.

Адаптивна перебудова кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізми її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції (авторефера

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
116 6251
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ЛІТОВКА ІРИНА ГЕОРГІЇВНА

УДК:612.769+612.014.41

Адаптивна перебудова кісткової тканини при дефіциті навантаження та
механізми її відновлення під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі клінічної патофізіології Інституту

фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: Доктор медичних наук, професор

Березовський Вадим Якимович

зав.відділом клінічної
патофізіології

Інституту фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук

Костюков Олександр Іванович

зав.відділом фізіології рухів

Інституту фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України

Доктор медичних наук, професор

Бруско Антон Тимофійович

зав.відділом патоморфології з

експериментально-біологічним

відділенням (віварієм)
Інституту

травматології та ортопедії АМН
України

Доктор біологічних наук,
професор

Макарчук Микола Юхимович

зав.кафедрою фізіології людини
і тварин

Київського Національного
Університету

імені Тараса Шевченка

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України

Захист дисертації відбудеться “14” листопада 2006 року о “14” годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.198.01 при Інституті
фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.
акад.Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології
ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.
акад.Богомольця,4.

Автореферат розіслано “5” жовтня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук
Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Адаптація організму до умов існування – одна з
фундаментальних рис живих організмів, що відрізняє їх від об’єктів
неживої природи (Меерсон Ф.З., 1981, 1993; Hochachka e.a., 1999).
Будь-які зміни середовища існування викликають перебудову фізіологічних
процесів, що зберігає життєздатність організмів навіть в екстремальних
умовах.

Широко відомі і добре вивчені структуроутворюючі властивості адаптації.
Так, перехід частини хрящових риб з насиченої солями морської води до
прісної води річок стимулював розвиток кісткового скелету. Вихід живих
істот з моря на сушу ініціював розвиток легеневого дихання і кінцівок
опорного типу. Навіть відносно короткочасний відпочинок людини в горах
викликає адаптивну перебудову діяльності кісткового мозку – підвищення
кількості еритроцитів та концентрації гемоглобіну в крові (Сиротинін
М.М., 1958). В усіх цих випадках адаптація виконує нову
структуроутворюючу та активно функціонуючу субстанцію. Такий тип
пристосування в літературі прийнято позначати терміном “продуктивна
адаптація”.

Менш відомі редуктивні можливості адаптації. Вони викликають ефекти,
спрямовані на спрощення або навіть усунення існуючих утворень та їх
фізіологічних функцій. Так, позбавлені світла троглобіонти (печерні
форми життя) втрачають органи зору. Позбавлені змоги літати острівні
птахи зони сильних мусонів втрачають пір’я на крилах. Вторинно морські
ссавці, що повернулися від наземного способу життя до океану – втрачають
опорні кінцівки. Певні види риб в полярних водах повністю втрачають
гемоглобін крові. Це відбувається тому, що при низьких температурах
істотно збільшується розчинність кисню в плазмі крові. Киснева ємність
плазми стає достатньою для забезпечення тканин киснем при повній
відсутності гемоглобіну та червонокрівців. Такі реакції пристосування в
літературі позначають терміном “редуктивна адаптація”. Цей варіант
адаптації чітко визначено у класичному постулаті видатного біолога
минулого – Ернеста Геккеля (Геккель Э., 1909). Він наголошував, що
орган, який не використовується – поступово редукується. Перетворення
життєво важливого для птахів літального грудного червоного м’язу на
білий м’яз наземного птаха – домашньої курки – один з прикладів
редукційних тенденцій адаптації.

Науково-технічна революція останніх століть надала людству можливість
широкого використання енергії органічних сполук та корисних копалин.
Потреба у тяжкій м’язовій праці задля харчування майже зникла. За даними
академіка Берга, протягом останніх ста років доля м’язових зусиль людини
на виробництві скоротилася з 94% до 1%, тобто зменшилася майже у 100
разів (Оганов В.С., 1998). У результаті виникла ситуація, що може
вплинути на майбутнє. Адаптація серцево-судинної та опорно-рухової
системи до нового “цивілізованого” способу життя принесла з собою певні
проблеми. Вони пов’язані з негативними змінами загального стану здоров’я
мешканців промислово-розвинутих країн. Проте, якщо фізіологія
серцево-судинної системи, або фізіологія системи крові завжди були в
центрі уваги дослідників, то кістковою тканиною (КТ) займалися переважно
ортопеди та травматологи, яких цікавила не стільки фізіологія кістки,
скільки позитивний результат нормалізації стану опорно-рухової системи
після травми.

“Кісткова тканина – “terra incognita” для більшості спеціалістів, як
науковців, так і лікарів, що працюють в різних галузях медицини, – писав
видатний фізіолог В.Фролькіс. – Кісткова тканина виявилася
функціонально активною сполучною тканиною, зміни в якій поступово
виникають навіть у здорової людини” (Фролькис В.В., 1998). Активне
довголіття людини неможливе без збереження нормального стану
фізіологічної системи сполучної тканини (Богомолець О.О., 1969).

Численними дослідженнями показано, що недостатнє функціональне
навантаження ініціює процес редуктивної адаптації кісток кінцівок та
хребта (Григорьев А.И. и др., 1994; Оганов В.С., 2003, Моруков Б.В. и
др., 2005), а першим проявом такої адаптації, є зменшення кількості
структуроутворюючих одиниць кісткової тканини – остеонів та розвиток
стану остеопенії (Риггз Б.Л. и др., 2000; Дурнова Г.Н. и др., 2005).
Вікові зміни стану КТ також починаються з розвитку остеопенії.

