.

Підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини за допомогою cрg днк з bacillus subtilis (експериментальні дослідження) (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
134 3327
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є.
КАВЕЦЬКОГО

ОЛІШЕВСЬКИЙ СЕРГІЙ ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК: 616-006-085:615.371:612.017.1:57.084

Підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини за
допомогою cрg днк з bacillus subtilis (експериментальні дослідження)

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

завідувач відділу ензимології пухлин

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, професор

Воронцова Ада Леонідівна,

провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних
систем Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

– кандидат біологічних наук

Бендюг Галина Дмитрівна,

старший науковий співробітник відділу клінічної імунології Інституту
онкології АМН України.

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “25” квітня 2007 року о 15 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
(03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького
НАН України.

Автореферат розісланий “___” березня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н.В. БородайЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
РОБОТИ

Актуальність проблеми. Незважаючи на стрімкі успіхи в галузі біології та
медицини, лікування онкологічних хворих все ще залишається далеко
невирішеною проблемою. Традиційні підходи до лікування досить часто, на
жаль, виявляються недостатньо ефективними і супроводжуються значними
побічними ефектами, що спричиняє постійний пошук додаткових засобів і
стратегій, спрямованих на більш ефективне лікування. У наш час
інтенсивно розробляється і впроваджується у клінічну практику
вакцинотерапія – один з перспективних напрямків імунотерапевтичного
лікування хворих на злоякісні новоутворення (Шляховенко В.А., 2000; Finn
O.J., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004; Потебня Г.П. и соавт., 2004;
Шляховенко В.О., Мосієнко В.С., 2006; Dalgleish A.G., 2006). Однак,
низька імуногенність більшості антигенів пухлинних клітин, а також поява
і накопичення в організмі онкологічного хворого низки порушень
регуляторних і ефекторних систем імунобіологічного нагляду зумовлюють
необхідність пошуку шляхів підвищення ефективності протипухлинних
вакцин, яке здійснюється шляхом різноманітних модифікацій пухлинних
антигенів, використання штучних генних конструкцій та різноманітних
ад`ювантів (Vogel F.R., 1995; McCluskie M.J., Weeratna R.D., 2001;
Коростелев С.А., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004; Stevenson F.K.,
2005). Саме цій проблемі присвячена дана робота, яка мала за мету
розробку нового ад`юванта на основі ДНК бактеріального походження та
дослідження його імунобіологічних і протипухлинних властивостей як при
самостійному застосуванні, так і у поєднанні з протипухлинною
глікопептидною вакциною. Такий підхід до проблеми виглядає тим більше
обґрунтованим, що імуномодулюючі ефекти бактеріальної ДНК вже були
доведені групою японських (Tokunaga T. et al., 1984, 1999; Yamamoto S.
et al., 1992) та американських (Krieg A.M. et al., 1995; Krieg A.M.,
2001) дослідників. На думку останніх саме CG-динуклеотиди з
неметильованим цитозином є відповідальними за потенційні імуностимулюючі
властивості ДНК.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Робота виконана
у відділі ензимології пухлин Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у
відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, за темами:
„Розробити нові підходи до підвищення ефективності протипухлинних
вакцин” (2001–2003 рр., державний реєстраційний № 0101U000784);
„Визначення ролі ад’ювантів та імуномодуляторів в реалізації дії
протипухлинних вакцин” (2004–2006 рр., державний реєстраційний №
0104U000589) та „Особливості функціонування онкогеному” (2002–2006 рр.,
державний реєстраційний № 0102U003228).

Фрагмент роботи, присвячений дослідженню інтерфероногенної активності
бактеріальної ДНК, проводився у комплексі з лабораторією контролю якості
імунобіологічних препаратів Київського науково-дослідного інституту
епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського АМН
України за темою: „Вивчити молекулярно-біологічні особливості збудників
опортуністичних інфекцій бактеріальної природи, стійких до антибіотиків,
у хворих на СНІД” (2002–2004 рр., державний реєстраційний №
0102U000571).

