МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО
ПЕЧЕНИК СЕРГІЙ ОЛЕГОВИЧ
УДК 616 – 053.2 – 08:575.224:577.21:612.014.4
Особливості патогенезу та маніфестації симптомокомплексу, що виник у
дітей в умовах комбінованого забруднення довкілля солями важких металів
та фтору
14.01.10 – педіатрія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Львів – 2006Дисертацією є рукопис
Роботу виконано в Інституті спадкової патології АМН України
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор Гнатейко Олег Зіновійович, Інститут
спадкової патології АМН України, директор інституту
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Няньковський Сергій Леонідович,
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ
України, завідувач кафедри факультетської та шпитальної педіатрії
доктор медичних наук, професор Сорокман Таміла Василівна, Буковинський
державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри
факультетської педіатрії та медичної генетики
Провідна установа:
Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України, м. Харків
Захист дисертації відбудеться “25” лютого 2006 р. о 12 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.600.04 при Львівському
національному медичному університеті імені Данила Галицького (79000,
м. Львів, вул. Пекарська, 69).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Львівського національного
медичного університету імені Данила Галицького (79010, м. Львів,
вул. Січових стрільців, 6).
Автореферат розісланий “19” січня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат медичних наук А.І. Попович
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Динаміка екологічної ситуації в Україні зумовлює
появу та збільшення площ територій з підвищеними концентраціями
токсичних речовин у довкіллі (Сердюк А.М., 1996). Зростає частота
захворювань, що виникають у дітей в умовах тривалого контакту з
токсичними чинниками (Фесенко М.Є., 2000). Такі захворювання
характеризуються латентним перебігом, ураженням декількох систем
організму, важко піддаються діагностиці та лікуванню, часто приводять до
хронізації патологічного процесу та інвалідизації. (Price R.G. та ін.
1999, Баранов А.А. 1999, Лук’янова О.М. та ін. 2003).
Анатомо-фізіологічні особливості та характер поведінки роблять дітей
більш чутливими до впливу ксенобіотиків (Faustman E.M. та ін. 2000).
Важкість клінічного перебігу екопатології в кожному окремому випадку
визначається здатністю організму до детоксикації ксенобіотиків.
Ефективність детоксикації залежить від функціональної повноцінності
ферментних систем, що кодуються відповідними генами (Баранов В.С. 2000).
Патогенез екологічно обумовлених захворювань та фактори, що сприяють їх
маніфестації залишаються маловивченими. Це гальмує розробку ефективних
методів ранньої діагностики, профілактики та лікування таких
захворювань. Визначення маркерів схильності до виникнення важких форм
захворювань, пов’язаних із шкідливим впливом довкілля, залишається
актуальним, оскільки дозволить формувати групи дітей підвищеного ризику
та проводити їм адекватні профілактичні заходи (Козакевич В.К., 2000).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках комплексних науково-дослідних робіт Інституту
спадкової патології АМН України “Розробка принципів діагностики,
лікування та профілактики захворювання, що пов’язане з інтоксикацією
генотоксичними чинниками” № держреєстрації 0199U001344 та “Дослідження
клініко-генетичного поліморфізму екопатології у дітей м. Соснівка,
забрудненого генотоксичними чинниками” № держреєстрації 0102U001775.
Мета роботи: покращити ранню діагностику та профілактику екологічно
детермінованого симптомокомплексу дітей із регіону, забрудненого
генотоксичними чинниками, шляхом встановлення окремих патогенетичних
механізмів та виявлення факторів, що обумовлюють важкість клінічного
перебігу екопатології.
Завдання дослідження:
Оцінити динаміку частоти та спектру природжених вад розвитку в
забрудненому регіоні.
Дослідити варіанти клінічного перебігу екологічно детермінованого
симптомокомплексу у дітей із забрудненого регіону.
Визначити вплив епігенетичних факторів на маніфестацію екопатології у
дітей, що постійно проживають у забрудненому регіоні.
Оцінити вплив особливостей генотипу на формування екологічно
детермінованого симптомокомплексу та важкість його клінічного перебігу.
Визначити особливості регулювання гомеостазу кальцію в організмі дітей в
умовах забруднення довкілля солями важких металів та фтору.
Дослідити активність статевих гормонів в організмі підлітків із
забрудненого регіону.
Дослідити збалансованість механізмів регуляції життєвого циклу клітин в
умовах впливу генотоксичних чинників.
Об’єкт дослідження: симптомокомплекс, що виник у дітей в умовах
проживання на території з підвищеним вмістом солей важких металів та
фтору в довкіллі.
