ТАВРIЙСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ
IМ. В.I. ВЕРНАДСЬКОГО
ПАРФЬОНОВА ІРИНА ОЛЕКСАНДРIВНА
УДК 612.22:591.11:597.2/.5
Функціональний стан гемоглобіну й еритроцитів морських риб, стійких до
зовнішньої гіпоксії
Спецiальность 03.00.13 – Фізіологія людини i тварин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Сімферополь – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біохімії Таврійського національного
університету імені В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, профессор,
Коношенко Світлана Володимирівна,
Таврійський національний університет
iм. В. I. Вернадського,
завідувач кафедри біохімії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
Лущак Володимир Iванович,
Прикарпатський національний університет
iм. В. Стефаника,
завідувач кафедри біохімії
кандидат бiологiчних наук,
Мартынюк Виктор Семенович,
Київський нацiональний унiиверситет
iм. Т. Шевченка,
докторант кафедри бiофiзики
Провідна установа Iнститут фiзiологiї iм. O.O. Богомольца
НАН України
Захист відбудеться 14.12.2006 р. у ___13___годин на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 Таврійського національного
університету імені В.І. Вернадського (95007, Сімферополь, просп.
Вернадського, 4).
З дисертацією можна ознайомитись у біблотеці Таврійського національного
університету імені В.І. Вернадського (95007, Сімферополь, просп.
Вернадського, 4).
Автореферат розісланий 10.11.2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
Хусаїнов Д.Р.
кандидат біологічних наук
Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Кисень разом із температурою та солоністю є одним
із найважливіших чинників, що впливають на поширення організмів у
водному середовищі [Романенко, 2004]. Обмеження водообміну,
евтрофікація, пов’язана з антропогенним навантаженням на водойми, є
основними причинами, що призводять до виникнення зон стійкого дефіциту
кисню [Бордовський, Іваненков, 1979; Романенко, 2004]. Останнім часом це
явище вельми часто охоплює високопродуктивні шельфові зони Світового
океану, призводячи до якісної трансформації існуючих екосистем
[Виноградов, 1968; McEnroe et al., 1998; Kuharev, 1998; Duncombe-Rue et
al., 2000; Shulman et al., 2002]. Чорне море в такому контексті не є
виключенням. Зони стійкої придонної гіпоксії були порівняно нещодавно
виявлені на його північно-західному шельфі [Фесюнов, Назаренко,1991;
Берлінський, Диханов, 1991; Фащук та ін.,1991; Виноградов та ін., 1992;
Зуєв, 2000].
Спостереження, зроблені в Аденській затоці, в акваторіях
Каліфорнійського узбережжя та Західної Африки, дозволили багато в чому
переглянути попередні уявлення про необхідність присутності кисню у
водному середовищі для існування гідробіонтів [Виноградов, 1968; McEnroe
et al., 1998; Kuharev, 1998]. Виявлено, що значна кількість організмів,
у тому числі й оксифільні, здатні тривалий час знаходитись у середовищі
із залишковим вмістом кисню (менше 0.4 мл л-1).
Фізіологічним та біохімічним чинникам існування гідробіонтів в умовах
гострої гіпоксії приділяється пильна увага протягом останніх 30-ти років
[Waversveld et al., 1989 a,b; Савина, 1992; Shulman et al., 1998; 2002;
Shulman, Love, 1999; Lushchak et al., 2005; Lushchak, Bagnyukova, 2006
та ін.]. Особливу зацікавленість викликає вивчення стану систем
кисневого забезпечення організму, зокрема крові, функціональна
реалізованість яких в умовах гострої гіпоксії суттєво знижена.
