`НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ
Ляхов Олексій Михайлович
УДК 57.011+577.352.22+615.01+577.112.824
Взаємодія фізіологічно-активних речовин з ленгмюрівськими
мономолекулярними плівками
02.00.10 – біоорганічна хімія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі медико-біологічних досліджень Інституту
біоорганічної хімії
та нафтохімії НАН України.
Науковий керівник
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник
Могилевич Сергій
Євгенович,
Інститут біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу
медико-біологічних досліджень
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук,
професор
Кібірєв Володимир
Костянтинович,
Інститут біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України,
завідувач відділу хімії
білка
доктор біологічних наук,
доцент
Островська Галина
Віталіївна,
Інститут фізіології ім.
П.Богача Київського національного
університету ім. Тараса
Шевченка,
професор кафедри
цитології, гістології та біології розвитку
Провідна установа
Інститут біохімії ім.
О.В.Палладіна НАН України,
лабораторія сигнальних
механізмів клітини
Захист відбудеться 27 жовтня 2006 року о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії
та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.
Автореферат розісланий 27 вересня 2006 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Визначення провідної ролі аденілатциклазного каскаду
та Cа-залежного каскаду поліфосфоінозитидних ліпідів в біорегуляції
клітинних функцій стало основою для з’ясування функціональної спільності
ксенобіотиків, що подібним чином впливають на активність основних
сигнальних систем клітини (ОССК) [Луйк А.И., Могилевич С.Е., 1992; Луйк
А.И., 1998]. Положення про наявність біорегуляторних стереотипів
підтверджується дослідженнями на об’єктах, для яких зв’язок біологічних
функцій з відповідями ОССК простежується чітко і однозначно. Поряд з цим
накопичуються дані про біорегуляторний вплив фізіологічно-активних
речовин (ФАР) на об’єкти, біологічні функції яких безпосередньо не
пов’язані з ОССК (деякі білки крові, транскрипція ДНК in vitro тощо)
[Luik A.I., et al., 1998; Прокопенко В.В., 2001]. Показано, що такі
об’єкти можуть якісно по-різному реагувати на наявність ФАР двох
біорегуляторних класів.
Особливий інтерес викликає дослідження впливу ФАР на фізико-хімічні та
структурні параметри природних і модельних мембран, зокрема, моношарових
плівок з фосфоліпідів та білків, що сформовані на поверхні гідрофільних
середовищ. Однією з найважливіших характеристик мембран, яка має
вирішальне значення для регуляції функціонування мембранних білків та
здійснення бар’єрної функції, є їх рідинність, яка описується параметром
мікров’язкості. На відміну від інших моделей, техніка отримання та
стискування моношарів дозволяє варіювати рідинність ліпідів у дуже
широких межах.
З теоретичної та практичної точки зору актуальним є вивчення як самої
дії на ленгмюрівські мономолекулярні плівки типових представників двох
класів ФАР з різною спрямованістю впливу на ОССК, так і виявлення
біорегуляторного стереотипу ФАР на моделі моношарових плівок з
фосфоліпідів та сироваткового альбуміну, а також виявлення
мембранотропної активності лікарських засобів, яка може мати значення в
реалізації їх фармакологічної дії. Зокрема, це стосується препаратів, в
прояві лікувального ефекту яких значну роль відіграє взаємодія з
біомембраною (наприклад, кардіотонічних лікарських препаратів).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у рамках відомчих тем НАН України „Вплив складу ліпідного
моношару та фізіологічно-активних речовин на термодинамічні параметри
фосфоліпідних мономолекулярних плівок Ленгмюра” тема 2.1.10.29-97, №
Держреєстрації 0100U002323; „Вивчення стереотипів дії
фізіологічно-активних речовин на рівні модельних мембран”, тема
2.1.10.29-00, № Держреєстрації 0102U003345 та „Вивчення біорегуляторних
ефектів фізіологічно-активних речовин на молекулярних та клітинних
моделях, безпосередньо не пов’язаних з головними системами клітинної
сигналізації”, тема 2.1.10.18-02, № Держреєстрації 0105U001582, а також
частково фінансувалась грантами INTAS (№№ 96-0067 та 00-243).
Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи полягала у
виявленні біорегуляторного стереотипу дії ФАР на фізико-хімічні та
структурні характеристики моношарових плівок з фосфоліпідів та
сироваткового альбуміну бика. Для досягнення цієї мети були поставлені
такі задачі:
– Дослідити формування мономолекулярних плівок Ленгмюра з фосфоліпідів
та сироваткового альбуміну на поверхні гідрофільного середовища.