Яскравим прикладом адаптаційної етиології остеопенії стали наслідки
освоєння людиною космічного простору. Встановлено, що зменшення впливу
сили гравітації на організм космонавта під час перебування на орбіті,
особливо в умовах тривалого польоту, викликає відчутні зміни стану
багатьох структур організму, в тому числі ЦНС, ВНС, серцево-судинної та
опорно-рухової системи. Відсутність навантаження на кістяк ініціює
адаптивну редукцію м’язів та кісток, втрату організмом кальцію,
порушення біомеханічних властивостей, біохімічних показників метаболізму
кісткової тканини, низку супутніх явищ (Газенко О.Г. и др., 1987).

Комплекс цих змін стану КТ дещо подібний до початкових стадій проявів
остеопорозу. В останні десятиріччя ця форма клінічної патології набула
надзвичайного поширення серед населення багатьох цивілізованих
суспільств. За даними медичної статистики, станом на 2004 рік вона
становить близько 10% у структурі загальної захворюваності. Не зважаючи
на значні успіхи у створенні лікарських засобів, остеопороз залишається
основною причиною більшої частини переломів кісток, тимчасової або
постійної втрати працездатності та інвалідизації населення. Якщо у
минулі часи така патологія була типова лише для старших вікових груп
населення, то зараз вона вражає і молодь. Більшість дослідників
пов’язують це з дефіцитом навантаження та малорухомим способом життя
сучасної молоді, що підтверджують наведені нижче власні дослідження
(Поворознюк В.В и др., 2000; Подрушняк Е.П., 1997).

Як земні, так і космічні проблеми збереження здоров’я людини,
потребують ретельних досліджень процесів адаптації КТ до дефіциту
навантажень. Такі відомості можуть допомогти у пошуках і розробці нових
технологій попередження змін фізіологічного стану кісткової тканини,
викликаних малорухомим способом життя людини цивілізованого суспільства.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема
дисертаційної роботи є частиною науково-дослідної роботи “Дослідження
механізмів деструкції кісткової тканини під впливом модельованої
мікрогравітації”, що виконувалася згідно Загальнодержавної
(Національної) космічної програми України (ЗУ від 24.10.2002 р. №203-IV)
цільова програма “І. Наукові космічні дослідження” за напрямком “3.
Космічна біологія, фізика невагомості, технологічні дослідження” (шифр
“Космобіологія”); “Дослідити вплив мікрогравітації на кісткову тканину
та профілактичну дію газових сумішей зі зниженим вмістом кисню на
розвиток остеопенії” (2003-2004 р.р.) проекту NN26 (R) Українського
науково-технічного центру; “Дослідити фізіологічні, біофізичні та
біомеханічні показники стану кісткової тканини в різних статокінетичних
умовах (1998-2000 р.р.), теми №0198001934; “Дослідити механізми
адаптації організму до гіпокінезії та можливі шляхи попередження її
негативних наслідків” (2001-2004 р.р.), № 0101U002635, які входили до
зведеного плану НДР НАН України.

Об’єкт досліджень – сироватка крові, кісткова тканина хребетних.

Предмет досліджень – механізми редуктивної адаптації кісткової тканини в
умовах дефіциту навантаження.

Методи досліджень – фізіологічні, біохімічні, морфологічні,
гістохімічні, імунно-ферментні, електронно-мікроскопічні,
рентгено-структурні та варіаційно-статистичні.

Мета роботи. Метою даної роботи було дослідження адаптивної перебудови
кісткової тканини при дефіциті навантаження та механізмів її відновлення
під впливом дозованої гіпоксичної стимуляції.

Завдання дослідження

Вивчити наслідки обмеження рухливості протягом 28 та 45 діб на
фізіологічні, біохімічні та морфологічні показники стану кісткової
тканини у молодих щурів;

Вивчити наслідки обмеження рухливості протягом 28 та 45 діб на
фізіологічні, біохімічні та морфологічні показники стану кісткової
тканини у дорослих тварин;

Дослідити вплив фенотипових відмінностей спонтанної рухової активності
щурів на показники стану кісткової тканини при дефіциті навантаження;

Вивчити наслідки моделювання впливу мікрогравітації шляхом аксіального
розвантаження задніх кінцівок щурів на фізіологічні та біохімічні
показники стану кісткової тканини;

Вивчити ефективність дії різних режимів дозованої переривчастої
нормобаричної гіпоксії на стан кісткової тканини щурів під час обмеження
рухливості та аксіального розвантаження задніх кінцівок;

Дослідити можливість преадаптації щурів до впливу обмеження рухливості
шляхом періодичного дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним
тиском кисню;

