.

Морфофункціональні, цитологічні і молекулярно-генетичні характеристики нативних і кріоконсервованих ембріонів людини (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
133 4290
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ПЕТРУШКО МАРИНА ПАВЛІВНА

УДК: 612.646:615.014.41:57.017

Морфофункціональні, цитологічні і молекулярно-генетичні характеристики
нативних і кріоконсервованих ембріонів людини

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Харків-2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий консультант:

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

академік НАН України,

доктор медичних наук, професор

Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор ІПКіК
НАН України, м.Харків

доктор біологічних наук професор, Лівшиць Людмила Аврамівна, Інститут
молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу геноміки
людини, м.Київ

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович,

Інститут тваринництва УААН, провідний науковий співробітник відділу
біотехнології репродукції сільськогосподарських тварин, м.Харків

доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович,
Інститут проблем кріобіології

і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературного
консервування, м.Харків

Національний медичний університет

ім. О.О.Богомольця МОЗ України, Науково-дослідний лабораторний центр,
м.Київ

Захист відбудеться “17” листопада 2006 року о 13. 30 годині на засіданні
спеціалізованої Вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, 61015, Харків-15, вул.Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15,
вул.Переяславська, 23

Автореферат розісланий “15” вересня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В Україні за останнє десятиріччя спостерігається
стійка тенденція до депопуляції, основною причиною якої є зниження
народжуваності. Крім того, безплідні шлюби складають 10-35% від
загальної кількості пар репродуктивного віку. Тому для покращення
демографічної ситуації важливо вирішення проблеми безплідного шлюбу
(Грищенко В.І., 2003).

За визначенням Всесвітньої організації охорони здоров’я лікування
безплідності методами допоміжних репродуктивних технологій успішне, якщо
в результаті отримана одноплідна вагітність без патологій розвитку
(ESHRE Capri Workshop, 2000). Багатоплідна вагітність розглядається як
ускладнення, оскільки зростає ризик передчасних пологів, народження
дітей з низькою вагою та виникнення інших медичних, соціальних і
економічних проблем (Калініна О.О., 2004).

У зв’язку з цим виникає питання вибору ембріонів для трансплантації в
порожнину матки пацієнтки, що, у свою чергу, передбачає визначення
чітких морфологічних критеріїв, які відображають високий імплантаційний
потенціал і генетичну повноцінність ембріонів. Не менш актуальними
вважаються питання кріоконсервування ембріонів, які залишилися
невикористаними після ембріоперенесення та їх селекції після
заморожування-відігрівання (Gerris J., 2002). Запропонована альтернатива
– культивування та трансфер бластоцисти – не є оптимальною, оскільки
цієї стадії в умовах in vitro досягає не більш 50% ембріонів (Henman M.,
2005). Відзначається, що для настання вагітності переніс у порожнину
матки пацієнтки 4-клітинних ембріонів найбільш сприятливий (Jaroudi K.,
2004).

Науково-технічний прогрес у біології та медицині, у першу чергу розвиток
репродуктивних технологій та методів генетичної діагностики, дозволяє на
практиці здійснити профілактику уроджених аномалій розвитку і
спадкоємної патології (Бариляк І.Р., 2003; Гречаніна О.Я., 2003;
Запорожан В.М., 2003; Лівшиць Л.А., 2003). Незважаючи на широке
використання методів кріоконсервування репродуктивних клітин і ембріонів
людини, ще не отримано переконливих доказів щодо негативного впливу
таких процедур на генетичний апарат. Виникнення різного роду ушкоджень
може бути перешкодою для широкого використання кріоконсервованих
ембріонів у методах допоміжних репродуктивних технологій.