– Вивчити вплив модуляторів ОССК на ленгмюрівські мономолекулярні плівки
з фосфоліпідів та сироваткового альбуміну бика.
– Оцінити прояв біорегуляторного стереотипу дії ФАР при їх взаємодії з
мономолекулярними плівками з фосфоліпідів і сироваткового альбуміну за
допомогою кластерного аналізу та штучних нейронних мереж.
– Дослідити мембранотропну активність нових кардіотонічних лікарських
засобів, актопротекторів та препаратів групи макроергічних сполук. На
основі зміни структурних та термодинамічних параметрів моношарів з
дистеароїлфосфатидилхоліну під дією ФАР за допомогою кластерного аналізу
проаналізувати можливість завбачення біорегуляторного стереотипу цих
препаратів.
Об’єкт дослідження – біорегуляторні стереотипи дії ФАР, що виявляються
на різноманітних біологічних та модельних системах.
Предмети дослідження – стереотип дії ФАР на фізико-хімічні та структурні
характеристики мономолекулярних плівок Ленгмюра з фосфоліпідів та
сироваткового альбуміну; мембранотропна активність лікарських засобів.
Методи дослідження – метод рівномірного стискування ленгмюрівського
моношару від газоподібної фази до твердотільного стану, електрофорез,
кластерний аналіз, метод штучних нейронних мереж (ШНМ), методи
математичної обробки результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано збереження
стереотипу в дії біорегуляторів на ленгмюрівські моношарові плівки з
дистеароїлфосфатидилхоліну (ДСФХ) та його еквімолярної суміші з
диміристоїлфосфатидилхоліном (ДМФХ), а також на моношари з сироваткового
альбуміну бика (САБ).
Створено ефективний алгоритм, що базується на застосуванні методів
кластерного аналізу та ШНМ, за допомогою якого можна розподіляти
речовини на класи згідно з притаманним їм біорегуляторним стереотипом
дії за впливом ФАР на моношарові плівки з фосфоліпідів та альбуміну. В
дослідженнях взаємодії деяких нових лікарських засобів з ленгмюрівськими
моношарами з фосфоліпідів встановлена мембранотропна активність, яка
може відігравати значну роль в фармакологічній дії вивчених препаратів.
Запропоновано віднесення цих ФАР до відповідних біорегуляторних класів
на основі впливу препаратів на моношарові плівки з ДСФХ.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть
бути використані, головним чином, в двох актуальних практичних
напрямках. По-перше, при розробці принципово нової стратегії
конструювання лікарських засобів (та інших ФАР), яка враховує існування
стереотипних механізмів біорегуляції. Ця стратегія доповнює існуючу на
сьогоднішній день методологію, спрямовану на отримання (за окремими
ознаками хімічної будови) сполук з максимально специфічною
фармакологічною дією. По-друге, результати роботи можуть бути корисними
для таких важливих цілей фармакотерапії, як аналіз особливостей побічної
(неспецифічної) дії лікарських засобів; розробка нових схем терапії при
лікуванні хвороб, що мають багатофакторне походження. Визначення
мембранотропної активності препаратів дозволяє більш ефективно
застосовувати фармакологічні засоби, зокрема, враховуючи вплив цих ліків
на ліпідну складову клітинної мембрани.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно виконав експериментальну
частину роботи, обробку, аналіз та узагальнення отриманих результатів.
Постановка завдань, обговорення результатів та формування висновків
відбувалось спільно з науковим керівником. Результати робіт, що
опубліковані у співавторстві та увійшли до дисертації, одержані особисто
здобувачем. Автор щиро вдячний к.х.н. В.В. Ковалішину за надання
програми та консультативну допомогу при проведенні розрахунків за
методом штучних нейронних мереж та Ю.В. Пивоваренку за консультації при
проведенні досліджень розчинів сироваткового альбуміну із спиртами.
Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були
представлені на міжнародній конференції “Physics of Liquid Matter:
modern problems” (Київ, вересень 2001 р.), II Національному з`їзді
фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє”
(Дніпропетровськ, жовтень 2001 р.), Українській конференції молодих
вчених, присвяченій пам`яті академіка В.В. Фролькіса, (Київ, січень 2002
р.), міжнародній конференції „Физико-химический анализ жидкофазных
систем”, присвяченій 100-річчю з дня народження Р.В. Мерцліна (Саратов,
Росія, червень-липень 2003 р.), ХIV, ХVII та ХIX наукових конференціях з
біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, березень 1999, 2002, 2004 рр.).