Дослідження, проведені в означеному напрямку, дозволили виявити в крові
риб, стійких до зовнішньої гіпоксії, наявність гемоглобінів, які не
чутливі до рН [D’Avino et al., 1994; Pellegrini et al., 1995; Taiwo,
1995], а також володіють зворотним ефектом Бора в лужному діапазоні рН
[Fago et al., 1995; Feuerlein, Weber, 1996]. Досить несподівані реакції
були відзначені і на рівні циркулюючих ядерних еритроцитів: свелінг
клітин [Perry, Thomas, 1991], активізація трансмембранного Na+/H+-обміну
[Nikinmaa, 1991; Perry, Reid, 1992; Reid, Perry, 1994], збільшення
випадків амітотичного розподілу [Houston, Murad, 1995; Soldatov, 1996]
тощо. Однак загальна функціональна значущість виявлених змін залишається
до кінця не проясненою. Вивченню впливу водної гіпоксії на респіраторні
системи гідробіонтів й присвячена дійсна робота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження з
теми дисертаційної роботи проводилися на кафедрі біохімії Таврійського
національного університету ім. В.І. Вернадского (м. Сімферополь) і на
базі Інституту біології південних морів ім.О.О. Ковалевського НАН
України (м. Севастополь) протягом 2001-2004 р.р. Виконання роботи
здійснювалося в рамках держбюджетної теми: “Молекулярно-клітинні та
системні механізми дії чинників різної природи на живі системи”
(2001-2006 р.р., № держреєстрації 0101U005237).
Мета i завдання дослiдження. Мета дисертаційної роботи – дослідження
функціонального статусу компонентів гемоглобінової системи,
гематологічних характеристик та еритрограми циркулюючої крові в донних
риб, толерантних до гострого дефіциту кисню.
Для реалізації поставленої мети потрібно вирішити такі завдання:
Визначити в умовах експерименту критичні та межові концентрації кисню
для донних риб, стійких (бичок-кругляк, скорпена) та чутливих
(камбала-глосса; бички: мартовик, трав’яник) до дефіциту кисню.
Порівняти гематологічні, морфометричні та киснезв’язуючі властивості
циркулюючої крові риб різної толерантності до зовнішньої гіпоксії.
Дослідити в умовах експерименту вплив гіпоксії на гематологічні,
морфометричні та киснезв’язуючі властивості циркулюючої крові риб,
стійких до дефіциту кисню.
Вивчити гетерогенну систему гемоглобіну толерантних до гіпоксії риб та
визначити функціональні характеристики її окремих компонентів.
Оцінити окисну стійкість гемоглобінів риб (перехід у феррi-форму),
активність NADH2-дiафорази еритроцитів та стійкість кліток червоної
крові до осмотическому шоку в умовах нормоксії й експериментальної
гіпоксії.
Об’єкт дослідження: представники донної іхтіофауни Чорного моря:
скорпена (Scorpaena porcus L.), камбала-глосса (Platichthys flesus
luscus P.), бички: кругляк (Neogobius melanostomus P.), мартовик (Gobius
batrachocephalus P.), трав’яник (Gobius ophiocephalus P.).
Предметом дослідження є вивчення морфо-функціональних підстав адаптації
червоної крові низки донних риб Чорного моря до існування в умовах
гострого дефіциту кисню.
Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань було використано
комплекс фізіологічних (гематологічні дослідження, спектрофотометричні
методи побудови кривих оксигенації крові та гемоглобіну), біохімічних
(електорофорез білків у ПААГі, активність ферментів, значення
метаболітів та окисних модифікацій гемоглобіну), цитологічних
(світлооптична мікроскопія та цитометрія клітин крові) та статистичних
методів, а також методи моделювання гiпоксiї в умовах лабораторiї.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в умовах експериментальної
гіпоксії вивчено киснезв’язуючі властивості гемоглобіну та морфометричні
характеристики циркулюючої еритроцитарної маси чорноморських риб, що
живуть у гіпоксичних акваторіях Чорного моря.
Показано, що кров стійких до гіпоксії видів (бичка-кругляка, скорпени)
має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливістю до рН
(ефект Бора). Цi ознаки ставали ще яскравіше виражени в умовах
експериментальної гіпоксії. Вони визначалися властивостями гемоглобіну і
не залежали від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення
(концентрацій NTP, Mg2+).