Предмет дослідження: – патогенетичні механізми та фактори, що збільшують
ризик маніфестації екологічно детермінованого симптомокомплексу у дітей.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено
комплексну оцінку ролі епігенетичних факторів у маніфестації
захворювання дітей в умовах забруднення довкілля солями важких металів
(СВМ) та фтору.
Отримані нові дані щодо розподілу алелей гена DQA1 головного комплексу
гістосумісності у дітей, що проживають на забрудненій території.
Встановлено зв’язок між особливостями GSTM-генотипу та важкістю перебігу
екопатології.
Уточнено особливості гормональної регуляції гомеостазу кальцію в
організмі дітей при їх тривалому контакті з СВМ та фтору.
Оцінено вплив генотоксичних чинників на активність статевих гормонів у
підлітків із забрудненого регіону.
Вперше проведено комплексний аналіз частоти явищ повного передчасного
розділення центромер (ПРЦ) та апоптозу лімфоцитів (АЛ) у дітей із
екологічно несприятливого регіону (ЕНР).
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть
бути застосовані для ранньої діагностики та прогнозування екологічно
детермінованих симптомокомплексів (ЕДС) в умовах проживання в техногенно
забруднених регіонах. Розроблені оптимальні методи прогнозування
важкості клінічного перебігу ЕДС. Надано практичні рекомендації
педіатрам та лікарям сімейної медицини щодо формування груп дітей
підвищеного ризику для проведення цілеспрямованих профілактичних та
лікувальних заходів. Впровадження запропонованих заходів дозволить
знизити частоту важких, хронічних форм ЕДС дитячого віку, зменшити
відсоток інвалідизації.
Запропоновано модифікований метод дослідження апоптозу лімфоцитів крові,
що дозволяє реєструвати явище на прижиттєвих препаратах клітин.
Впровадження результатів дослідження відбувалось на базі Львівської
обласної дитячої клінічної лікарні, Львівського міжобласного
медико-генетичного центру та міської поліклініки м. Соснівка Львівської
області. Результати досліджень використовують у навчальному процесі на
кафедрі пропедевтики дитячих хвороб Львівського національного медичного
університету імені Данила Галицького.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено
патентно-інформаційний пошук та узагальнення даних літератури за
проблемою, визначено напрямок, мету, завдання та методологію
дослідження. Самостійно проведено клінічні спостереження та
ультразвукову діагностику хворих, виконано забір і підготовку
біологічного матеріалу для досліджень. Здійснено статистичну обробку,
аналіз та узагальнення отриманих результатів, сформульовано висновки та
практичні рекомендації, реалізовано їх впровадження в роботу закладів
охорони здоров’я.
Всі розділи дисертації написані здобувачем особисто. У друкованих
роботах, опублікованих у співавторстві, дисертанту належить самостійне
проведення обстежень, опрацювання та аналіз результатів, підготовка
статей до друку.
Автор висловлює подяку керівнику відділення клінічної генетики Інституту
спадкової патології АМН України к.м.н. Г.Р. Акопян, старшому науковому
співробітнику к.б.н. І.А. Сєднєвій, старшому науковому співробітнику
Інституту онкології АМН України Н.М. Храновській, завідувачу відділу
регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України
проф. Р.С. Стойка, старшому лаборанту О.Ю. Ключівській за допомогу в
проведенні досліджень.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, виконаних в
рамках дисертаційної роботи, відображені у виступах на Міжнародній
конференції “Placentologic monitoring studies & ecotoxicologic aspects
of genetic diseases”, що відбувалась в м. Краків (Польща) у 2000 р., на
3-му З’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), на конференції
“Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків” (Чернівці, 2002),
на Всеукраїнському симпозіумі педіатрів “Вплив екопатологічних чинників
на стан здоров’я дітей” (Тернопіль, 2004), на конференціях з проблем
медичної генетики (Харків, 2003; Москва 2003; Берлін 2004).
Публікації. Основні положення дисертації викладені у 18 публікаціях, з
яких 9 – статті у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 9 – тези
доповідей у матеріалах конференцій.
Об’єм та структура дисертації. Робота викладена на 156 сторінках
машинописного тексту, ілюстрована 24 таблицями, 21 рисунками.
Складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення
отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та переліку
використаних літературних джерел (214, із них 160 – іноземних), що
займає 21 сторінку.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Динаміку частоти та спектра ПВР вивчали
за даними документації пологових установ. Проаналізовано стан 348942
новонароджених (Н) за 1986-2001 рр., в т.ч. у Сокальському районі –
32783, у Львівській області – 316159.