Проаналізувати механізми стимулюючої дії штучної газової суміші зі
зниженим парціальним тиском кисню на стан кісткової тканини після
поєднаного впливу дефіциту навантаження та дозованої нормобаричної
гіпоксії.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше показано, що
обмеження рухливості щурів лінії Вістар в атмосферному повітрі протягом
45 діб знижує масу кісткової тканини та активність біохімічних маркерів
ремоделювання кісткової тканини у молодих тварин у більшій мірі, ніж у
дорослих. Доведено, що аксіальне розвантаження задніх кінцівок щурів в
атмосферному повітрі пригнічує біохімічні показники метаболізму
кісткової тканини, аналогічно тому, що спостерігається в умовах
гіпокінезії та реальної мікрогравітації. Вперше встановлено, що у
молодих тварин з обмеженням рухливості періодичне дихання газовою
сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню (Ро2 = 91±8 мм рт.ст)
зменшує втрати кісткової маси та пригнічення метаболізму кісткової
тканини, викликаних дефіцитом навантаження. Показано, що у дорослих
щурів з обмеженням рухливості протягом 45 діб періодичне дихання
газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском кисню (Ро2 = 91±8 мм
рт.ст) викликає менш виразні зміни, ніж у молодих тварин. У роботі
вперше встановлено, що в субпопуляції молодих щурів з високою
фенотиповою спонтанною руховою активністю в умовах періодичного дихання
гіпоксичною газовою сумішшю 45-добове обмеження рухливості викликає
більш виразні зміни стану кісткової тканини, порівняно із тваринами з
низькою спонтанною руховою активністю. Стимулюючий вплив гіпоксичної
газової суміші виявився більш ефективним у тварин з високою спонтанною
руховою активністю. Показано, що преадаптація дорослих тварин шляхом
періодичного дихання газовою сумішшю зі зниженим парціальним тиском
кисню протягом двох тижнів позитивно впливає на стан кісткової тканини
після наступного впливу жорсткої гіпокінезії протягом 28 діб в
атмосферному повітрі. Вперше одержано докази на користь того, що на
щурів з аксіальним розвантаженням задніх кінцівок максимально позитивний
ефект справляє дозована переривчаста гіпоксія у режимах 10/10 та 10/20
хвилин, які характеризуються найбільшою кількістю повторних циклів
деоксигенації-реоксигенації. Вперше показано, що дозована переривчаста
гіпоксія підвищує ступінь структурного зв’язку між глікозаміногліканами
і колагеновими волокнами в ділянках активної продукції кристалів
гідроксиапатиту, що забезпечує високу стабільність фізіологічних
властивостей кісткової тканини.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Теоретичні
положення, отримані за результатами проведеної роботи, розширюють
уявлення про спрямованість адаптації кісткової системи щурів різного
віку до умов гіпокінезії та дефіциту навантаження. Отримані дані
свідчать, що гіпокінезія протягом 45 діб уповільнює фізіологічні темпи
зростання кісткової маси молодих щурів у більшій мірі, ніж дорослих.
Відсутність навантаження задніх кінцівок у щурів призводить до
встановлення нового динамічного співвідношення між процесами утворення і
руйнування кісткової тканини. Дозоване зниження парціального тиску кисню
з різним співвідношенням періодів деоксигенації та реоксигенації гальмує
розвиток остеопенії, підвищує ступінь структурного зв’язку між
глікозаміногліканами і колагеновими волокнами в ділянках активної
продукції кристалів гідроксиапатиту, підвищує біомеханічні властивості
кістки.

Періодичне дихання газовою сумішшю з дозованим зниженням парціального
тиску кисню може бути рекомендовано до апробації у клінічних умовах для
профілактики остеопенії, відновлення маси і фізіологічних властивостей
кісткової тканини у осіб з малорухомим способом життя та недостатнім
обсягом фізичних навантажень.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулювала мету та
завдання дослідження, розробила методику градації ступеня гіпокінезії у
щурів різного віку, що дозволило дослідити зміни в процесах
ремоделювання кісткової тканини (заявка на винахід №20041210501). Брала
участь у розробці методики аксіального розвантаження кінцівок у щурів.
Самостійно виконувала основну частину експериментів та досліджень,
здійснювала аналіз, статистичне опрацювання й узагальнення результатів і
написання статей.

Деякі експерименти було проведено разом із співавторами опублікованих
робіт, співробітниками відділу клінічної патофізіології Інституту
фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України: д.м.н., проф.Березовським
В.Я., зав.відділом клінічної патофізіології, к.б.н.Чакою О.Г., молодшим
науковим співробітником, Лахіним П.В., науковим співробітником, к.б.н.
Березовською О.П., старшим науковим співробітником, професором кафедри
нормальної анатомії людини Луганського державного медичного університету
д.м.н. Лузіним В.І.

Апробація результатів дисертації

Усі матеріали дисертації викладено на засіданнях Сектору фізіології
вісцеральних систем Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України
та на Всеукраїнських і міжнародних наукових форумах: XV з’їзді
Українського фізіологічного товариства (Донецьк, Україна, 1998); ІІ
Всеросійській конференції “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция”
(Москва, Росія, 1999); науково-практичній конференції “Возможность и
перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике,
биологии и медицине” (Москва, Росія, 1999); ІІІ Національному Конгресі
патофізіологів України з міжнародною участю, присвяченому 100-річчю від
дня народження акад. АМН СРСР М.М.Горєва (Одеса, Україна,2000); ІІ
міжнародному симпозиумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ,
Україна, 2000); Російській конференції “Организм и окружающая среда:
жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях” (Москва,
Росія, 2000); Materials 22 Annual International Gravitational Physiology
Meeting (Будапешт, Угорщина, 2001); матеріалах ХІІ конференції по
космічній біології та авіакосмічній медицині (Москва, Росія, 2002 ); II
Українскій конференції по перспективним космічним дослідженням
(Кацивелі, Крим, 2002); 24-th Annual International Gravitational
Physiology Meeting (Санта-Моніка, Каліфорнія, США, 2003); Російській
конференції з міжнародною участю “Организм и окружающая среда:
адаптация к экстремальным условиям” (Москва, Росія, 2003); ІІІ
Українскій конференції по перспективним космічним дослідженням
(Кацивелі, Крим, 2003); ІV науково-практичній конференції “Вторинний
остеопороз: Епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та
лікування” (Тернопіль, Україна, 2003); V науково-практичній конференції
“Вторинний остеопороз: Епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика
та лікування” (Одеса, Україна, 2003); ІІІ міжнародному симпозиумі
“Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, Україна, 2004); 25
Annual International Gravitational Physiology Meeting (Москва, Росія,
2004); науково-практичній конференції з міжнародною участю
“Использование природных и преформированных факторов в восстановительном
лечении и реабилитации больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями”
(Запоріжжя, Україна, 2004); IV Українській конфекренції по космічним
дослідженням (Понизівка, Крим, 2004); І Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Актуальні проблеми біомінералогії”
(Луганськ, Україна, 2004); V Українскій конференції по космічним
дослідженням (Євпаторія, Крим, 2005); ХVІІ з’їзді Українського
фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, Україна,
2006); 13-й Російській конференції по Космічній біології та
Авіакосмічній медицині з міжнародною участю (Москва, Росія, 2006), VIII
World Congress of the International Society for Adaptive Medicine
(Москва, Росія, 2006).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 25 статей у фахових
вітчизняних і закордонних журналах та 20 тез доповідей у матеріалах
наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на
323 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів
досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів, висновків, списка
використаних літературних джерел із 407 найменувань. Робота ілюстрована
63 рисунками та 35 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Загальна характеристика об’єктів дослідження. Дослідження стану
гіпокінезії та моделювання стану мікрогравітації шляхом створення
безопорного положення задніх кінцівок проведено на 320 щурах-самцях
лінії Wistar молодих (3 міс) і дорослих (6 міс). Середня вага молодих
щурів на час початку експериментів складала 100±10 г. Середня вага
дорослих щурів на час початку експериментів складала 280±10 г. У групах
досліджуваних щурів щотижнево натщесерце реєстрували масу тіла кожної
особини. Щоденно здійснювали контроль загального стану тварин, що
перебували у стані гіпокінезії та аксіального розвантаження задніх
кінцівок (АРЗК).

