АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут фармакології та токсикології
ЛИМАРЕНКО Ірина Василівна
УДК 615.015.13:615.217.5
Пошук потенційних міотропних детрузороселективних сполук в ряду похідних
гуанідину
14.03.05-фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ-2006
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі фармакології серцево-судинних засобів
Інституту фармакології та токсикології АМН України
Науковий керівник доктор медичних наук,
професор
Мохорт Микола Антонович,
Інститут фармакології та токсикології АМН України,
завідувач відділу фармакології серцево-судинних
засобів
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Тишкін Сергій Михайлович,
Інститут фармакології та токсикології АМН України,
головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії
доктор медичних наук,
професор
Степанюк Георгій Іванович,
Вінницький національний медичний університет МОЗ України,
завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології
Провідна установа
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, кафедра
фармакології з курсом клінічної фармакології,
МОЗ України, Київ
Захист відбудеться ‹‹15›› лютого2006р. о 13 00годині на засіданні
спеціалізовано вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та
токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена
Потьє,14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена
Потьє,14.
Автореферат розісланий ‹‹13›› січня 2006р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук
Данова І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Гіперактивність сечового міхура – стан, що
характеризується наявністю частого сечовипускання, імперативних позивів
з ургентним нетриманням сечі чи без нього, є одною з найчастіших причин
порушень сечовипускання. Статистичні дані підтверджують, що близько 30%
жінок середнього і літнього віку нашої країни страждають цим
захворюванням (А.С. Переверзев, 2001). Гіперактивність сечового міхура
класифікується як поняття, що уродинамічно визначається мимовільними
скороченнями детрузора під час фази наповнення. Клінічно гіперактивність
детрузора проявляється сильними, несподіваними позивами до
сечовипускання, які при неможливості негайного випорожнення сечового
міхура можуть призводити до ургентного нетримання сечі.
Для лікування гіперактивності сечового міхура використовують аналоги
вазопресину; гормональні препарати; інгібітори синтезу простагландинів;
б-адреноміметики; в-адреноблокатори; трициклічні антидепресанти;
антихолинергичні препарати. недостатня ефективність або наявність
великої кількості побічних ефектів (порушення акомодації, тахікардія,
гепатотоксичність) у препаратів перелічених груп спонукали до пошуку та
дослідження нових засобів (D. Rigby, 2005). Вважається, що найбільш
перспективним є пошук засобів модуляції активності
аденозинтрифосфатзалежних калієвих каналів гладеньком’язевих елементів
сечового міхура, які відіграють важливу роль в регуляції скорочувальної
здатності детрузора (R. Kavia, 2005).
Активатори калієвих каналів – відносно новий клас антигіпертензивних,
протиішемічних, антиангінальних препаратів, що викликають артеріолярну
та венулярну вазоділатацію. На даний час існує багато груп сполук, які
мають здатність активувати калієві канали. Найбільш вивчені похідні
бензопирану (кромакалім), гуанідину (пінацидил), нікотинаміду
(нікорандил) та піримідиндіаміну (міноксидил). Незважаючи на різну
хімічну структуру, відкривачі (активатори) калієвих каналів мають
загальний механізм дії: активуючи певні види калієвих каналів у
клітинних мембранах, вони сприяють виходу іонів калію з клітки і
виникненню на мембрані стійкої гіперполяризації, що перешкоджає
надходженню іонів кальцію через потенціалкеровані кальцієві канали, при
цьому збільшується пороговий потенціал, що викликає зниження збудливості
гладеньком’язевих клітин (судин, матки, бронхів, сечового міхура і т.д.)
і здатності їх до скорочення. Кромакалім, пінацидил і левкромакалім in
vitro та in vivo показали здатність концентраційно-залежним чином
знижувати скорочувальну активність сечового міхура, як спонтанну, так і
індуковану електростимуляцією, високими концентраціями позаклітинного
калію, карбахолом та ін. Однак, значним недоліком цих препаратів є
наявність вираженої гіпотензивної дії. Результати клінічних випробувань
показали, що дані сполуки не спричинюють відповідного ефекту в дозах,
які не зменшували виражено артеріальний тиск (H. Hedlund із співавт.,
1991; K. Komersova із співавт., 1995). Для вирішення цієї проблеми
необхідний подальший пошук нових більш селективних активаторів калієвих
каналів, позбавлених виражених антигіпертензивних властивостей.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась згідно планової наукової теми відділу фармакології
серцево-судинних засобів Інституту фармакології та токсикології АМН
України, № державної реєстрації 0105U002252.