Робота була частково підтримана стипендією від Всесвітньої Федерації
Вчених (Лозанна, Швейцарія, 2006–2007 рр.).

Мета дослідження. Створення і дослідження нового ад`юванта для
підвищення дії протипухлинної глікопептидної вакцини та визначення його
імуномодулюючих і протипухлинних властивостей.

Задачі дослідження.

Виділити бактеріальну ДНК з культуральної рідини Bacillus subtilis та
охарактеризувати її молекулярно-біологічні особливості.

Дослідити імунобіологічні ефекти бактеріальної ДНК з культуральної
рідини B. subtilis, збагаченої неметильованими СpG-мотивами.

Визначити протипухлинну і антиметастатичну ефективність CpG ДНК з
культуральної рідини B. subtilis на різних експериментальних моделях
злоякісного росту.

Експериментально обґрунтувати можливість підвищення ефективності
протипухлинної глікопептидної вакцини шляхом застосування ад`юванта,
створеного на основі бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини B.
subtilis.

Об`єкт дослідження. Бактеріальна ДНК, збагачена неметильованими
СpG-мотивами, протипухлинна глікопептидна вакцина.

Предмет дослідження. Імунологічні та протипухлинні ефекти бактеріальної
CpG ДНК і можливість її використання в якості самостійного
протипухлинного засобу або в якості ад`юванта з протипухлинною
глікопептидною вакциною.

Методи дослідження. Мікробіологічні – культивування бактерій B. subtilis
і Staphylococcus aureus; молекулярно-біологічні і біохімічні – виділення
і очистка ДНК, вивчення її молекулярно-біологічних особливостей;
імунологічні – визначення функціональної активності природних кілерних
клітин і перитонеальних макрофагів, дослідження розвитку імунної
відповіді на гетерологічний антиген і цитолітичної активності сироватки
крові; вірусологічні – визначення продукції інтерферону; цитологічні –
вивчення загальної клітинності органів імунної системи; біофізичні –
дослідження поверхневого потенціалу імунокомпетентних клітин; методи
використання експериментальних модельних систем пухлинного росту;
статистичні методи.

Наукова новизна. Вперше досліджені особливості накопичення позаклітинної
ДНК у культуральній рідині в процесі культивування B. subtilis
GP1-807-03 і вивчені особливості її збагачення на неметильовані
CG-динуклеотиди. На основі цієї ДНК створено новий ад`ювант, виявлені
його протипухлинні, антиметастатичні та імуномодулюючі властивості. В
експериментальних дослідженнях in vivo доведена ефективність
застосування бактеріальної CpG ДНК в якості самостійного протипухлинного
засобу та в якості ад`юванта з протипухлинною глікопептидною вакциною.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано експериментальне
обґрунтування доцільності застосування неметильованої CpG ДНК, виділеної
з культуральної рідини B. subtilis, в якості ад`юванта з самостійною
протипухлинною активністю, який здатний підвищувати ефективність
вакцинотерапії.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто була сформульована мета
роботи, поставлені основні завдання і налагоджені методи дослідження.
Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою
дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз
первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних і
сформульовано основні наукові положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на: Науково-практичній конференції „Проблеми
онкоімунології: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2003); Conference
for young scientists, PhD students and students of molecular biology and
genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA
and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics,
NAS of Ukraine (Kyiv, 2003); VI конференції молодих онкологів України
„Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ,
2003); V українській конференції молодих вчених,
присвяченій пам`яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); First
(Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004);
Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология –
наука ХХI века” (Пущино, Россия, 2004); ІІІ съезде онкологов и
радиологов СНГ (Минск, Беларусь, 2004); І Всеукраїнській
науково-практичній конференції „Вітчизняні протипухлинні препарати:
аналіз сьогодення та погляд в майбутнє” (Київ, 2004); доповіді на бюро
відділення молекулярної біології, біохімії, експериментальної і
клінічної фізіології Національної академії наук України (Київ, 2005);
Першій Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ
біології” (Львів, 2005); Міжнародному форумі “Основи
молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля” (Київ, 2005);
16th European Students` Conference Charite (Berlin, Germany, 2005);
Международной школе-конференции молодых ученых “Системная биология и
биоинженерия” (Москва, Россия, 2006); ІІ науково-практичній конференції
молодих вчених та спеціалістів „Актуальні проблеми фармакології та
токсикології” (Київ, 2005); VII конференції молодих онкологів України
„Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ,
2005); ХІ з`їзді онкологів України (Судак, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 24 наукових праці: 8
статей у провідних фахових виданнях і 15 тез; отримано 1 деклараційний
патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 3-х
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів
дослідження, висновків і списку використаних літературних джерел, який
включає 297 найменувань, у тому числі 256 – англійською мовою. Основний
зміст дисертації викладений на 183 сторінках машинописного тексту,
містить 33 рисунки та 27 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Представлені у роботі дані одержані на
експериментальному матеріалі. У дослідженнях використовували мишей
чистих ліній (BALB/c, С57Bl/6, CBA), гібридних мишей BDF1 і нелінійних
мишей (загальна кількість – 916 тварин), які були отримані з розплідника
віварію ІЕПОР НАН України. Утримання мишей та робота з ними проводилися
у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт
з експериментальними тваринами.