Всі щури знаходилися на стандартному раціоні віварію з фізіологічним
вмістом кальцію і мали вільний доступ до питної води. Стан гіпокінезії у
тварин 6 серій відтворювали шляхом перебування щурів у обмежуючих
комірках. Співвідношення площі проекції тіла тварини та площі
обмежуючої комірки становило 1:1. Експериментальне моделювання стану
мікрогравітації здійснювали шляхом аксіального розвантаження задніх
кінцівок (АРЗК) щурів (3 серії). Загальний стан тварин та інтенсивність
метаболізму КТ контролювали за допомогою фізіологічних, біохімічних,
морфометричних та морфологічних методів дослідження. Всі експерименти
проводили з урахуванням вимог Європейської конвенції про захист
хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових
цілей.

З метою дослідження впливу вихідного стану тварин на фізіологічні
реакції пристосування проведено 2 серії експериментів з преадаптацією
(прекондиціюванням) щурів. Преадаптацію здійснювали шляхом 14-добового
впливу ШГС зі зниженим парціальним тиском кисню та наступним обмеженням
рухливості через 2 доби по закінченні курсу прекондиціювання (табл.1).

Для вибору оптимальної тривалості дозованої деоксигенації-оксигенації
проведено 2 серії досліджень тривалості перехідного періоду при заміні
атмосферного повітря на ШГС. Враховували час стабілізації напруження О2
в підшкірній клітковині при диханні газовою сумішшю10 об.% О2 в азоті у
щурів в активному стані та під наркозом.

Напруження кисню в тканинах лабораторних тварин реєстрували
хроноамперометрично на платиновому індикаторному електроді з реєстрацією
на полярографі LP-7e виробництва Чеської фірми “Laboratorni Pristrii”.

Таблиця 1

Варіанти та обсяг проведених досліджень

№ Назва дослідження Кількість

Серій Кількість об’єктів

дослідження

1. Гіпокінезія 6 168

2. Аксіальне розвантаження задніх кінцівок

3

152

3. Преадаптація 2 48

4. Експериментальне обґрунтуван-

ня тривалості періодів дозованої деоксигенації-реоксигенації

2

26

Усього: 394 щурів

5. Визначення показників мікроциркуляції

а) контрольні

б) гіпокінезія

в) реактивна гіперемія

1

1

1

12

9

14

Усього: 35 осіб

Показники мікроциркуляції та прояви реактивної гіперемії при диханні
атмосферним повітрям та гіпоксичною газовою сумішшю визначали шляхом
застосування оклюзійної проби у 35 практично здорових осіб віком 25-40
років. Показник мікроциркуляції у магістральних артеріях та шкірі
визначали методом лазерної допплерівської флоуметрії апаратом “ЛАКК-01”
науково-виробничого підприємства “ЛАЗМА”, Росія.

Моделювання стану гіпокінезії у щурів. Для вивчення початкових стадій
функціональних змін КТ, з’ясування механізмів розвитку остеопенії,
викликаної дефіцитом навантаження, та досліджень впливу на її перебіг
коригуючих засобів створювали стан жорсткої гіпокінезії.

Схему побудови експерименту та розподіл тварин по групам наведено у
таблиці 2. Використовували жорсткий режим обмеження рухливості протягом
28 діб для тварин ІІ і ІІІ груп та 45 діб для щурів V і VI груп. У
кожній групі було від 8 до 12 щурів. Загальна кількість тварин складала
168. Тварини мали вільний доступ до корму і води. Штучну газову суміш
(ШГС) зі зниженим парціальним тиском кисню (91±8 мм рт.ст) подавали по 8
год. на добу (з 24.00 до 8.00 години) у переривчастих режимах 10/20 – 10
хвилин ШГС (Ро2=90-110 мм рт.ст.) з наступним періодом дихання
атмосферним повітрям протягом 20 хвилин, або 20/20 – 20 хвилин ШГС зі
зниженим Ро2, 20 хвилин – атмосферне повітря. Досліди проводили з
урахуванням вимог про гуманне ставлення до тварин.