Мета роботи: на основі експериментальних досліджень нових фторвмісних
похідних гуанідину визначити найбільш активну сполуку з переважним
впливом на скорочувальну активність м’яза, що виштовхує сечу.
Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувались
наступні задачі:
Вивчити вплив нових фторвмісних похідних гуанідину на скорочувальну
активність детрузора на ізольованих смужках сечового міхура щурів in
vitro.
Дослідити дію нових фторвмісних похідних гуанідину на тонус судин іn
vitro.
Встановити вплив найбільш селективної по відношенню до детрузора сполуки
на скорочувальну активність сечового міхура в умовах in vivo.
Вивчити гостру токсичність (DL50) найбільш активної по відношенню до
детрузора сполуки на білих мишах.
Об’єкт дослідження – фторвмісні похідні гуанідину (аналоги пінацидила).
Предмет дослідження – характер впливу нових фторвмісних похідних
гуанідину на скорочувальну активність сечового міхура та тонус судин.
Методи дослідження – фармакологічні, фізіологічні, токсикологічні,
статистичні.
Наукова новизна дослідження. Проведені дослідження в умовах in vitro
вперше показали наявність спазмолітичних та вазодилататорних
властивостей у нових фторвмісних похідних гуанідину.
Вперше визначена найбільш селективна відносно детрузора речовина PF-5,
яка пригнічує скорочувальну активність сечового міхура в дослідах на
тваринах.
Показано, що в механізм спазмолітичної дії нового фторвмісного похідного
гуанідину речовини PF-5 залучена активація АТФ-залежних калієвих
каналів.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обґрунтовано
доцільність використання нової фторвмісної похідної гуанідину речовини
PF-5 для усунення гіперактивності сечового міхура. Результати досліджень
впроваджено в навчальний процес кафедр фармакології Національного
медичного університету імені О.О. Богомольця, Медичного інституту
Української Асоціації Народної Медицини, Вінницького національного
медичного університету ім. М.І. Пирогова, Харківського медичного
університету
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів
патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових
серверів та медичної бази даних мережі Internet, аналіз даних наукової
літератури за темою дисертації, відпрацював дослідні методики, спланував
та виконав всі дослідження. Облік, аналіз первинного матеріалу,
статистична обробка результатів, розробка основних положень та висновків
роботи, написання всіх розділів дисертації також виконано дисертантом
особисто.
Апробація результатів роботи. Основні положення та висновки
дисертаційної роботи були представлені та обговорені на:
Науково-практичній конференції “Актуальні питання кардіології та
ревматології” (Київ, 2003); V конференції молодих вчених, присвяченій
пам’яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); Науково-практичній
конференції “Актуальні питання діагностики, лікування і профілактики
серцево-судинних захворювань” (Донецьк, 2004);V конференції молодих
вчених СО РАМН (Новосибірськ, Росія, 2004); IV Національному конгресі
патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004); IV
Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з
клінічної фармакології (Україна, Вінниця, 7-8 жовтня, 2004 р.); XII
міжнародній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених
“Ломоносов-2005” (Москва, Росія, 2005), де отримала Диплом другого
ступеня за наукову роботу в конкурсі наукових робіт; XII Російському
національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, Росія, 2005);
Науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні
проблеми радіаційної медицини” (Київ, 2005); Науково-практичній
конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми медичної та клінічної
біохімії” (Чернівці, 2005); 12th International Student Congress of
Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); 16th European students’
conference (Берлін, Німеччина, 2005), де отримала Диплом переможця сесії
“Урологія/Нефрологія”; Міжнародній науково-практичній конференції
молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2005); ІІ Науково-практичній
конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми
фармакології та токсикології” (Київ, 2005).