Для створення експериментальних модельних систем злоякісного росту були
використані штами пухлин, одержані з Національного банку культур тканин
ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, зокрема саркома 37, саркома 180,
карцинома Ерліха, карцинома легені Льюїс, меланома В16 і лімфоїдна
лейкемія L1210. Перебіг пухлинного процесу характеризували за
стандартними показниками: частота прищеплюваності пухлин; середня
тривалість життя (СТЖ) мишей; об`єм (у мм3) і маса (у г) пухлинного
вузла; частота та інтенсивність метастазування; швидкість росту
метастазів. Для оцінки протипухлинного ефекту розраховували гальмування
росту пухлини (ГРП) і збільшення тривалості життя (ЗТЖ) (Трещалина Е.М.,
2005).

У роботі було використано два штами бактерії Bacillus subtilis (B.
subtilis 7025 і B. subtilis GP1-807-03), з культуральної рідини (КР)
якої було ізольовано ДНК-вмісні фракції за стандартною схемою виділення
плазмідної ДНК із застосуванням поліетиленгліколю 6000 з подальшою
преципітацією у 70% етанолі (Маниатис Т. и соавт., 1984). Концентрацію
ДНК визначали за допомогою спектрофотометра СФ-26 („ЛОМО”, СРСР) при
довжині хвилі 260 нм, ступінь чистоти зразка ДНК – за співвідношенням
оптичної густини 260 та 280 нм. Температуру плавлення ДНК визначали
згідно (Зенгер В., 1987). Визначення якості та встановлення розміру
молекул ДНК, а також ідентифікацію білків здійснювали за допомогою
електрофорезу у вертикальних пластинах поліакриламідного гелю (ПААГ) з
використанням 0,1% додецилсульфату натрію (Остерман Л.А., 1983). Для
визначення присутності неметильованих CG-динуклеотидів у складі
бактеріальної ДНК застосовували рестрикційний аналіз з ендонуклеазою
НраІІ (“Sigma”, США) (Sun S., 1996). Результати дії ендонуклеази НраІІ
реєстрували за допомогою імпульсного електрофорезу в агарозному гелі з
інверсією електричного поля (Elia M.C., 1991). Негативи знімків
електрофореграм аналізували за допомогою денситометра Chromoscan LKB
(Швеція). В якості негативного контролю у деяких тестах in vitro
використовували бактеріальну ДНК, оброблену ДНКазою І. Протипухлинна
глікопептидна вакцина (gp50) була отримана з клітин різних штамів пухлин
згідно (Шляховенко В.О. і співавт., 2004).