Таблиця 2

Побудова експерименту та розподіл тварин по групам

Вік тварин Тривалість експерименту Умови впливу

№ групи

Молоді щури

(3 міс)

28 діб

45 діб І – віварний контроль

ІІ – гіпокінезія в атмосферному повітрі

ІІІ – гіпокінезія + ШГС зі зниженим Ро2

IV – віварний контроль

V – гіпокінезія в атмосферному повітрі

VI – гіпокінезія + ШГС зі зниженим Ро2

Дорослі щури

(6 міс)

28 діб

45 діб І – віварний контроль

ІІ – гіпокінезія в атмосферному повітрі

ІІІ – гіпокінезія + ШГС зі зниженим Ро2

IV – віварний контроль

V – гіпокінезія в атмосферному повітрі

VI – гіпокінезія + ШГС зі зниженим Ро2

Розробка засобів попередження негативних наслідків гіпокінезії. Одним
із шляхів біофізичної стимуляції тварин в стані гіпокінезії може бути
застосування ШГС зі зниженим Ро2. Для одержання ШГС було створено
пристрій мембранного газорозподілу елементів атмосферного повітря до
складу якого входять: мембранний газорозподільчий елемент, безмасляний
компресор, дросель регулювання Ро2, ротаметр, програмоване реле часу
подачі ШГС, програмоване реле часу подачі атмосферного повітря,
допоміжні технічні вузли.

Мембранний газорозподільчий елемент використовує капілярні рури
діаметром 10-12 мкм, виготовлені з полі-4-тетраметилпентену. Цей полімер
має селективну спорідненість до молекул кисню, пенетрація яких через
напівпроникну мембрану (принцип молекулярного сита) дозволяє
відокремлювати молекули кисню повітря від молекул азоту. Змішуючи
потоки О2 і N2 на виході пристрою у різних пропорціях, ми одержували ШГС
з заданим рівнем Ро2. Для контролю складу ШГС за вмістом кисню
використовували газоаналізатор кисню МИК-М з діапазоном вимірювання від
0 до 21 об.% кисню.

Для забезпечення періодичної подачі ШГС у автоматичному режимі, створено
програмований блок керування. За допомогою цього блоку задавали
тривалість роботи компресора установки газорозподілення з періодичним
вмиканням і вимиканням через задані інтервали часу. Під час інтервалу в
контейнер подавали атмосферне повітря від окремого мембранного
компресора з такою ж самою об’ємною швидкістю під контролем ротаметру
РМ-063 Г (рис.1).

1. Мембранний газорозподільний елемент; 2. Компресор для створення
газової суміші; 3. Компресор подачі атмосферного повітря; 4. Дросель
регулювання Ро2 ШГС; 5. Ротаметр; 6. Програмоване реле
часу подачі газової суміші; 7. Програмоване реле часу подачі повітря;
8. Клапан переключення струмів повітря; 9. Штуцер подачі газової суміші
або атмосферного повітря на колектор контейнеру.

Загальну тривалість гіпоксичного впливу та число циклів
деоксигенації-реоксигенації за 28 і 45 діб експерименту для кожного з
режимів наведено в таблиці 3.

Таблиця 3

Тривалість гіпоксичного впливу та число циклів

деоксигенації-реоксигенації за 28 і 45 діб гіпокінезії

Режим впливу За 1 добу, За 28 діб За 45 діб

хв. число

циклів

хв.

число

циклів

хв.

число циклів

10/20

20/20

160

240

16

12 4480

6720

448

336

7200

10800 720

540

Полярографічний контроль тривалості перехідних процесів при зміні
атмосферного повітря на штучну газову суміш. При подачі штучної газової
суміші лабораторним тваринам або людині для досягнення стану рівноваги
необхідний певний проміжок часу. Визначення тривалості перехідного
процесу необхідно при виборі часу подачі газової суміші для досягнення
певної метаболічної реакції тканин у відповідь на зміну рівня кисневого
постачання.

Газову суміш з вмістом кисню 10±1 об.% подавали тварині через маску
протягом 3-8 хвилин до повного врівноваження ШГС та напруження кисню в
підшкірній клітковині. Момент врівноваження реєстрували за досягненням
мінімального рівня хроноамперограми по відношенню до вихідних значень.
Підрахунок часу врівноваження здійснювали за графічною реєстрацією
хроноамперограми при швидкості руху діаграмної стрічки 10 мм/хв.

В спеціальній серії експериментів на 26 щурах проведено визначення
напруження кисню в підшкірній клітковині щура під час дихання
атмосферним повітрям та після переходу на дихання ШГС. Подачу газової
суміші здійснювали до стабілізації мінімального рівня Ро2.

Досліди показали, що тривалість перехідного періоду для різних щурів
варіює в межах від 180 до 360 сек. Проте, у тварин під наркозом
тривалість періоду врівноваження значно зростає порівняно з щурами, які
знаходилися в активному стані. У наркотизованих тварин середня
тривалість перехідного періоду при подачі газової суміші протягом
становила 400-460 сек. Тобто була майже вдвічі довшою, ніж у щурів без
наркозу.

Середня тривалість процесу, враховуючи час, потрібний для періоду
врівноваження газів тканин з газами керованої атмосфери (ШГС) та
тривалість адаптивної перебудови переключення метаболічних процесів на
роботу в умовах зниженого напруження кисню, потрібно подвоїти і навіть
потроїти мінімальний час експозиції тварин у ШГС. Таким чином,
тривалість дихання тварин гіпоксичною газовою сумішшю було встановлено
не менше, ніж 10 хвилин. Ця експозиція може бути і більшою, враховуючи
необхідність не тільки викликати певні метаболічні зміни, але і
закріпити їх у структурі метаболічних процесів організму.

