.

Моделювання ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі гіпокампу та вивчення нейропротекторної дії l-фенілаланіну (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
154 2513
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

МАЛЯРЕВСЬКИЙ ПАВЛО ЮРІЙОВИЧ

УДК 612.822:616-005.4:57.086.83

Моделювання ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі
гіпокампу та вивчення нейропротекторної дії l-фенілаланіну

14.03.04 – Патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

КИЇВ 2006 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитології Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук,

Скибо Галина Григоріївна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

завідувач відділом цитології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

членкор НАН України та

АМН України

Рєзніков Олександр
Григорійович

Інститут ендокринології та

обміну речовин
ім. В.П.Комісаренко

доктор медичних наук, професор

Ткачук Світлана Сергіївна,

Буковинський державний медичний

університет МОЗ України,

завідувач кафедри фізіології

Провідна установа: Національний медичний університет
ім. О.О.Богомольця МОЗ України , кафедра патологічної фізіології

Захист відбудеться “___”_____________2006 р. о “___” годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24,
вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “___”_____________2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Мозковий інсульт є одним з найважчих захворювань в
усіх країнах світу. Згідно з даними ВООЗ, він щорічно уражує в світі
біля 20 млн. людей, з яких 5 млн. вмирають внаслідок цієї патології. В
Україні, за даними Центру медичної статистики МОЗ, щорічно реєструються
біля 120 тис. інсультів. Рівень смертності від цієї хвороби в економічно
розвинутих країнах становить 50-100 випадків на 100 тис. населення за
рік, в Україні ця цифра в 2,3 рази більша. Досі не знайдені ефективні
засоби корекції нейродегенеративних станів, спричинених ішемією мозку,
що визначає очевидну потребу у розробці нових фармакологічних
препаратів. При дослідженні специфічних особливостей реакцій нервових
клітин на ішемічне пошкодження та вирішенні складних питань виявлення
тонких механізмів його патологічної дії на клітинному та молекулярному
рівні, широко використовуються моделі in vitro, тобто дослідження, що
проводяться на ізольованих органах, тканинах та клітинах (Harry G.J.,
1998).

Основними механізмами пошкодження нервової тканини при ішемії
вважаються: глутаматна ексайтотоксичність, порушення іонообміну в
клітинах, гіперактивація перекисного окиснення ліпідів. Вплив на ці
ланки патологічного каскаду є важливим напрямком в розробці
нейропротекторів. Найбільш перспективними вважаються речовини, які
впливають на розвиток ураження нервових клітин декількома шляхами
(Culmsee C., 2004; Kagiyama, 2004; Yam P.S., 2000; Akins P.T., 2002).
Зокрема, відомо про множинність дії ароматичних амінокислот, і саме,
L-фенілаланіну. Електрофізіологічні дослідження, проведені на
дисоційованих культурах гіпокампу, показали, що в ішемічних умовах
L-фенілаланін здатний послаблювати вивільнення глутамату, бути
конкурентним антагоністом глутаматних рецепторів та, припустимо, має
антиоксидантні властивості (Glushakov., 2002, 2003; Kagiyama., 2004;
Yarotskyy., 2005). Однак невідомо, як L-фенілаланін впливає на
морфо-функціональний стан нейронів в умовах ішемічного ушкодження та
механізми його дії, що створює потребу додаткового вивчення впливу
L-фенілаланіну. Для вирішення цих питань слушним є моделювання
ішемічного ушкодження мозку за допомогою киснево-глюкозній депривації
(КГД) на органотиповій культурі гіпокампу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації
пов’язана з дослідженнями, які виконуються відділом цитології Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:

– пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що
обумовлюють збудливість клітин;

– дослідження молекулярних механізмів проявів функціонування геному, що
зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в
нормі та при патології (№ державної реєстрації 0102U002472).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було розробити модель
ішемічного ушкодження мозку in vitro та виявити нейропротекторну дію
L-фенілаланіну в цих умовах. Для досягнення цієї мети були поставлені
наступні завдання:

одержати органотипову культуру гіпокампу та охарактеризувати її
життєздатність та морфологічний стан;

розробити модель ішемічного ушкодження мозку на органотиповій культурі
гіпокампу та визначити критерії її оцінки;

вивчити деякі механізми, які задіяні у розвитку ішемічного ушкодження
мозку на органотиповій культурі гіпокампу;

вивчити дію L-фенілаланіну при моделюванні ішемічного ушкодження мозку;

вивчити окремі механізми дії L-фенілаланіну при моделюванні ішемічного
ушкодження на органотиповій культурі гіпокампу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексні
дослідження по вивченню морфо-функціонального стану культивованих зрізів
гіпокампу при КГД різної тривалості.