Визначення клітинності лімфоїдних органів і перитонеального змиву
проводили за стандартними методиками, використовуючи суправітальне
забарвлення трипановим синім. Функціональну активність перитонеальних
макрофагів (ПМФ) досліджували за здатністю останніх фагоцитувати і
перетравлювати бактеріальні клітини (Априкян В.С. и соавт., 2001), а
також у тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тесті). В якості
індуктора відновлення НСТ використовували форбол мирістат ацетат (ФМА;
“Sigma”, США) у концентрації 10 нг/мл. Для дослідження особливостей
генерування ПМФ супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту (NO) було
застосовано метод електронного парамагнітного резонансу (Lai C.-S.,
Komarov A.M., 1994; Buettner G.R., Mason R.P., 2003). В якості спінових
уловлювачів були використані
гідроксиламін-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидин (Інститут хімічної
фізики, РАН, Росія) – для визначення супероксидних радикал-аніонів, і
диетилдитіокарбамат (“Sigma”, США) – для визначення NO. Цитолітичну
активність природних кілерних клітин (ПКК) вивчали в тесті
неспецифічного цитолізу in vitro: в якості клітин-мішеней
використовували клітини асцитної карциноми Ерліха, співвідношення між
пухлинними клітинами (ПК) і ПКК складало 1 : 3. Перед проведенням
цитолітичного тесту ПКК або ПК преінкубували (2 год при 37?С) з
бактеріальною CpG ДНК у концентрації 0,1 і 1,0 мкг/мл або з розчином ФМА
(“Sigma”, США) – 250 нг/мл; інкубація тривала 18 год; у тесті
суправітального забарвлення трипановим синім визначали кількість живих
ПК у контролі та досліді і розраховували цитолітичний індекс (Фільчаков
Ф.В. і співавт., 1997; Шпакова А.П. и соавт., 2000). Здатність
лейкоцитів периферійної крові здорових донорів продукувати інтерферон
(ІФН) визначали методом пригнічення цитопатогенної дії вірусу
везикулярного стоматиту у гомологічній культурі клітин А549 (Ho M.,
Enders J., 1959). В якості еталонного індуктора ІФН використовували
polyI:polyC (“Sigma”, США) у концентрації 10 мкг/мл. Клітинну імунну
відповідь характеризували за рівнем реакції гіперчутливості
уповільненого типу (РГУТ) на еритроцити барана (ЕБ) (Ильинская А.И. и
соавт., 2004). Цитолітичну активність (ЦЛА) сироватки крові мишей
визначали за методом (Брондз Б.Д., 1964) у модифікації згідно (Потебня
Г.П., 2003). Електрокінетичний потенціал імунокомпетентних клітин у
здорових мишей та мишей з пухлинами досліджували методом клітинного
електрофорезу (Богуславский Л.И., 1978; Иенсен Г.Л., 1979). Для
визначення середньоквадратичної похибки та достовірності отриманих даних
використовували комп`ютерну програму GraphPad Instat. Математичну
обробку результатів проводили з використанням критерію Стьюдента і
застосуванням тесту Стьюдента-Ньюмена-Кельса чи тесту Даннета.
Виживаність тварин аналізували за допомогою тесту Каплана-Мейєра.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виділення, фізико-хімічна характеристика та особливості накопичення
бактеріальної ДНК у культуральній рідині B. subtilis. З фільтрату КР B.
subtilis на 9-ту добу культивування були виділені чисті фракції ДНК з
коефіцієнтом 260/280 – 1,75–1,85. Вихід ДНК при цьому становив у
середньому 1,0–1,5 мг на 100 мл КР B. subtilis GP1-807-03 і близько
0,5–0,8 мг на 100 мл КР у випадку B. subtilis 7025. Температура
плавлення ізольованої ДНК становила 92,5?С, гіперхромний ефект – 32%;
вміст GC- і АТ-пар – 56,6 і 44,4 моль% відповідно. За допомогою
електрофорезу у ПААГ показано, що фракції ДНК, виділені з КР на 9-ту
добу культивування обох штамів B. subtilis, є подібними і містять два
найбільш виражені і постійні компоненти з величиною молекул 2650 та 3050
пар нуклеотидів (рис. 1).