Клінічно обстежено 280 дітей із ЕНР (м. Соснівка, Сокальський район
Львівської області), де зареєстровано підвищені концентрації СВМ та
фтору в довкіллі (Смоляр Н.І. та ін. 1996; Рудько Г.І. та ін. 1997).
Група контролю – 57 дітей з екологічно чистого регіону (ЕЧР). 40 із них
взято за методом випадкової вибірки (Сидоренко Г.И. 1986). Вони склали
загально-популяційну групу контролю (ЗПГК). Решта 17 дітей у неважкому
клінічному стані знаходились на обстеженні у Львівській обласній дитячій
клінічній лікарні.
Усім дітям проводили збір анамнезу, клінічний огляд, УЗД внутрішніх
органів та щитовидної залози, ряд лабораторних тестів. Проведено
ретроспективний аналіз стану здоров’я 1062 дітей диспансерної групи із
ЕНР.
47 дітям із ЕНР визначено вміст токсичних металів у сироватці крові
шляхом атомно-абсорбційної мас-спектрометрії (Yourd E. 2002) за
допомогою обладнання Perkin Elmer.
У 27 дітей із ЕНР вивчали розподіл алелей гена GSTM1 та у 36 дітей –
гена DQA1. Детекція алельних варіантів проводилася за допомогою
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Иващенко Т.Є. 1999).
Активність лужної фосфатази (ЛФ) визначали 39 дітям за допомогою
спектрофотометрії. Вміст кісткового ізоферменту (КІ) ЛФ визначали після
інкубації сироватки крові протягом 5 хв. при t 65°С. Величина, на яку
при цьому зменшується рівень загальної ЛФ, відповідає рівню КІ
(Камышнинов В.С. 2000). Са++ сироватки крові визначали за допомогою
арсеназо-III-метода, неорганічний фосфор – УФ детекцiєю
фосфомолiбдатного комплексу; Mg++– кольоровою реакцією з магоном
(Меншиков В.В. 1987). Активність паратгормону (ПТГ) та кальцитоніну (КТ)
дослідили 35 дітям з ЕНР шляхом імуноферментного аналізу (ІФА)
(Miles L.M. та ін. 1974) на апаратурі Multiscan Plus P з використанням
наборів ACTIVE® I-PTH DSL, ACTIVE® CALCITONIN DSL. Активність естрадіолу
дослідили у 80 дівчат, а тестостерону – у 30 хлопців з ЕНР. Контроль –
20 дівчат та 20 хлопців із ЕЧР. Використовували набори для ІФА Estradiol
EIA DSL та Testosterone EIA DSL.
Для дослідження повного ПРЦ виготовляли препарати метафазних хромосом
(Hungerford D.A. 1965). Обстежено 26 дітей віком від 3 до 14 років із
ЕНР.
Апоптоз лімфоцитів досліджували 3-ма способами. Проводили люмінесцентну
мікроскопію 39 зразків нативної крові дітей із ЕНР із прижиттєвим
забарвленням акридином оранжевим (Sigma, США) за методом (Крищишин Н.В.,
Луцик М.Д. 1978) в авторській модифікації. Застосовували мікроскоп
ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, Росія), при збільшенні у 500 разів. Вірогідними ознаками
АЛ вважали зменшене поглинання барвника та фрагментацію ядра
(Gasiorowski K. 2001).
Цитологічний аналіз фіксованих мазків крові проводили на матеріалі 21
проби дітей із ЕНР. Фрагментацію ядер та наявність апоптичних тілець
вважали достовірними ознаками апоптозу (Keesey J. 1995).
Проточну цитофлуориметрію проведено на 15 зразках крові дітей із ЕНР за
допомогою приладу FACScan (“Becton Dickinson”, USA), з використанням
програми CellQuest (Фильченков А.А. 2001).
Статистична обробка результатів проводилась за допомогою програм
“Statistica 5” та Microsoft Excel – 2000 (Боровиков В. 2001).
Результати дослідження та їх обговорення. Встановлено, що концентрації
заліза, марганцю та свинцю у сироватці крові перевищували допустимі у
кожної третьої дитини із ЕНР, а концентрації кадмію та кобальту – у
кожної п’ятої.
Для оцінки тератогенних ефектів в умовах хімічного забруднення визначено
частоту та спектр ПВР новонароджених в ЕНР в динаміці 1986–2001 років.