Розроблена система оцінки морфо-функціонального стану культивованих
зрізів гіпокампу за характеристикою їх життєздатності (вимірювання
кількості цитозольного ферменту лактатдегідрогенази, визначення
концентрації малонового діальдегіду в культуральному середовищі,
забарвлення клітин вітальним барвником трипановим синім) та
морфологічного аналізу органотипової культури гіпокампу.

Вперше запропоновано можливість застосування моделі короткотривалої КГД
на органотиповій культурі гіпокампу для вивчення механізмів
нейропротекторних властивостей хімічних речовин.

Вперше виявлено протекторний вплив ароматичної амінокислоти
L-фенілаланіну в дослідах на органотиповій культурі гіпокампу в умовах
КГД.

Вперше продемонстровано, що L-фенілаланін здійснює свою нейропротекторну
дію при ішемічному ушкодженні на органотиповій культурі гіпокампу за
рахунок своїх антиглутаматних властивостей.

Вперше показано, що в умовах короткотривалої КГД на моделі органотипової
культури гіпокампу у пошкодженні клітин задіяні вільно-радикальні
механізми, а механізм протективного впливу L-фенілаланіну пов’язаний з
його антиоксидантною дією.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження мають
фундаментальне значення для поглиблення відомостей про ішемічне
ушкодження мозку. В прикладному аспекті одержані дані вказують на
наявність нейропротекторних властивостей у L-фенілаланіну, розширюють
уяву про механізми його дії на клітини гіпокампу та припускають
потенційну можливість використання ароматичних амінокислот у медичній
практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведені
науковий пошук та обґрунтування вибраного напрямку досліджень.
Розроблена модель для тестування та вивчення механізмів дії
різноманітних хімічних речовин при ішемічному ушкодженні мозку. Виконані
експерименти по вивченню дії L-фенілаланіну в умовах моделювання
ішемічного ушкодження мозку. Проведено аналіз одержаних результатів.
Виявлені антиглутаматний та антиоксидантний механізми дії
L-фенілаланіну. Експериментальна робота по культивуванню органотипової
культури гіпокампу проведена спільно з співробітниками відділу цитології
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації слухали
та обговорювали на: 2nd INMED (The Mediterranean institute of
neurobiology) сonference (La Ciotat (France), 2003); VI Міжнародній
науково-практичній конференції морфологів України (Львів, 2004);
науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження
М.І.Зазибіна (Київ, 2004); IBRO (international brain research
organization) advanced school of neuroscience (Ялта, 2004); 8-th ECNP
(European college of neuropharmacology) Regional meeting (Moscow, 2005);
науковій конференції молодих вчених присвяченої пам’яті академіка
В.В.Фролькіса (Київ, 2005); 5th international symposium on experimental
and clinical neurobiology (Tatranska Lomnica, 2005).