Результати, наведені на рис. 2, свідчать, що позаклітинна ДНК
накопичувалась у КР досить нерівномірно і це залежало від тривалості
культивування бактерії. Найбільший вміст бактеріальної ДНК у КР B.
subtilis GP1-807-03 (0,90–1,55 мг/100 мл КР) спостерігався на 6 і 9-ту
добу культивування, зі значеннями коефіцієнта 260/280 – близько
1,75–1,85; при цьому в отриманих фракціях у жодному з випадків
присутність білків на електрофореграмах не реєструвалась.

Встановлено, що ДНК-вмісні фракції, ізольовані з КР B. subtilis штамів
7025 і GP1-807-03 на 9-ту добу культивування, виявляли досить високу
чутливість до дії НраІІ, що свідчить про відносно високий вміст
неметильованих CG-динуклеотидів у їх складі. На рис. 3 показано, що ДНК
хребетних (у даному випадку – ДНК з еритроцитів курчати), яка за даними
літератури має невисокий вміст CG-динуклеотидів і гіперметильована за
залишком цитозину (Krieg A.M., 1995; Pisetsky D.S., 1996), є відносно
стійкою до дії НраІІ, порівняно з досліджуваною ДНК з КР B. subtilis
GP1-807-03.

Всі фракції ДНК, отримані з КР протягом 10 діб культивування B. subtilis
GP1-807-03, виявились досить чутливими до дії НраІІ, однак найбільша
чутливість ізольованої бактеріальної ДНК до НраІІ, а отже і збільшення
вмісту неметильованих CG-динуклеотидів у її складі, спостерігалися на
7–9-ту добу культивування. Гідроліз ДНК під дією ферменту становив
85–95% (рис. 4).

Таким чином, оскільки ступінь метилювання бактеріальної ДНК був
визначений як один з вагомих критеріїв відбору фракцій ДНК з метою
подальшого імунотерапевтичного застосування, за результатами даних
досліджень для отримання бактеріальної ДНК з КР B. subtilis можна
рекомендувати 7–9-ту добу культивування бактерії.

Імунобіологічні властивості бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини
B. subtilis. Незважаючи на те, що бактеріальна ДНК, збагачена
неметильованими CpG-мотивами, має плейотропний імуностимулюючий ефект, у
даному дослідженні доцільним було насамперед вивчити вплив CpG ДНК з КР
B. subtilis на показники неспецифічного імунітету, такі як
функціональна активність ПМФ і ПКК та інтерфероногенез. Важливо було
також з`ясувати вплив бактеріальної CpG ДНК на формування в організмі
специфічної імунної відповіді, зокрема реакції імунної системи на
введення гетерологічного тимус-залежного антигену і реакції
комплемент-залежної цитотоксичності сироватки крові мишей.

У результаті проведених досліджень, встановлено, що одноразове підшкірне
введення мишам лінії BALB/c бактеріальної CpG ДНК у дозі 5,0 мг/кг маси
тіла призводило до розвитку транзиторної гіперплазії лімфатичних вузлів
(л/в) (рис. 5), яка проявлялася у збільшенні маси і клітинності
відповідаючого підколінного л/в з максимумом на 8-му добу спостереження
(клітинність – (15,5±1,5)*106 клітин у порівнянні з (1,3±0,08)*106
клітин у контрольному л/в). Після одноразового внутрішньочеревного
введення бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis у мишей cпостерігали
розвиток транзиторної спленомегалії (рис. 6). При цьому найвищі
показники спленічного індексу та клітинності селезінки також були
зафіксовані на 8-му добу спостереження і становили: спленічний індекс –
2,5±0,17, клітинність – (228,0±12,8)*106 клітин (pAei* n H ~ ? ‚ „ † ? ? ? ? ¦ Oe O AAAe* n ? [ [ [ „[ „Yo^„[ AE $ [ [ AE [ [ [ [ [ „Ae`„Ae • ???0????? ?? ?F??????????? ?? ?? C C †kd †kd* †kdE †kdue ;50 покращувало ефективність останньої. Показники СТЖ у групах тварин, яким вводили бактеріальну CpG ДНК і gp50 складали 65,6±11,4 і 65,3±22,8 діб (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020