Наведені факти підтверджують актуальність і необхідність дослідження
впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні, цитологічні та
молекулярно-генетичні характеристики преімплантаційних ембріонів людини
з метою перенесення в порожнину матки пацієнток тільки генетично
повноцінних ембріонів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася з 2000 по 2005 р. у рамках наукових тем Інституту
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України відповідно до напрямку
роботи відділу кріобіології систем репродукції (№ 2.2.6.66 “Вивчення
механізму підвищення фертильності гамет і стійкості фетальних клітин
людини і тварин при дії низьких температур у сполученні з іншими
фізичними і хімічними факторами”, № державної реєстрації 0100U000408 і №
2.2.6.96 “Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на
гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамето- і
ембріогенезу, розробка середовищ збереження, кріоконсервування і
репарації нелетальних кріоушкоджень цих біооб’єктів”, № державної
реєстрації 0101U003480). Автор був відповідальним виконавцем вказаних
тем.

Мета і задачі дослідження. На підставі детального аналізу
морфофункціональних, цитологічних і молекулярно-генетичних характеристик
визначити вплив факторів кріоконсервування на генетичний апарат
преімплантаційних ембріонів людини; розробити науково обґрунтовані
принципи комплексної оцінки ембріонів за морфологічними
характеристиками, здатністю до поновлення мітозу, швидкістю
морфогенетичних процесів і результатами преімплантаційної генетичної
діагностики для їх використання у допоміжних репродуктивних технологіях
при лікуванні безпліддя.

Для досягнення даної мети необхідно вирішити наступні задачі.

Розробити принципи оцінки стану ембріонів до і після кріоконсервування
та використати їх як біомаркери кріостійкості;

Визначити ефективність кріоконсервування ембріонів людини, що
знаходяться на різних стадіях преімплантаційного розвитку;

Провести порівняльний аналіз життєздатності кріоконсервованих зигот, що
знаходяться у різних фазах клітинного циклу;

Порівняти швидкість морфогенетичного розвитку нативних і
кріоконсервованих преімплантаційних ембріонів людини;

З’ясувати стан мітозів в бластомерах ембріонів людини до і після впливу
факторів кріоконсервування;

Провести цито- та молекулярно-генетичний аналіз нативних і
кріоконсервованих ембріонів людини з метою виявлення впливу факторів
кріоконсервування на їх генетичний апарат;

Провести цитогенетичний аналіз ооцитів та сперміїв для визначення
внеску батьківського і материнського геномів у загальну частоту
хромосомної нестабільності ембріонів;

Підвищити життєздатність преімплантаційних ембріонів людини за допомогою
систем сокультивування з преовуляторною сироваткою крові пацієнтки,
фолікулярною рідиною преовуляторних фолікулів, клітинами кумулюсу і
гранульози.

Об’єкт дослідження. Процеси ушкодження генетичного апарату
преімплантаційних ембріонів людини після кріоконсервування та
взаємозв’язок цих процесів з морфологічною і функціональною цілістю
ембріонів людини, що культивувалися in vitro.

Предмет дослідження. Морфофункціональні, цитологічні і
молекулярно-генетичні характеристики ембріонів людини, що знаходилися на
різних стадіях преімплантаційного розвитку.

Методи дослідження. Для одержання преімплантаційних ембріонів людини
застосовували екстракорпоральне запліднення ооцитів, отриманих у
пацієнток, що проходили лікування безплідності методами допоміжних
репродуктивних технологій. У роботі використовували морфологічний метод
оцінки ембріонів при прижиттєвій світловій мікроскопії. Стан хроматину
оцінювали за методом фарбування клітин флюоресцентними барвниками. Стан
генетичного апарату визначали за допомогою цитогенетичного методу шляхом
каріотипування і флюоресцентної гібридизації in situ. Для
кріоконсервування ембріонів використовували режими повільного
охолодження. Здатність до поновлення мітозу і темпи дроблення вивчали в
умовах тривалого культивування ембріонів людини in vitro. Для
реабілітації кріоконсервованих ембріонів після відігрівання
використовували методи сокультивування на монослої клітин кумулюсу і
гранульози, а також біологічно активні рідини.

Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за методом
Стьюдента. За критерій вірогідності розходження приймали рівень 95 %
(р0,05).

Встановлена залежність між виживанням і температурою експозиції
ембріонів людини. Зменшення часу експозиції до 5 хв істотно не вплинуло
на життєздатність ранніх ембріонів. Однак, враховуючи той факт, що
зменшення часу експозиції ембріонів у розчині кріопротектора з метою
зниження його цитотоксичного впливу не дає можливості для повного
насичення, було прийняте рішення застосувати 10-хвилинну експозицію на
етапі насичення ембріона розчином кріопротектора.

Ембріони були кріоконсервовані після інкубації в кріоконсервуючому
розчині при температурі 22С( (I група). Даний розчин містив 1,5 М 1,2-ПД
і 0,1 М сахарози. Охолодження здійснювали з 22 до ( 7(С зі швидкістю
2(С/хв, ініціацію кристалізації при -7(С, охолодження зі швидкістю 0,3
(С / хв до –30 (С з наступним зануренням зразків у рідкий азот (Lassal
B., 1985). Визначали температуру кристалізації кріоконсервуючого розчину
-5(С. Виходячи з цього, було зроблено припущення, що при зниженні
температури “сидінгу” до -7(С можлива спонтанна кристалізація розчину.
Тому II групу склали ембріони, які кріоконсервували за наступною
програмою: 10-хвилинна експозиція в 1,5 М розчині 1,2-ПД; охолодження
від кімнатної температури до -5(С зі швидкістю 0,7(С /хв; ручний
“сидінг” при -5(С;

повільне охолодження зі швидкістю 0,3(С/хв до -32(С; занурення зразків у
рідкий азот. ІІІ групу ембріонів кріоконсервували таким чином:
10-хвилинна експозиція в 1,5М розчині 1,2-ПД; охолодження від 22(С до
-5(С зі швидкістю 0,7(С /хв; 10-хвилинна стабілізація для вирівнювання
температури всього зразка, ручний “сидінг” при -5(С; повільне
охолодження зі швидкістю 0,3(С /хв до -32(С; занурення зразків у рідкий
азот. Відігрівання проводили швидко на водяній бані при температурі
30(С.

Порівняльний аналіз морфології нативних і кріоконсервованих ембріонів
при використанні комплексної оцінки якості після 48 год культивування
дозволив встановити, що ембріони всіх досліджуваних груп до
кріоконсервування знаходилися на одній стадії розвитку, мали інтактну
блискучу оболонку, правильні, щільно прилягаючі один до одного
бластомери і світлу, дрібнозернисту цитоплазму без вакуолярних і
цитоплазматичних включень (табл.1). Кількість ушкоджених бластомерів
зростала зі зниженням температури “сидінгу”. Більшість ембріонів I і II
груп характеризувалися руйнуванням одного бластомера або повним їх
лізисом.

Виявилося, що в нативних ембріонах середня кількість бластомерів на
ембріон склала 3,97(0,01, 3,99(0,02 і 3,92(0,01 для І, ІІ і ІІІ груп
відповідно (p>0,05). В поодиноких ембріонах усіх досліджуваних груп
відзначали залучення цілого бластомера до процесів фрагментації. Після
кріоконсервування середня кількість бластомерів у ембріоні склала
2,64(0,09, 3,57(0,06 та 3,75(0,04 для І, ІІ і ІІІ груп відповідно.

У роботі вивчали морфометричні характеристики ембріонів до і після
кріоконсервування. Незалежно від протоколу кріоконсервування 62,8(2,8;
65,2(0,8 і 67,8(2,1% ембріонів I, II і III груп відповідно мали
однаковий розмір бластомерів. Однак в усіх групах спостерігалися
макробластомери, що виникли, імовірно, за рахунок злиття двох сусідніх
клітин.