Публікації. Матеріали досліджень опубліковані в 20 наукових роботах: 8
статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 статті
у закордонних наукових виданнях та 10 тез наукових форумів, семінарів,
симпозіумів, конференцій, 5 з яких закордонні.
Об’єм та структура дисертації. Дисертацію викладено на 140 сторінках
друкованого тексту. Вона складається зі вступу, огляду літератури,
розділу “матеріали та методи дослідження”, 5 розділів власних
досліджень, розділу “Обговорення отриманих результатів”, висновків та
списку використаної літератури. Роботу проілюстровано 9 таблицями, 23
рисунками. Бібліографія включає 240 джерел, 205 із яких опубліковані в
зарубіжних виданнях.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. У роботі досліджувалися нові похідні
N-1; 2,2-триметилпропил-N”-ціано-N’-арилгуанідину, що були синтезовані
в Інституті органічної хімії під керівництвом проф. Л.М. Ягупольського.
Ці нові речовини відрізняються від препарату-прототипу, пінацидила,
наявністю атома хлору або фторованої групи в ароматичному кільці (рис.
1).
Рис. 1. Загальна формула фторвмісних похідних гуанідину
Експерименти виконані на 200 нелінійних статевозрілих щурах-самках масою
250-350 г, 50 нелінійних статевозрілих щурах-самках масою 300-350 г, 20
нелінійних статевозрілих білих мишах різної статі масою 18-29 г, які
утримувалися на стандартному раціоні у віварії Інституту фармакології та
токсикології АМН України. Для приготування всіх буферних розчинів Кребса
та Кребса-Хенселейта використовували хімічно чисті реактиви, які
розчиняли у дистильованій воді. Глібенкламід, диметилсульфоксид та
диметилацетамід були виробництва “CGmbH” (Німеччина).
Для проведення досліджень in vitro використовували установку для
вивчення скорочувальної активності ізольованих смужок сечового міхура та
кільцевих судинних сегментів. Досліди проводили на ізольованих смужках
сечового міхура та на ізольованих кільцевих смужках аорти щурів, що були
закріплені в робочій камері з одного боку до стаціонарного гачка, а з
іншого – до штоку тензодатчика (M. Gopalakrishnan, 2002; C.D. Foster,
1989). Всі тестування проводилися в ізометричному режимі при початково
заданій напруженості. Дослідження вазодилататорних ефектів досліджуваних
сполук проводили на фоні підвищеного судинного тонусу препаратів аорти,
який отримували, в залежності від мети експерименту, за допомогою
гіперкалієвого розчину Кребса (KCl- 60 ммоль/л) або фенілефрина (1
ммоль/л). Вивчення спазмолітичних ефектів досліджуваних сполук проводили
на фоні підвищеної скорочувальної активності препаратів сечового міхура,
який отримували, в залежності від мети експерименту, за допомогою
гіперкалієвого розчину Кребса-Хенселейта з концентрацією хлориду калію
60 або 15 ммоль/л. Робочі розчини насичували газовою суміщщю 95% О2 та
5% СО2. За допомогою автоматичного термостата температура розчину в
камері підтримувалась на рівні 37±0,5(С. Запис скорочувальної активності
здійснювали на папері за допомогою багатоканального самописця моделі
Н3031.
Експерименти in vivo проведені на щурах-самках (300-350 г),
анестезованих уретаном (1,2 г/кг). Внутрішньопузирний тиск вимірювався
через інтрауретральний катетер, який був підключений через триходовий
перемикач до датчика тиску. Система була заповнена фізіологічним
розчином. Трахея була інтубована поліетиленовою трубкою для полегшення
дихання. В першій серії експериментів об’єм інфузованого сольового
розчину складав 0,1-0,15 мл і не викликав рефлексу сечовипускання (Y.
Yu, 1999). Ефекти досліджуваних речовин фіксувалися через 10 хв після
внутрішньооочеревинного введення. В другій серії експериментів об’єм
інфузованого сольового розчину складав 0,4 мл і викликав рефлекс
сечовипускання (S. C. Turner, 2003). Максимальні ефекти досліджуваної
речовини фіксувалися через 20 хв після внутрішньоочеревинного введення.