Публікації. Основні результати дисертації викладено в 7 статтях у
фахових наукових виданнях та 4 тезах доповідей.
Структура та об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, експериментальної частини, викладу отриманих результатів та
їх обговорення, заключної частини і висновків та списку використаної
літератури (179 найменувань). Дисертаційна робота викладена на 136
сторінках тексту та містить 11 таблиць та 30 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Біорегуляторні стереотипи дії ФАР найчастіше виявляються на модельних
системах, інтегральні відповіді яких безпосередньо та однозначно
пов’язані з балансом активностей ОССК. Поряд з цим, останнім часом
накопичуються дані про біорегуляторний вплив ФАР на об’єкти, біологічні
функцій яких безпосередньо не пов’язані з відповідями ОССК. У багатьох
випадках ці моделі якісно по-різному розпізнають активатори
аденілатциклазної та/або інгібітори Ca-залежної поліфосфоінозитидної
сигнальних систем (клас +І/–ІІ) та інгібітори аденілатциклазної та/або
активатори фосфоліпідної сигнальних систем (клас –І/+ІІ). Однією з таких
систем є моношарові плівки з фосфоліпідів та білків, які є зручним
об’єктом для моделювання ліпідного матриксу біомембран в широкому
діапазоні значень мікров’язкості.
Досліджувані речовини класу +І/–ІІ
Ізадрин Теофілін Димедрол
Ніфедипін
Празозин
Йохімбін Атропін
Досліджувані речовини класу –І/+ІІ
Пропранолол Толбутамід
Клонідин
Мезатон Левамізол
Карбахолін
Рис. 1. Модулятори аденілатциклазної та поліфосфоінозитидної сигнальних
систем клітини
Досліди проводили в з’ємній тефлоновій ванні об’ємом 120 мл. На поверхню
субфази (5.10-3 М Трис-HCl, pH 7,4) наносили 5 мкл розчину ліпіду в
хлороформі або 5 мкл розчину САБ з н-аміловим спиртом (0,5% за об’ємом).
Стискування моношару проводили за допомогою рухомого бар’єру. Обробка
ізотерм стискування базувалася на результатах досліджень Si-shen Feng et
al., 1994. Розраховували площу, що припадає на одну молекулу ліпіду при
нульовому поверхневому тиску (S0); енергетичні коефіцієнти, які
відповідають взаємодіям субфаза-субфаза, субфаза-ліпід та ліпід-ліпід
(Н11, Н12 та Н22, відповідно) і зміни вільної енергії на межі розділу
субфаза-повітря ((G), які виникають при появі ліпіду.
Для досліджень були вибрані характерні представники двох класів
біорегуляторів: активатор в-адренорецепторів ізадрин, блокатор
(2-адренорецепторів йохімбін, (1-адреноблокатор празозин,
М-холіноблокатор атропін, блокатор Н1-гістамінових рецепторів димедрол,
дигідропіридиновий блокатор кальцієвих каналів ніфедипін, агоніст
А1-аденозинових рецепторів теофілін – стереотип дії +I/–II; та
антагоніст (-адренорецепторів пропранолол, протидіабетичний препарат
толбутамід, (2-адреностимулятор клонідин, активатор (1-адренорецепторів
мезатон, агоніст М-холінорецепторів карбахолін, імуностимулятор
левамізол – стереотип дії –I/+II (рис. 1).
Вплив модуляторів аденілатциклазної та Ca-мобілізуючої
поліфосфоінозитидної сигнальних систем клітини на моношарові плівки з
ДСФХ. Результати аналізу ізотерм стискування моношарів з ДСФХ під
впливом досліджених біорегуляторів наведені в табл. 1.
Таблиця 1
Вплив досліджених ФАР на структурні та термодинамічні параметри
моношарів з ДСФХ
Сполука S0, (2/мол. Н11, кал. Н12, кал. Н22, кал. (G, кал.