Цитоплазма бластомерів нативних ембріонів характеризувалася прозорістю і
гомогенністю. Після кріоконсервування в ембріонах І і ІІ груп виникали
дегенеративні зміни в цитоплазмі у вигляді агрегації гладкого
ендоплазматичного ретикулуму, одного чи декількох вакуолеподібних
утворень в центрі бластомера. В ембріонах І групи відзначали утворення
великих “проломів” і розриви zona pellucida.

Для з’ясування залежності виживання від морфологічних характеристик
ембріони поділяли на дві групи: нативні (n=52) і кріоконсервовані
(n=53). Ембріони кожної групи були віднесені до одного з чотирьох типів
категорії якості (тип фрагментації) за процентним вмістом
цитоплазматичних фрагментів: перша – ембріони з бластомерами сферичної
форми, які щільно прилягають один до одного, мають світлу дрібнозернисту
цитоплазму, інтактну zona pellucida без цитоплазматичних фрагментів;
друга – ембріони з нерівними бластомерами з фрагментацією, що не
перебільшує 10%; третя – ембріони з фрагментацією цитоплазми небільш 50%
та інтактною zona pellucida; четверта ( фрагментація цитоплазми
ембріонів більш 50%.

Таблиця 1

Морфологічні характеристики ембріонів людини до і після
кріоконсервування

Характеристика ембріонів Ембріони, %

І група

n =163 ІІ група

n =166 ІІІ група

n =157

До заморожування Після відігрівання До заморожування Після відігрівання
До заморожування Після відігрівання

Бластомери інтактні 96,7(0,7 52,1(5,1 97,1(0,9 60,5(0,5 96,3(0,3
85,4(0,6**

Однаковий розмір бластомерів 85,9(0,1 62,8(2,8 88,6(0,7 65,2(0,8
89,7(1,7 67,8(2,1*

Наявність не більш 25% цитоплазматичних фрагментів 83,1(3,2 43,8(1,0
85,4(0,6 68,8(1,0 82,2(0,2 78,9(0,9*

Прозорість і гомогенність цитоплазми 96,2(0,2 69,7(1,7 67,8(2,1 59,5(0,8
98,1(0,1 96,5(1,5**

Наявність цитоплазматичних вакуолей – 12,2(0,2 – 4,7(0,7*** – –

Разрив zоna pellucida – 8,1(0,1 – 1,2(1,2 – –

Щільний міжклітинний контакт 97,6(0,4 96,9(1,1 95,7(0,3 84,9(0,6
96,9(1,1 95,7(0,3

Примітки:

1. * ( у порівнянні з ембріонами після кріоконсервування І і ІІ груп,
pЕмбріони досліджуваних груп кріоконсервували. Після деконсервації проводили морфологічну оцінку збереження ембріонів методом світлової мікроскопії. Ембріони без фрагментації цитоплазми мали високий рівень виживання після кріоконсервування. Картина фрагментації ембріонів першого типу статистично не відрізнялася до і після кріоконсервування. Після кріоконсервування вірогідно зростала кількість ембріонів із третім і четвертим типами фрагментації за рахунок лізису бластомерів, які були оточені фрагментованими ділянками. Середня кількість бластомерів в ембріонах першого типу складала 3,7(0,3. Після кріоконсервування загальна кількість бластомерів знизилася за рахунок їх руйнування або за рахунок додаткової фрагментації ділянок цитоплазми (табл. 2). У зв'язку з цим вірогідно зросла загальна кількість ембріонів з третім і четвертим типами фрагментації. Слід звернути увагу на факт зниження загальної кількості бластомерів при підвищенні ступеня фрагментації. Так, середня кількість бластомерів для першого-четвертого типів склала 3,2(0,7, 2,9(0,9, 2,2(0,8 і 0,8(0,6 відповідно. Через 48 год культивування загальна кількість бластомерів у нативних і кріоконсервованих ембріонів першого і другого типів статистично зрівнялася, тоді як для ембріонів третього і четвертого типів була характерна інша картина розвитку. Таблиця 2 Загальна кількість бластомерів в ембріонах людини з різним типом фрагментації цитоплазматичних ділянок Тип фраг-ментації Час культивування, год Контроль Кріоконсервовані ембріони, M(m 24 48 24 24 48 До кріоконсервування Після відігрівання Перший 3,7(0,3 6,7(0,6 3,7(0,3 3,2(0,7 6,1(1,5 Другий 3,6(0,3 6,2(0,9 3,6(0,4 2,9(0,9 5,4(1,9 Третій 3,4(0,4 5,5(0,7 3,2(0,4 2,2(0,8* 3,9(1,7* Четвертий 2,0(0,6 2,6(0,9 2,6(0,6 0,8(0,6* 1,0(0,8** Примітки: 1. * ( достовірні відмінності від контролю й ембріонів досліджуваної групи до кріоконсервування, р Таблиця 3 Морфологічні характеристики ембріонів після 24 год культивування нативних і кріоконсервованих зигот людини з різним типом морфології пронуклеусів та різним терміном запліднення Тип зигот Нативні ембріони (контроль), % Кріоконсервовані ембріони , % 1 і 2 категорії якості 3 і 4 категорії якості/блок І група (18 год після інсемінації) ІІ група 22 год після інсемінації) ІІІ група (26 год після інсемінації) 1 і 2 категорії якості 3 і 4 категорії якості/блок 1 і 2 категорії якості 3 і 4 категорії якості/блок 1 і 2 категорії якості 3 і 4 категорії якості/блок Перший 87,8(5,1 12,2(0,9 25,0(1,5* 75,1(6,8 80,0(5,5 20(0,9 14,3(0,9* 85,7(8,1 Другий 81,6(7,7 18,4(0,3 14,3(0,9* 85,7(5,5 68,2(4,9 31,8(2,9 17,4(1,1* 82,6(7,8 Третій 58,8(4,2 41,2(3,8 0,3(0,01* 99,7(8,8 43,5(3,3 56,5(5,2 4,3(0,3* 95,6(8,8 Четвертий 52,0(5,0 48,0(4,0 0** 100 12,5(0,8** 87,5(6,6 0** 100 Примітки: 1 * ( достовірні відмінності від контролю й ембріонів третьої групи, р Показник формування бластоцист розраховували як відношення ембріонів, що сформували бластоцисти, до загальної кількості ембріонів. Усього було аспіровано 334 і 342 ооцитів, що складало 11,5(0,8 і 12,7(0,8 ооцитів на пацієнтку (р>0,05). Запліднилося 81,2(1,7 і 83,3(2,4% ооцитів відповідно
(p Таблиця 4 Результати цитогенетичного аналізу ембріонів людини до і після кріоконсервування Каріотип Кількість ембріонів,n,% Контроль Кріоконсервовані Диплоїдія 46,ХХ; 46,ХУ 45-48 ,ХХ

44-47,ХХ 34

44

2

1 19

28

1

0

Всього

81 (68,1) 48 (42,1)

Поліплоїдія 69, ХХХ

92, ХХХУ

68-71, XXX

65-70, ХХ?

90-94, ХХХУ? 2

1

0

0

0 3

2

1

1

1

Всього

3 (2,5) 8 (7,0)

Анеуплоїдія Гіперплоїдія 47, XY, +C

47, ХХ, +Е

47, ХХ, +F

47,ХХ,+G

48,XX, +E,+E

48,XY,+C,+E

49,ХХ,+Е,+F,+G

51, XX,+B,+D,+E,+F,+G 3

3

3

1

1

1

1

0 2

4

0

1

1

0

0

1

Всього

13 (10,9) 9 (7,9)