ШГС подавали тваринам з 24.00 до 8.00 ранку автоматично в чотирьох
різних переривчастих режимах: щоночі по 8 годин протягом 28 або 45 діб.
Крім режиму 20/20 хвилин, досліджували також дію режимів 10/10, 10/20 і
30/20 хвилин.

Моделювання впливу мікрогравітації. Для відтворення ефектів стану
невагомості ми використали принцип методики Morey-Holton. Нами було
розроблено та створено власний варіант спеціального пристрою для
розвантаження задніх кінцівок у щурів.

Пристрій являє собою систему рухомої фіксації тіла другого хвостового
хребця в центральній його частині. При цьому задні кінцівки тварини не

торкаються ні платформи, ні бокових стінок контейнера, а тулуб
утримується до горизонту під кутом 40о-45о (рис.2). Такий спосіб
фіксації хвоста щура забезпечує рухомість тварини, мінімальну
травматизацію без компресії кровоносних і лімфатичних судин, без набряку
та некрозу тканин хвоста.

1. Напівсферична зйомна кришка контейнеру; 2. Фіксатор кришки;
3.Кронштейн підвіски фіксатора хвоста; 4. Поїлка для щурів; 5.
Годівничка для щурів; 6.Отвори розподілу газової суміші; 7. Колектор
фекалій і сечі; 8. Шланг подачі газової суміші.

У першій серії експериментів з АРЗК досліджено 56 молодих (3 міс.)
щурів-самців з безопорним положенням задніх кінцівок (рис.2) в умовах
періодичної подачі ШГС зі зниженим Ро2. Експеримент тривав 28 діб.
Газову суміш зі зниженим Ро2 подавали у трьох різних переривчастих
режимах щоденно з 24.00 до 8.00 години. Розподіл тварин здійснювавали
наступним чином: І – віварний контроль; ІІ – АРЗК в атмосферному
повітрі; ІІІ – АРЗК щурів, які дихали ШГС у переривчастому режимі 20
хвилин (Ро2=91±8 мм рт.ст.) з наступним періодом дихання атмосферним
повітрям протягом 20 хвилин (20/20), IV – АРЗК щурів, які дихали ШГС у
режимі – 10 хвилин ШГС зі зниженим Ро2, 20 хвилин – атмосферне повітря
(10/20); V – АРЗК щурів, які дихали ШГС у режимі – 10 хвилин ШГС зі
зниженим Ро2, 10 хвилин – атмосферне повітря (10/10). Загальну
тривалість гіпоксичного впливу на тварин та число циклів
деоксигенації-реоксигенації за 28 діб експерименту для кожного з режимів
наведено у таблиці 4.

Таблиця 4

Загальна тривалість гіпоксичного впливу та число циклів

деоксигенації-реоксигенації за 28 діб аксіального розвантаження
задніх

кінцівок щурів

№ групи Режим впливу (хв)

Тривалість впливу (хв) Число циклів (n)

за 1 добу за 28 діб

за 1 добу за 28 діб

І

ІІ

ІІІ

IV

V –

20/20

10/20

10/10 –

240

160

240 –

6720

4480

6720 –

12

16

24

336

448

672

Другу і третю серії експериментів з АРЗК проведено на 48 молодих і 48
дорослих щурах-самцях лінії Вістар. Вік тварин становив 3 і 6 міс.
Парціальний тиск кисню у створюваній нами ШГС становив 91 ± 8 мм рт.ст.
що відповідає вмісту 12 об.% О2. АРЗК і генерацію ШГС здійснювали по
описаній вище методиці. Режим подачі ШГС зі зниженим Ро2 здійснювали у
режимі – 30 хвилин ШГС з наступним періодом дихання атмосферним повітрям
протягом 20 хвилин (30/20).

Варіанти експериментів наведено у таблиці 5.

Стандартний корм і воду всі щури отримували без обмежень. Масу
тварин контролювали щотижнево, температуру і газову суміш у комірках
– щоденно. За 24 год. до закінчення дослідів збирали добову сечу і
фекалії. Щурів декапітували під рауш-наркозом, з урахуванням вимог про
гуманне ставлення до експериментальних тварин.

Таблиця 5

Серії експерименту та загальна тривалість гіпоксичного впливу на

щурів за 28 діб аксіального розвантаження задніх кінцівок

№ групи

та мета експерименту Вік щурів,

міс Режим впливу,

хв Тривалість впливу (хв) Число повторю-ваних циклів, n

за 1 добу за 28

діб

І, IV – віварний контроль 3 – – – –

ІІ, V – розвантаження

задніх кінцівок

в атмосферному

повітрі

3

ІІІ, VI- розвантаження

задніх кінцівок

в ШГС

3

30/20

300

8400

280

Тестування спонтанної рухової активності щурів. В кожній популяції
тварин існують індивідуальні варіації фенотипових форм поведінки. Для
визначення спонтанної рухової активності ми обрали “колесо вивірки”
(тредбан) з пасивним обертанням конструкції за рахунок енергії рухів
тварин.

Колесо сконструйовано таким чином, що дозволяє запускати у його
внутрішній замкнутий простір лабораторну тварину і вільно спостерігати
за її поведінкою через прозору бокову поверхню. Технічні особливості
конструкції дозволяють вільне обертання в одному напрямку і автоматичну
реєстрацію кількості обертів за певний відрізок часу. Після повторних
випробувань середню кількість обертів за 3 хвилини перебування тварини у
колесі ми розглядали як показник спонтанної, немотивованої
індивідуальної рухової активності.