Буфер 64(1 44(4 -50(1 -399(13 -25(1
Буфер + ДМСО 65(1 47(3 -59(2* -453(20* -29(1
Ізадрин 70(1* 37(3 -72(2* -477(3* -40(2*
Теофілін 65(3 44(4 -53(6 -409(12 -31(1*
Йохімбін+ДМСО 75(2** 22(2** -86(4** -486(12** -51(3**
Празозин+ДМСО 66±3 27±9** -78±10** -473±25 -47±8**
Атропін 68(4 32(7* -66(10* -428(26 -36(8
Димедрол 67(4 35(2* -65(8* -432(30 -35(5*
Ніфедипін+ДМСО 60(1** 23(4** -37(1** -259(16** -20(1**
Пропранолол 64(1 35(2* -63(4* -465(18* -32(3*
Толбутамід 61(1* 41(1 -45(3* -362(20* -22(2
Клонідин 64(1 41(3 -63(2* -444(8* -33(2*
Мезатон 62(2 43(6 -45(8 -371(14* -22(6
Карбахолін 65(1 50(3 -59(2* -457(15* -28(1
Левамізол 64(2 44(10 -56(4* -426(20 -29(4
Значення достовірно (рТаблиця 2 Вплив досліджених ФАР на фізико-хімічні параметри моношарів з ДСФХ при 25 та 30(С Сполука Темпе-ратура, (С S0, Е2/мол. Н11, кал. Н12, кал. Н22, кал. (G, кал. Буфер (Трис–HCl, pH 7,4) 25 64(1 40(4 -69(7 -453(15 -32(4 30 67(1 41(3 -83(2 -495(6 -42(2 Буфер (Трис–HCl + ДМСО, pH 7,4) 25 62(1 47(4 -75(3 -483(3 -36(2 30 67(1 32(1* -81(2 -461(5 -43(1 Ізадрин 25 65(1 34(3 -72(5 -462(15 -40(2* 30 70(1* 27(2* -89(6 -463(10* -48(3* Теофілін 25 64(1 35(4 -84(7* -486(19 -44(3* 30 69(1 28(2* -86(7 -470(23 -47(5 Йохімбін+ДМСО 25 63(2 38(4** -73(2 -445(13 -37(1 30 71(1** 22(1** -77(2 -407(5** -42(1 Празозин+ДМСО 25 69(2** 29(5** -79(8 -459(26 -45(6** 30 72(2** 23(2** -85(3 -412(7** -40(2 Атропін 25 65(1 38(2 -81(3* -468(6 -41(2* 30 69(1 32(4* -90(1* -498(11 -49(1* Димедрол 25 65(1 25(3* -77(1 -419(5* -42(2* 30 69(3 26(2* -84(9 -452(23* -46(6 Ніфедипін+ДМСО 25 58(4 31(3** -84(8 -458(16 -44(5** 30 63(3 20(4** -72(9 -393(24** -39(6 Пропранолол 25 66(3 38(4 -68(12 -457(24 -34(7 30 70(4 37(5 -82(11 -498(31 -45(8 Толбутамід 25 63(4 35(3 -64(9 -416(24 -33(5 30 66(3 36(4 -76(10 -451(27* -44(7 Клонідин 25 63(2 41(3 -69(5 -450(18 -33(4 30 66(2 41(2 -83(3 -486(13 -43(3 Мезатон 25 66(2 46(5 -61(7 -428(14 -37(3 30 65(1 39(3 -79(3 -484(22 -41(2 Карбахолін 25 62(2 35(5 -70(6 -449(27 -32(4 30 64(2 35(6 -85(9 -490(28 -42(6 Левамізол 25 67(1 39(4 -75(6 -467(23 -37(4* 30 67(2 37(4 -84(5 -507(29 -45(3 Значення достовірно (рЗначний вплив на площу, що припадає на одну молекулу ліпіду, при 20°С виявлено для ізадрину та йохімбіну. Це свідчить про зміну щільності спакування ліпідного моношару завдяки вбудовуванню молекул ФАР між молекулами ДСФХ. Можна припустити, що атропін, димедрол та празозин взаємодіють з фосфоліпідною плівкою схожим чином: в моношар вбудовуються незаряджені угрупування, тоді як з залишками фосфохоліну взаємодіють групи, що можуть нести частковий заряд. На противагу решті ФАР, під впливом ніфедипіну відбувається зменшення значень обчислених параметрів, можливо, внаслідок дегідратації молекул ДСФХ. За природних умов біологічні мембрани теплокровних тварин існують при більш високій, ніж 20°С, температурі. Тому було досліджено вплив ФАР на моношарові плівки з фосфоліпідів при підвищених температурах, що дозволяє збільшити рідинність плівки та наблизити стан модельної мембрани до фізіологічних (температурних та в’язкорідинних) умов існування ліпідного бішару плазматичних мембран. Результати впливу ФАР на структурні та термодинамічні характеристики ліпідного моношару при різних температурах наведені у табл. 2. Суттєва