Методом диск-електрофорезу в ПААГі досліджено гетерогенну систему
гемоглобіну риб, стійких до гіпоксії. Вперше виявлено компонент, якому
притаманні водночас висока спорідненістю до кисню та вираженість ефектів
Бора й Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в
умовах зовнішнього дефіциту кисню, що призводить до змін киснезв’язуючих
характеристик крові в цілому.
Вперше відзначено, що гемоглобін риб може легко переходити в окислений
стан (мет-форма) і за умов природного процесу оксигенації крові, і за
умов гіпотермії. На разі відбувається зниження стійкості еритроцитів до
осмотичного шоку. Таке явище визначається присутністю малоефективної
NADH2-діафорази в клітинах червоної крові риб, чутливих до умов
навколишнього середовища.
Вперше описано феномен росту обсягу ядер та збільшення ядерно-плазмових
відносин у зрілих еритроцитах риб за умов зовнішнього дефіциту кисню.
Практичне значення одержаних результатів. Морфологічні та цитометричні
реакції еритроцитарної маси на гіпоксію, одержані в дисертаційному
дослідженні, можуть бути використані при діагностиці гіпоксичних станів
риб у сучасному рибництві.
Одержані результати дозволяють скорегувати уявлення про причини, що
викликають розвиток метгемоглобінемії в риб при риборозведенні.
Показано, що в основі означеного стану може лежати не лише інтоксикація
організму нітритами та нітратами, але й чинники водного середовища, що
виходять за межі толерантності виду (гіпотермія).
Камбала-глосса є одним iз перспективних об’єктів сучасного рибництва.
Результати, отримані в дійсній роботі з респіраторних характеристик
крові даного виду, можуть бути використані при визначенні й уточненні
меж фізіологічних норм, які варто дотримувати в умовах штучного
риборозведення.
Теоретичні положення та практичні розробки дисертації можуть бути
використані при читанні курсів лекцій з фізіології та біохімії
адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб студентам
факультетів біологічного та рибогосподарського профілю.
Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно зібрано й
проаналізовано спеціальну літературу за темою роботи. Виконано всі
експериментальні дослідження, лабораторна обробка фізіологічних,
біохімічних проб та цитологічних препаратів. Проведено статистичний
аналіз отриманих результатів. Постановка мети та задач дослідження, а
також інтерпретація отриманих даних виконані при участі наукового
керівника і співавторів опублікованих робіт.
Апробація результатів дисертації. Результати дослідження, представлені в
дисертації, були повідомлені на 12-ти наукових конференціях: Конференції
молодих учених “Проблеми екології Азово-чорноморського басейну: сучасний
стан та прогноз. Понт-Евкінський II” (Севастополь, 2001); V Міжнародній
конференції “Водні екосистеми й організми” (Москва, 2003); Міжнародному
науковому семінарі “Особливості механізмів адаптації риб до чинників
середовища” (Феодосія, 2003); Міжнародній конференції “Сучасні проблеми
фізіології та біохімії водних організмів” (Петрозаводськ, 2004); I
З’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); XIX
З’їзді Фізіологічного товариства ім. І. П. Павлова (Росії)
(Єкатеринбург, 2004); VІІ Міжнародній науково-практичній конференції
студентів, аспірантів та молодих вчених “Екологія. Людина. Суспільство”
(Київ, 2004); I З’їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); IV З’їзді
гідроекологічного товариства України (Феодосія, 2005); Міжнародної
наукової конференції “Проблеми біологічної океанографії XXІ століття”
(Севастополь, 2006); 32, 33 науково-практичній конференції
професорсько-викладацького складу Таврійського національного
університету ім. В.І. Вернадського (Сімферополь, 2004; 2005).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них 6
– статті, опубліковані у провідних наукових фахових виданнях, 8 – тези
доповідей за матеріалами конференцій. Особистий внесок дисертанта у цих
роботах визначено й подано у списку публікацій автора в авторефераті.