Частота аномалій розвитку в ЕНР (423,3 на 104 Н) була вірогідно вищою,
ніж по Львівській області (216,4 на 104 Н) протягом усього періоду
спостереження (pТаблиця 2
Порівняння частоти реєстрації апоптозу в групах дітей із забрудненого
регіону та ЕЧР
Назва групи, чисельність % апоптичних клітин (М±м) Назва групи,
чисельність % апоптичних клітин (М±м) Достовірність різниці (р)
ЕНР, м. Соснівка, n = 40 19,76±1,25 Контроль, n = 15 12,92±1,36 р0,05
ЕНР, ВПС, n = 24 19,28±2,41 Контроль, n = 15 12,92±1,36 рdcOR x ? o oe o >
n
p
r
?r
t
v
x
z
|
~
?
Ae
>dR
T
z
(?(e)o*ue+?,„-?.Oe/‚1@364//////iaaaaaaOOOOOOOaaaaa
&
j‚k?l@neroooooooooooniaiaaaoiiioi*
dh
.
j=
`„a$
???????? ?страції клітин з апоптичною морфологією досліджено у
фіксованих мазках крові дітей дослідної та контрольної груп.
Фрагментацію ядра та відшарування апоптичних тілець вважали достовірними
ознаками апоптозу (Trauth B.C., Keesey J. 1995). В мазках крові дітей із
ЕНР частота реєстрації АЛ коливалась в межах 2–18% лімфоцитів, в мазках
крові контрольної групи – 5–16%. За середніми значеннями частота
апоптозу в групі із забрудненого регіону виявилась достовірно нижчою,
ніж у контролі. В дослідній групі виділено 3 когорти дітей: з частотою
реєстрації АЛ менше 5% лімфоцитів, з частотою на рівні 5–10% клітин та з
високими показниками – >10% лімфоцитів. В контрольній групі не
спостерігалось частоти апоптозу менше 5% лімфоцитів.
В групі з ВПС переважали діти зі зниженою частотою ознак АЛ – більше
половини. При легшому перебігу захворювання знижену частоту цитологічних
ознак апоптозу зареєстровано у 30% дітей. Висока частота спостерігалась
лише у 9% дітей із важким перебігом, у 20% – з легким та у 40% в
контролі (рис. 3). Встановлено позитивний корелятивний зв’язок між
важкістю перебігу ЕДС і напруженістю АЛ, визначеного за допомогою
цитологічного аналізу – коефіцієнт кореляції –0,39 при р10%), у 58% – його
мінімальні значення (1–5%). Середні значення реєструвались у 8%. Не
виявлено достовірної різниці у середній частоті АЛ в групах дітей із ЕНР
та ЕЧР, проте, із 80% вірогідністю проглядалась тенденція до більш
високих показників у дослідній групі. В групі дітей із ЕНР майже
відсутні особи з середньою частотою апоптозу на рівні 5–10% клітин, тоді
як у контролі таких осіб 33% (рис. 4).
Рис. 4. Розподіл когорт із різною частотою апоптозу в дослідній і
контрольній групах при застосуванні проточної цитометрії
В дослідній групі також реєстрували випадки підвищеної частоти апоптозу
(>10% клітин), що не спостерігалось у контролі. Середня частота АЛ у
когорті дітей з м. Соснівка з показниками ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АЛ – апоптоз лімфоцитів
ВПС – важчий перебіг симптомокомплексу
ГЕЗ – гіпоплазія емалі зубів
ЕДС – екологічно детермінований симптомокомплекс
ЕНР – екологічно несприятливий регіон (м. Соснівка, Сокальський район
Львівської області)
ЕЧР – екологічно чистий регіон
ЗПГК – загально-популяційна група контролю
ЖВШ – жовчовивідні шляхи
ІФА – імуноферментний аналіз
КІ – кістковий ізофермент лужної фосфатази
КТ – кальцитонін
ЛММГЦ – Львівський міжобласний медико-генетичний центр
ЛПС – легший перебіг симптомокомплексу
ЛФ – лужна фосфатаза
Н – новонароджені
ПВР – природжені вади розвитку
пг /мл
пікограм на 1 мілілітр
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
ПТГ – паратиреоїдний гормон
СВМ – солі важких металів
УЗД – ультразвукова діагностика
ШКТ – шлунково-кишковий тракт
ЩЗ – щитовидна залоза
DQA – гени II-го класу головного комплексу гістосумісності
GST – глютатіон-S-трансфераза
PAGE 21
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