Підготовка тканин для остеометричного і гістоморфологічного
дослідження. Анатомічно видаляли стегнові, плечові, великогомілкові
кістки. Для гістологічного дослідження ізольовані з організму щура
стегнові та інші кістки очищали від м’яких тканин і фіксували
нейтральним 4% формаліном на фосфатному буфері. Визначали остеометричні
параметри з точністю до 0,1 мм. Обробку гістологічних препаратів
проводили за стандартними методиками з попередньою декальцифікацією у
10% розчині ЕДТА протягом 28 діб, зневодненням у спиртах. Зразки
заливали в парафін, отримували повздовжні зрізи товщиною 5-10 мкм і
фарбували гематоксиліном і еозином.

На гістологічних зрізах вимірювали висоту ростової пластинки і кількість
хондроцитів у колонці, оцінювали об’ємну щільність трабекулярної кістки
в первинній і вторинній спонгіозі – параметр, який відбиває просторову
організацію її структури. Вимірювали товщину компактної кістки в
середині діафіза.

Для дослідження в скануючому мікроскопі і проведення зондового
мікроаналізу повздовжньо розколоті в ділянці fossa intercondylaris
кістки занурювали в рідкий азот, відмивали від клітин крові і кісткового
мозку, висушували і напилювали золотом у вакуумному запилювачі JFC-1100.

Для проведення зондового рентгенівського мікроаналізу стегнові кістки
після зневоднення заливали в епоксидну смолу й одержували повздовжні
шліфи діафіза. Розподіл кальцію по товщині кістки досліджували в
скануючому електронному мікроскопі з рентгенівським мікроаналізатором
JEOL Superprobe 733 при напрузі прискорення 25 kV і збільшенні х 2000.
Аналіз проводили по лінії Са – КL. Розміри зони кальцифікованого хряща,
товщину трабекул вторинної спонгіози вимірювали в ділянці дистального
метафіза.

Масу наднирників і тимуса – показників стійкості тварин до
експериментального емоційного стресу, визначали гравіметрично, на
аналітичних терезах. Визначали вміст еритроцитів і концентрацію
гемоглобіну в крові щурів загальноприйнятими методами.

Біохімічні показники адаптивної перебудови КТ, до яких відносять лужну
фосфатазу (ЛФ) та її кістковий ізофермент, остеокальцин, С-термінальний
пропептид колагену І типу (маркери формування КТ) та маркери резорбції –
лізосомальні ферменти: кисла фосфатаза (КФ) і тартратрезистентна кисла
фосфатаза (ТРКФ), гіалуронідазна активність (ГА), глікозаміноглікани
(ГАГ), паратиреоїдний гормон (ПТГ), креатинін, уронові кислоти
досліджували за допомогою спектрофотометричних та імуноферментних
методів реактивами фірм: Metra Osteocalcin EIA, Quidel Corporation, USA;
Rat Intact PTH ELISA Kit, Immutopics, Inc., USA; Лахема, Чехія.

Статистична обробка результатів. Цифрові дані обробляли з використанням
пакету програмного забезпечення “Magellan 3.0”, програми Microsoft
Excel. Для визначення вірогідності відмінностей між двома вибірками
використовували t-критерій Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Показники загального стану організму щурів у нормі, при гіпокінезії та
розвантаженні задніх кінцівок. Як показали проведені експерименти у
молодих тварин контрольної групи, які мають можливість вільно рухатися в
межах стандартної комірки і дихають атмосферним повітрям, маса тіла
закономірно збільшується. Такий процес є типовою ознакою для молодих
щурів, у тому числі лінії Вістар. У щурів такого ж віку при обмеженні
рухливості в атмосферному повітрі показники маси тіла за 28 і 45 діб
практично не відрізнялися від контрольних значень. Наприкінці
експерименту збільшення маси становило 78,2% і 135,7% відповідно. В той
же час у дорослих тварин ідентичні умови експерименту уповільнювали
зростання маси тіла. Протягом 28 і 45 діб маса тіла дорослих тварин
практично не змінювалася або дещо підвищувалася в середньому на 5-6%.
Через 28 діб маса тіла цих тварин зросла лише на 12,7%, через 45 діб –
на 6,4%.

Однією з можливих причин розбіжності може бути добре відома пластичність
молодих тварин та їх здатність краще адаптуватися до реальних умов
середовища. На відміну від дорослих, у молодих щурів відносно більша
маса вилкоподібної залози (на 1 г маси тіла), вища концентрація в крові
та тканинах гормону росту, більша інтенсивність споживання кисню на 1 г
білку тканин. Вірогідно, всі ці відмінності та більш висока здатність
молоді пристосовуватися до умов існування забезпечували тенденцію до
збільшення маси тіла навіть у таких несприятливих умовах як жорстке
обмеження рухливості.

У щурів з АРЗК в атмосферному повітрі зростання маси тіла відбувалося
вдвічі повільніше відносно контрольної групи тварин і не перевищувало
15-20% за тиждень. У сумі протягом чотирьох тижнів експерименту маса
тіла зросла на 66,6%, що на 57,4% менше вихідних значень для контрольної
групи тварин. Ці дані отримано в умовах дихання атмосферним повітрям.