Структура дисертації. Робота складається зі вступу, огляду літератури (4
розділи), матеріалів та методів досліджень (6 розділів), результатів
дослідження (4 розділи), обговорення (3 розділи), висновків, списку
використаних джерел. Робота викладена на 146 сторінках, містить 18
малюнків та 22 таблици. Список використаних джерел включає 300
найменувань (68 кирилицею, 232 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. У розділі охарактеризовано гіпоксичні акваторії
Світового океану та Чорного моря. Розглянуто причини виникнення цих зон,
їхнє поширення, описано стан екосистем та стійкість гідробіонтів до
дефіциту кисню. Подано розгорнуту морфологічну, ультраструктурну та
функціональну характеристики еритроїдної популяції клітин крові риб.
Описано структурно-функціональні особливості гемоглобінів означеної
систематичної групи організмів. Розглянуто особливості функціонування
системи червоної крові риб в умовах дефіциту кисню.
Матеріали і методи досліджень. Матеріалом для досліджень стала кров 5-ти
видів донних риб, що живуть біля узбережжя Кримського півострова:
бичка-кругляка (Neogobius melanostomus P.), бичка-мартовика (Gobius
batrachocephalus P.), бичка-трав’яника (Gobius ophiocephalus P.),
камбали-глосси (Platichthys flesus luscus P.) та скорпени (Scorpaena
porcus L.). Всього використано 317 особин. Рибу відловлювали в
Севастопольській бухті (ІнБЮМ НАН України) та в районі Кара-Дагу
(Карадагський природний заповідник). Під час проведення
експериментальної частини роботи використовували спеціально виготовлений
стенд. Він дозволяв підтримувати задану температуру та концентрацію
кисню у воді протягом необмеженого часу і застосовувався при визначенні
критичних та межових концентрацій кисню, а також у експериментах з
вивчення впливу гіпоксії та гіпотермії на організм риб. У момент
вилучення особин із камери для запобігання розвитку маніпуляційного
стресу застосовували уретановий наркоз [Солдатов, 2003].
Концентрацію гемоглобіну в крові та розчинах контролювали за допомогою
геміглобінцианідного методу. Застосовували стандартний набір реактивів
ТОВ “Агат-мед” (Росія). Кількість еритроцитів у крові підраховували в
камері Горяєва [Золотницька, 1987]. Гематокрит визначали шляхом
центрифугування зразків крові в гепаринізованих капілярах (750 g; 30
хвилин). На підставі одержаних значень розраховували еритроцитарні
індекси (MCV, MCH, MCHC) [Золотницька, 1987]. Водночас визначали
осмотичну резистентність у циркулюючих еритроцитів за мікроскопічним
методом Яновського [Стенко, 1975]. Мазки крові забарвлювали за
комбінованим методом Паппенгейма [Золотницька, 1987]. На мазках
підраховували процентний вміст незрілих еритроїдних форм:
пронормобластів (ПрН), базофільних (БН) та поліхроматофільних
нормобластів (ПН); за допомогою окуляр-мікрометра вимірювали великий та
малий діаметри в зрілих еритроцитах (Lc; Bc) та їхніх ядрах (Ln; Bn). На
підставі значень Ln та Bn за формулою еліпсоїда обертання розраховували
обсяг ядра еритроцита (Vn) [Ташке, 1980]. Для порівняльної оцінки змін
MCV та Vn визначали індекс: Vn / MCV (ядерно-плазмові відношення).
Криві кисневого насичення для цільних гемолізатів та розчинів окремих
фракцій гемоглобіну будували за допомогою спектрофотометричного методу з
використанням кювет-десатураторів [Крикливий та ін., 1979]. Величину рН
крові та гемолізатів оцінювали на рН-метрі ELWRO N 5123 (Польща).