Публікації. Результати дисертації викладені в 11 публікаціях: статті –
5, тези конференцій, симпозіумів – 6.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація викладена на 125 сторінках і
містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і
методів досліджень, розділ результатів досліджень, аналізу і
узагальнення результатів дослідження, висновки та список використаних
джерел. Робота ілюстрована 18 рисунками, серед яких 7 мікрофотографій.
Перелік використаної літератури включає 176 посилання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для отримання зрізів гіпокампу використовували щурів 7-денного віку.
Після декапітації, гіпокамп обережно видаляли та перекладали в
попередньо охолоджене середовище виділення. Далі робили перпендикулярні
зрізи гіпокампу використовуючи спеціальний прилад для нарізання
тканинних зрізів – чопер (McIlwain tissue chopper, Англія). Товщина
зрізів становила 300-400 мкм. За допомогою обрізаної пастерівської
піпетки зрізи переносилися до чашки Петрі з середовищем виділення. Під
візуальним контролем за допомогою мікроскопа ретельно відбиралися зрізи,
що не мали ніяких ознак ушкодження для подальшого культивування.
Культивування проводили у 6-лункових планшетах, використовуючи додатково
спеціальні вкладиші з проникною мембраною, яка забезпечує проходження
через неї розчинних речовин. Один мілілітр середовища культивування (50%
МЕМ, 25% збалансованого сольового розчину Хенкса, 25% інактивованої
кінської сироватки, рН 7.3) додавався в кожну лунку. Стерильні проникні
вкладиші діаметром 30 мм та з розмірами пор 0,4 мкм (Millicell-CM,
Millipore) були розташовані в кожній лунці та змочувалися середовищем
культивування. Планшет залишали в СО2 інкубаторі (суміш атмосферного
повітря з 5% СО2) не менш ніж на 1 годину для стабілізації температури
(37?С) та рН середовища культивування, до того часу, коли на них будуть
розташовані зрізи. Середовище культивування змінювалось наступного дня
та надалі двічі на тиждень. Розвиток культивованих зрізів контролювався
з допомогою інвертованого світлового мікроскопа Zeiss Telaval 31. На
12-14 день зрізи були готові для проведення експерименту(Stoppini, 1991;
Fedoroff S., 2001).

Для моделювання ішемічних умов використовували киснево-глюкозну
депривацію (КГД), яка створювалась у спеціальній камері, де газове
середовище містило 95 % азоту (N2) і 5 % СО2, а рідке середовище – HBSS
(H-8264, Sigma), 12,5 ммоль Hepes (Cat. 15630-056, Gibco) з додаванням
сахарози (15 ммоль D-сахарози, AppliChem) замість глюкози (сахароза не
може бути використана нервовими клітинами для енергетичних потреб, але
утримує осмолярність розчину). Температура підтримувалась на рівні
+35оС. Після необхідного періоду КГД (10, 30 та 60 хвилин) зрізи
поверталися до нормальних умов культивування в середовище для
експерименту на 1, 4 або 24 години (нормоксична реоксигенація).

Загальну життєздатність культивованих зрізів гіпокмапу оцінювали за
зміною кількості лактат-дегідрогенази (ЛДГ) у культуральному середовищі
колориметричним методом за допомогою kit G1780 (“Promega”, USA). Зміни
кількості ЛДГ у культуральному середовищі виражали в % від максимального
пошкодження клітин органотипової культури гіпокампу. Для визначення
максимального пошкодження клітини культивованих зрізів гіпокампу
лізували, розміщуючи їх на 10 хвилин в чашці Петрі з 1 мл лізуючого
розчину, який входить до складу kit G1780. Для дослідження відбирали 50
мкл культурального середовища.

Життєздатність нейронів СА1 зони гіпокампу оцінювали за методом
виключення вітального барвника трипанового синього (Noraberg J., 1999).
Кількість забарвлених клітин підраховували у СА1 ділянці в межах
прямокутної зони фіксованого розміру.

Активність перекисного окислення ліпідів оцінювали по накопиченню в
культуральному середовищі одного з його кінцевих продуктів – малонового
діальдегіду (МДА) – колориметричним методом в мікромодифікації. Зміни
кількості МДА у культуральному середовищі виражали в одиницях екстинції.

Для морфологічної оцінки культивовані зрізи, зафіксовані у суміші 2,5%
формальдегіду та 2,5% глютаральдегіду, заключали у епоксидну смолу за
загальноприйнятою методикою. Напівтонкі зрізи (1-2 мкм завтовшки)
забарвлювали метиленовим синім. Морфологічний аналіз проводили за
допомогою світлового мікроскопу Zeiss Jena (збільшення Ч1000).
Підраховували кількість нормальних, конденсованих та набряклих нейронів
у СА1 зоні культивованих зрізів гіпокампу з розрахунку сто клітин на
кожний зріз.

Статистичну обробку даних проводили за t-критерієм Стьюдента,
відмінності вважалися достовірними при p?EI j?

¦

?????????????$?U-74389G ці показники становили 7,6±1,4% (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020