Треба зауважити, що на відміну від жорсткої гіпокінезії, АРЗК має
елементи гіпокінезії середнього ступеню. Умови проведення експерименту з
АРЗК залишали можливість тварині переміщати тіло в просторі, міняти
позу. Проте, тіло тварини знаходилося не в горизонтальному положенні, а
мало нахил до лінії горизонту 40-450, що зумовлювало гравітаційне
переміщення рідин у краніальному напрямку. Це один із елементів, який
моделює реакцію організму на перебування в стані мікрогравітації. Не
зважаючи на незвичайне положення осі тіла загальний стан цих тварин
протягом всього експерименту залишався задовільним. У них не
спостерігалося змін волосяного покрову, а приріст маси тіла майже не
відрізнявся від змін маси тіла молодих щурів у стані жорсткої
гіпокінезії.

Результати проведених нами дослідів показали, що при обмеженні
рухливості та АРЗК в умовах перебування в ШГС відбувається уповільнення
приросту маси тіла як молодих, так і дорослих щурів порівняно з
контрольними групами тварин. У молодих щурів з обмеженням рухливості
через 28 діб перебування в ШГС маса тіла зросла на 37,7%, а через 45
діб – на 63%. У дорослих тварин через 28 діб досліджень спостерігали
зниження цього показника на 11,6% і тенденцію до збільшення на 0,5%
(Р>0,05) через 45 діб.

За показниками приросту маси тіла у щурів з АРЗК у ШГС виявлено, що
максимальне зростання маси тіла відбувалося при режимі подачі ШГС 10/20
хвилин. Це збільшення становило в кінці експерименту 69,4% відносно
вихідних значень. За той же термін при режимі подачі 10/10 хвилин цей
показник не перевищував 30,2%, а при режимі 20/20 хвилин – 56,9%
порівняно з контрольними показниками.

Таким чином, обмеження рухливості і розвантаження задніх кінцівок щурів
неоднаково впливає на динаміку зростання маси тіла молодих і дорослих
тварин. Спільна дія гіпокінезії і зниженого парціального тиску кисню в
газовій суміші гальмує приріст тіла щурів пропорційно тривалості
експерименту. А з трьох застосованих режимів впливу штучних газових
сумішей оптимальним виявилося співвідношення у циклі: дереоксигенація
тривала 10 хвилин, а ререоксигенація – 20 хвилин.

У проведених дослідженнях маса вилкоподібної залози у щурів кожної
вікової групи залишалася достатньо стабільною. Характер зовнішніх
впливів і їх тривалість не викликали вірогідних змін цього показника. Із
цього можна зробити висновок, що обраний нами варіант обмеження
рухливості у молодих і дорослих щурів протягом 28- та 45- діб не
викликає вірогідних змін вагових коефіцієнтів вилкоподібної залози.
Одноманітність маси залози можна розглядати як свідчення фізіологічної
стабільності соматичного стану тварин при гіпокінезії. В серії
експериментів з моделюванням АРЗК у молодих щурів відбувалося зниження
відносних вагових коефіцієнтів вилкоподібної залози у тварин IV групи,
що дихали ШГС зі зниженим Ро2 в режимі 10/20 хвилин.

Маса наднирників молодих щурів за даними гравіметричного контролю
вірогідно збільшувалася (Р " * Iтенденцію до підвищення. У кістковій тканині ГА не змінювалася у тварин ІІ групи і дещо підвищувалася у щурів ІІІ групи. Водночас концентрація ГАГ у цих тварин зростала у 4,2 і 3,2 рази відповідно порівняно з контролем. Тобто у молодих щурів преадаптація істотно змінювала реакцію КТ на обмеження рухливості. У дорослих щурів V і VІ груп активність ЛФ, КФ, ТРКФ у сироватці крові і КТ не змінювалася порівняно зі значеннями у тварин контрольної групи (ІV). Гіалуронідазна активність мала тенденцію до підвищення у сироватці крові як у щурів V групи так і VІ групи. У кістковій тканині ГА вірогідно знижувалася у 3,3 рази (V група) і 4,2 рази (VІ група) порівняно з контрольними значеннями. Концентрація ГАГ у сироватці крові знизилася у 2,1 рази у щурів V групи і не змінювалася у тварин VІ групи відносно контрольних значень. Як показали проведені експерименти, прекондиціювання дорослих щурів у ШГС зі зниженим Ро2 позитивно впливає на стабільність показників стану КТ тварин, що перебували 28 діб в умовах жорсткої гіпокінезії та дихали атмосферним повітрям. Подовження строку перебування у ШГС зі зниженим Ро2 не погіршує, а навіть дещо поліпшує показники ремоделювання КТ. У молодих щурів гіпоксичне прекондиціювання і подальше дихання ШГС зі зниженим Ро2 зменшує прояви дисбалансу біохімічних показників формування і руйнування у КТ. Для вивчення можливості усунення наслідків гіпокінезії у четвертій серії експерименту було використано метод дозованої кисневої депривації у режимі: 10 хв.- ШГС зі зниженим Ро2, 20 хв. – атмосферне повітря (10/20). Показано, що такий режим стимуляції остеогенезу нормалізуєї значну частину досліджуваних показників. Так, концентрація остеокальцину у сироватці крові щурів ІІІ групи після курсу сеансів дозованої гіпоксії вірогідно знизилася у 1,2 рази. Рівень ПТГ, С-термінального пропептиду колагену І типу виявляв тенденцію до підвищення. Концентрація ГАГ у сироватці крові залишалася у 1,5 рази підвищеною порвняно з контрольними значеннями. Активність ТРКФ у сироватці крові була значно нижчою порівняно із показниками у тварин, що знаходилися в умовах обмеження рухливості і дихали атмосферним повітрям, але залишалася вірогідно підвищеною (на 140%, P

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020