Гіпоплоїдія 45,XX,-D

45,XX,-G

44,ХХ,-А,-В

43,ХУ, – А,-В,-С

40,ХУ?,-А,-В,-С,-E,-F,-G

43, XX, -F,-F,-G

43,XX,-E,-E,-F

43,XY,-E,-E,-F

43,XY?,-D,-E,-G

43,XX,–E,-E,-G,-G

42,XX,-F,-F,-G,-G

40,XY?,-A,-B,-D,-E,-F,-G

47,ХХ,+А,+В,+С 1

2

4

1

2

2

0

0

2

1

1

1

0 0

0

1

1

2

4

3

4

3

1

0

0

2

Всього

17 (14,3) 21 (18,4)

Комбіновані випадки 45,ХХ,?+С,+D,-D,-F,-G

44XX, +D,-F,-G,-G 0

2 1

0

Всього: 32 (26,9) 31 (27,2)

Мозаїцизм Диплоїдні мозаїки:

1) хаотичні мозаїки

2) 2n/pol

3)мітотичні анеуплоїди:

а)мітотичне нерозходження хромосом

б)мітотичний анафазний міст

в)ендоредуплікація

2

1

0

0

0

9

8

1

2

2

Поліплоїдні мозаїки

0 5

Гаплоїдні мозаїки

0 0

Всього 3 (2,5) 27 (23,7)

Всього:

119 (100) 114 (100)

Серез 7 груп хромосом найбільш часто анеуплоідія виникала за рахунок
нерозходження хромосом груп Е, F і G, що було характерним як до, так і
після кріоконсервування ембріонів. Частота аномального розходження
хромосом груп А, С+Х и D була вірогідно нижча теоретично очікуваної, а
груп E, F і G – вища (р z~?& ( ????l???? ???? ?????? ????l???? ???? ????#? ?????? ????l???? ????#? ????l???? ???? ???? J ????l???? ???? 6них бластомерів, у 4-х ембріонах спостерігали повний лізис бластомерів. Таким чином, частота виживання ембріонів склала 80%. За результатами аналізу інтерфазних ядер 80% нативних і 63,7% кріоконсервованих ембріонів мали нормальний каріотип. Поліплоїдні мозаїки (тетра- і гексаплоїдні клітинні лінії) були виявлені у 18,2% ембріонів після кріоконсервування. Частота анеуплоїдії по 13, 18, 21 і 22-й хромосомах у нативних і кріоконсервованих ембріонах статистично не відрізнялась (р>0,05).

Таблиця 6

Цитогенетичний аналіз ембріонів людини до кріоконсервування методом
FISH-аналізу

Номер ембріона Кількість клітин Кількість FISH-сигналів у хромосомах
Діагностика ембріона

13 18 21 16 22

1 4 2 2 2 2 2 Норма

2 2 2 2 2 2 2 Норма

3 1 3 2 2 0 2 Комплексний мозаїк

1 2 3 2 2 4

1 2 2 1 2 3

1 1 2 3 0 1

4 6 2 2 2 2 2 Норма

5 2 2 2 2 2 2 Норма

6 1 3 3 1 3 3 Комплексний мозаїк

2 2 2 0 2 2

1 0 0 2 2 2

7 2 1 2 2 2 2 Норма

8 1 2 2 2 2 2 Норма

9 2 2 1 2 2 2 Норма

10 5 2 2 2 2 2 Норма

Успішна гібридизація була здійснена у 11 ембріонах (68,8%), FISH-аналіз
був можливий у 37 бластомерах (табл. 7).

Таблиця 7

Цитогенетичний аналіз ембріонів людини після кріоконсервування методом
FISH-аналізу

2N/6N

1 6 6 6 6 6

10 2 2 2 2 2 2 Норма

11 2 2 2 2 2 2 Норма

1 1 2 1 2 2

Важливо звернути увагу на високу частоту анеуплоїдій із залученням 16-ї
хромосоми у ембріонах людини після кріоконсервування (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020