Величину напівнасичення гемоглобіну киснем (P50) та коефіцієнт Хілла (n)
розраховували з кривих кисневого насичення. Ефект Бора (r) оцінювали за
рівнянням Ділла. Водночас визначали сумарний вміст нуклеотидтрифосфатів
(NTP) в еритроцитах за допомогою неферментативного методу Сейца
(гідроліз лабільного фосфату) [Терехов, Петров, 1983] та
внутрішньоклітинний вміст Mg2+ – спектрофотометрично за допомогою
стандартного набору реактивів фірми “Lacheme” (Чехія). Фракціонування
гемолізатів проводили за допомогою диск-електрофорезу в
поліакриламідному гелі. Концентрація акриламіду – 7.5 % [Маурер, 1971].
Розподіл оптичних щільностей між фракціями оцінювали за допомогою
денситометра “Carl Zeiss” (Німеччина). Стійкість гемоглобіну до
окислювання контролювали за вмістом його феррі-форми (метгемоглобін) у
крові. Контроль здійснювали спектрофотометрично з використанням реагента
ацетон-циангідрину [Кушаковський, 1970]. Водночас визначали активність
НАДН2-діафорази в циркулюючих еритроцитах за швидкістю відновлення
метгемоглобіну [Кушаковський, 1970].
.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Критичні та межові концентрації кисню. Порівняльна оцінка чутливості та
стійкості до гіпоксії була виконана на 5-ти видах донних риб (табл. 1).
Вибір цієї групи був обумовлений розходженнями в їхній толерантності до
дефіциту кисню. Як критерії чутливості та стійкості до гіпоксії обрані
показники критичної (Ркр.О2) та межової напруги кисню (Рпор.О2) у воді.
Перший відбиває момент переходу організму на залежний тип дихання, а
другий – факт загибелі тварини.
За результатами визначення показників цих величин встановлено, що
найменш чутливими до зміни концентрації кисню в середовищі виявилися
кругляк та скорпена (табл. 1). Перехід на залежний тип дихання в них
відбувався при найбільш низьких Ркр.О2 у середовищі (p0R?cae?o2
4
@
B*
.0ce2
d
?
?
@
B
^
?
A
d¬th
&
?????th????
?????? ?????th?¤????
d¬th]„?a$
O
7ш близькою до гіперболи, ніж у F1. Розходження були статистично вагомі
(табл. 5). Наявність F2 у гемоглобіновій системі кругляка пояснювала
особливості газотранспортних властивостей крові в цілому, а також
стійкість цього виду до зовнішньої гіпоксії.
Стійкість гемоглобіну до окислювання. Гемоглобіни риб відрізняються
низькою стійкістю до окислювання. Рівень феррі-форми в крові може
досягати 27 % без ознак токсичної метгемоглобінемії. При утриманні
особин скорпени в умовах експериментальної гіпоксії (15 і 30 % насичення
води киснем) нами був зареєстрований факт зниження концентрації
метгемоглобіну в крові (табл. 6). Це відбувалося на тлі підвищення
стійкості еритроцитів до осмотичного шоку (мал. 4).
Одержані результати дозволяють говорити про те, що процес природної
оксигенації крові трансформував частину гемоглобіну скорпени в окислений
стан. Подібна ситуація можлива лише у випадку низької ефективності
антиоксидантних систем еритроцита та, зокрема, NADH2-діафорази, що
перешкоджає утворенню феррі-форми. Про те, що це дійсно має місце,
свідчить зміна осмотичної стійкості еритроцитів, мембрани яких чутливі
до рівня окисних процесів у клітині.
При проведенні досліджень було виявлено, що окисна стійкість
гемоглобінів риб знижується в умовах низьких температур. Для уточнення
цих аспектів були проведені додаткові експерименти.
При інкубації in vitro гепаринізованих зразків крові скорпени при 5, 10
і 15о С значний ріст феррі-форми (до 7 % Hb, p
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
