лімфоцитів крові людини.
Визначити кореляційні зв’язки між показниками, які характеризують
секрецію цитокінів моноцитами і лімфоцитами, фагоцитарну активність
моноцитів і експресію молекул CD95 на поверхні моноцитів і лімфоцитів.
Об’єкт дослідження: моноцити та лімфоцити периферійної крові людини.
Предмети дослідження: вплив ЛПС грамнегативних бактерій – етіологічних
агентів хронічного пародонтиту на: секреторну активність моноцитів та
лімфоцитів, фагоцитарну активність моноцитів і експресію молекул
апоптозу на моноцитах і лімфоцитах периферійної крові людини in vitro;
кореляційні зв’язки між показниками, що характеризують секреторну
активність моноцитів і лімфоцитів, фагоцитарну активність моноцитів і
готовність до реалізації апоптозної програми моноцитами і лімфоцитами.
Методи дослідження: бактеріологічні (виділення ЛПС), імунологічні
(виділення моноцитів та лімфоцитів, визначення експресії молекул CD95 на
поверхні клітин), біохімічні (визначення активності ФНП, ІЛ),
експериментальні (визначення фагоцитарної активності моноцитів та
апоптогенної активності ЛПС), статистичні (метод параметричної
кореляції, метод аналізу таблиць спряженості).
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлений дозозалежний
і видоспецифічний вплив ЛПС умовно-патогенних грамнегативних бактерій на
здатність моноцитів і лімфоцитів крові людини продукувати цитокіни, на
фагоцитарну активність і апоптоз моноцитів, апоптоз Т- і В-лімфоцитів.
Показано, що в міру збільшення діючої на моноцити і лімфоцити
концентрації ЛПС відбувається прогресивне збільшення продукції ІЛ-1?,
-2, -6, ФНП-(; посилення апоптозу моноцитів, Т- і В-лімфоцитів,
пригнічення фагоцитозу моноцитів. Більш значно впливали на функціональну
активність моноцитів і лімфоцитів крові людини in vitro ЛПС
факультативно анаеробних бактерій – Escherichia fergusonii, Proteus
vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менш значно –
ЛПС облігатно анаеробних бактерій – B. fragilis, P. melaninogenicus,
Fusobacterium necroforum.
Практична значимість отриманих результатів. Визначено теоретичні підходи
до трактування патогенезу хронічних пародонтитів, викликаних
грамнегативними умовно-патогенними бактеріями, на основі вивчення
біологічної активності їх ЛПС відносно моноцитів і деяких субпопуляцій
лімфоцитів крові людини. Отримані дані використовуються в лекційному
курсі і при проведенні практичних занять на кафедрах патофізіології і
мікробіології Луганського державного медичного університету, що
підтверджено відповідними актами впровадження.
Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, планування
експерименту були здійснені разом з науковим керівником роботи. Автором
самостійно проведений: інформаційний пошук, аналіз літератури, виконана
експериментальна частина роботи, написані всі розділи дисертації та
автореферат.
Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та
обговорені на: Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів,
молодих вчених й інтернів “Нові технології в лікуванні
акушерсько-гінекологічної патології” (Луганськ, 10-11 листопада 2005
р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, молодих
вчених та інтернів “Актуальні проблеми фундаментальної медицини
(англійською мовою)” (Луганськ, 1-2 грудня 2005 р.), а також на
засіданнях Луганських обласних товариств патофізіологів і мікробіологів
у 2003-2005 рр.
Публікації. Результати дисертації опубліковані в 7 наукових працях – 6
статтях та 1 тезах (6 – одноосібні).
Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 126 сторінках
комп’ютерного набору, складається з вступу, огляду літератури, 6
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних
результатів, висновків і списку літератури. Робота ілюстрована 18
таблицями і 1 малюнком. Список літератури включає 145 джерел вітчизняних
та іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Об’єктом дослідження були 120 культур
моноцитів і 110 культур лімфоцитів периферійної крові практично здорових
чоловіків віком від 20 до 24 років. Забір крові в обсязі 20 мл проводили
з ліктьової вени в ранковий час (07.00-08.00) до їжі. Кров вносили в
стерильні скляні пробірки, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували і
для одержання плазми відстоювали протягом 2 годин у термостаті при 37?С.
Отриману плазму крові надалі використовували для виділення моноцитів і
лімфоцитів.
ЛПС одержували з культур умовно-патогенних бактерій родів Escherichia,
Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella,
Fusobacterium, виділених від 120 хворих на хронічні пародонтити, які
звертались по стоматологічну допомогу в приватну стоматологічну клініку
“Посмішка” (м. Луганськ) з 2003 р. по 2005 р. Встановлення родової
приналежності культур і видову ідентифікацію бактерій проводили згідно з
наказом МЗ СРСР № 535 від 22.04.1985 р. Ідентифікацію бактерій проводили
з використанням діагностичних наборів “Ентеротест 24”, “Нефермтест 16”,
“Колітест” та “Анаеротест 23” виробництва АТ “Лахема”, Чехія. Препарати
ЛПС виділяли з клітинної стінки бактерій водно-феноловою екстракцією при
65°С. Використовували наступні робочі концентрації ЛПС (мкг/мл): 10,0;
50,0; 100,0.
Популяції моноцитів і лімфоцитів периферійної крові людини одержували за
допомогою центрифугування на градієнті щільності фікол-верографін.
Визначення фагоцитарної активності моноцитів проводили чашковим методом.
Підраховували фагоцитарний індекс (ФІ) і фагоцитарне число (ФЧ).
Визначення ІЛ-1?, -2, -6 і ФНП-? проводили в супернатантах моноцитів і
лімфоцитів імуноферментним методом.
Вивчення потенційної апоптогенної активності ЛПС умовно-патогенних
бактерій відносно лімфоцитів і моноцитів проводили морфологічним
методом. Для морфологічної оцінки апоптозу завись клітин (моноцитів, Т-
і В-лімфоцитів, Т-хелперів) наносили на предметне скло, підсушували та
фарбували акридином оранжевим. Розчин акридину оранжевого в
дистильованій воді (0,1 % розводили перед використанням у 10 %
фосфатному буфері до рН=6,0-6,5 додаванням 0,1 М розчину NaH2PO4).
Предметне скло покривали барвним розчином на 15 хвилин, далі видаляли
його фільтрувальним папером і промивали свіжою порцією закисленого
фосфатного буфера. Препарати досліджували за допомогою люмінесцентного
мікроскопа із синім світлофільтром. Експресію молекул СD95 на поверхні
моноцитів, Т- і В-лімфоцитів вивчали методом непрямої імунної
флуоресценції з використанням моноклональних антитіл виробництва НВЦ
“Медбіоспектр” (Москва, РФ).
Отримані цифрові результати обробляли статистично на персональному
комп’ютері методами варіаційної статистики. Достатньою вважали ймовірну
помилку менше 5 % (pX
Z
?OX
Z
\
A
o
Z
\
„
+ у концентрації 100 мкг/мл показники ФІ і ФЧ були нижчими норми в 3,8 і
3,9 рази відповідно (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