Одночасно з дослідженням впливу експериментальної речовини на рефлекс
сечовипускання вимірювали артеріальний тиск прямим методом через
катетер, введений в сонну артерію та заповнений гепаринізованим
розчином. Реєстрація скорочувальної активності здійснювалася за
допомогою датчиків тиску виробництва “Vogtmedical” (Німеччина). Запис
здійснювали на папері за допомогою багатоканального самописця моделі
Н3031.
Для визначення середньої летальної дози (DL50) найбільш активної
речовини використовували метод В.Б. Прозоровського (1998).
Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали
за t-критерієм Ст’юдента. Зміни вважали статистично вірогідними при
Р(0,05. Величини ЕС50 для залежностей доза-ефект були отримані з
апроксимацій експериментальних даних кривої доза-ефект (кривої Хілла),
що побудована за методом найменших квадратів. Всі розрахунки проводили
на персональному комп’ютері “Pentium 4 3.0”. При виконанні дисертаційної
роботи було використано програми “Microsoft ехеl 2002 (10.2701.2625)” та
“ORIGIN 6.0”.
Результати досліджень та їх обговорення. Вплив нових фторвмісних
похідних гуанідину на скорочувальну активність смужок сечового міхура
щурів. При перфузії дослідних препаратів гіперкалієвим розчином з
концентрацією хлориду калію 60 ммоль/л спостерігається підвищення
базального тонусу смужок сечових міхурів. Нові фторвмісні похідні
гуанідину зменшують тонус смужок сечового міхура, індукований сольовим
розчином з концентрацією хлориду калію 60 ммоль/л
концентраційно-залежним чином (табл. 1).
Таблиця 1
Значення середніх ефективних концентрацій
нових фторвмісних аналогів пінацидила
(ізольовані смужки сечового міхура, 60 мМ KCl, М±m, n=8)
Речовина -Log EC50 EC50, мкмоль/л
Пінацидил -6,67 ± 0,06 0,21 ± 0,03
PF-5 -6,8 ± 0,08 0,15 ± 0,027
PF-10 -6,7 ± 0,06 0,19 ± 0,02
PF-15 -5,6 ± 0,1 2,3 ± 0,5 *
PF-20 -5,0 ± 0,03 8,8 ± 0,6 **
Примітки: на цій та табл. 2-4
1.* – р0,05). Таким чином, речовина
PF-5 в дозі 1 мг/кг повністю пригнічує рефлекс сечовипускання, зменшуючи
амплітуду хвиль скорочувальної активності, та практично не впливає на
артеріальний тиск.
Рис. 2. Вплив речовини РF-5 та пінацидила на скорочувальну активність
сечового міхура in vivo.
E
i
,^:
,^Ae( 8 : & $ ??{?? {?? , , , введенням досліджуваної речовини) перфузували протягом 10 хв глібенкламідом (3 ммоль/л). Глібенкламід не викликав вірогідних змін скорочувальної активності гладеньком’язевих препаратів. При наступній перфузії речовиною РF-5 спостерігалось зменшення її спазмолітичного ефекту відносно смужок сечового міхура. В серії експериментів без інгібування АТФ-залежних калієвих каналів середня ефективна концентрація речовини PF-5 складала -7,57±0,03 (0,028±0,002 мкмоль/л). В серії експериментів з інгібуванням цих каналів глібенкламідом напівмаксимальний ефект спостерігався при концентрації речовини PF-5 -5,84±0,07 (1,43±0,5 мкмоль/л). Як видно на рис. 3, глібенкламід викликає зсув кривої концентрація-ефект спазмолітичної дії досліджуваної речовини практично паралельно вправо. Таким чином, отримані результати свідчать, що в механізм дії нового фторвмісного похідного гуанідину речовини РF-5 залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів, внаслідок чого її можна ідентифікувати як активатор калієвих каналів. Рис. 3. Вплив речовини PF-5 на скорочувальну активність смужок сечових міхурів без попередньої перфузії глібенкламідом та на фоні його дії в концентрації 3 ммоль/л. * – р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