зміна обчислених параметрів виявлена для ізадрину. При підвищенні температури відбувається розрідження плівки, внаслідок чого відбувається краще вбудовування в моношар гетероциклічних груп празозину. Знову треба відмітити зменшення значень параметрів ліпідних плівок під дією ніфедипіну. Для деяких ФАР (йохімбін, празозин, димедрол та теофілін) підвищення температури призводить до посилення їх впливу на фосфоліпідну плівку, тоді як дія пропранололу, клонідину, карбахоліну послаблюється. Таким чином, значний вплив на обчислені параметри ліпідних моношарів з ДСФХ за різних температур виявлено, головним чином, для ФАР, що інгібують фосфоліпідну та/або активують аденілатциклазну сигнальні системи (найбільш сильний – для ізадрину, йохімбіну, празозину, атропіну та ніфедипіну). Вплив модуляторів ОССК на моношарові плівки з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ. Поряд зі зміною температури, рідинність мембранних ліпідів можна змінювати шляхом зміни складу фосфоліпідної фази. Введення ДМФХ до складу моношару з ДСФХ дозволяє збільшити рідинність моношарової плівки, що наближає стан модельної мембрани до значень мікров’язкості, які характеризують ліпідний бішар плазматичних мембран ссавців. Температура фазового переходу ДМФХ становить 23(С, тому при більш високій температурі моношар, до складу якого входить ДМФХ, є механічно нестійким, що унеможливлює дослідження плівок з суміші ліпідів при підвищених температурах. Результати впливу ФАР на моношарові плівки з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ наведені в табл. 3. Таблиця 3 Вплив досліджених ФАР на параметри моношарів з еквімолярної суміші ДСФХ та ДМФХ Сполука S0, (2/мол. Н11, кал. Н12, кал. Н22, кал. (G, кал. Буфер 72(1 19(1 -32(1 -383(7 -27(1 Буфер + ДМСО 71(2 21(2 -30(2 -340(15 -24(2 Ізадрин 73(1 19(1 -38(1* -501(13* -36(1* Йохімбін+ДМСО 72(2 9(1** -29(2 -421(23** -31(2 Празозин+ДМСО 75(3 11(2** -32(6 -497(43** -35(5 Атропін 72(1 9(2* -36(3 -537(46* -38(4* Димедрол 76(2* 16(1* -33(1 -432(7* -31(1* Ніфедипін+ДМСО 71(2 8(1** -29(3 -434(36** -32(3 Пропранолол 76(3 16(2 -34(4 -408(15* -29(4 Теофілін 71(1 20(1 -31(1 -360(6* -26(3 Толбутамід 71(1 18(1 -32(1 -396(13 -28(1 Клонідин 72(2 18(2 -30(4 -415(20 -26(3 Мезатон 70(2 19(2 -31(4 -367(12 -30(3 Карбахолін 73(2 20(3 -32(5 -368(16 -26(4 Левамізол 74(1 22(3 -33(2 -363(7 -27(1 Значення достовірно (р? " $ O 2 – //////////////////eeeeeeeee ?????????? ????? ?1???????????1???????1???????????1?????????? ?????????? ???????? ?? s/essss/e/eOCOO»OO?F `„?a$ `„?a$ `„?a$ M Теофілін 3100(30 271(14* -457(17 -2610(20* -460(9 Йохімбін+ДМСО 3330(20** 234(14** -388(7** -2500(20** -482(9** Празозин+ДМСО 3370(20** 282(15** -413(8 -2550(30** -482(6** Атропін 3140(20 252(8* -456(5 -2880(10* -529(7* Димедрол 3100(20 260(23* -462(11 -2770(20 -460(12 Ніфедипін+ДМСО 3665(30** 267(4** -458(9** -2571(24** -505(6** Пропранолол 2880(10* 277(11* -449(8 -2770(20 -476(6* Толбутамід 3120(20 282(11 -451(8 -2620(20* -481(9* Клонідин 3090(10 301(10 -460(9 -2690(20 -470(11 Мезатон 2940(10* 299(7 -438(7* -2690(20 -482(5* Карбахолін 3020(10* 288(7 -443(6 -2710(20 -460(12 Левамізол 3180(30* 310(9 -460(6 -2350(30* -479(4* Значення достовірно (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
