Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину (автореферат)

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Сиволоб Андрій Володимирович

УДК 577.323.2 : 576.315.42

Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі загальної та молекулярної генетики
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

НДІ фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного
університету імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології

доктор біологічних наук, професор

Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу
білкової інженерії

доктор фізико-математичних наук

Волков Сергій Наумович,

Інститут теоретичної фізики імені М.М.Боголюбова НАН України, провідний
науковий співробітник

Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О.Богомольця, м. Київ.

Захист відбудеться “ 24 ” травня 2006 р. о 1400 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова,
2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 4 ” квітня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Цимбалюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. ДНК в еукаріотичних клітинах існує тільки у вигляді
складного комплексу з білками, який називають хроматином, і який,
власне, є фізичним субстратом апарату спадковості. Головним білковим
компонентом хроматину є позитивно заряджені білки – гістони. Завдяки
електростатичним взаємодіям так званих корових гістонів з ДНК
утворюється елементарна структурна одиниця хроматину – нуклеосома.
Взаємодія нуклеосом із лінкерними гістонами призводить до компактизації
структури та формування фібрили хроматину товщиною 30 нм. Суттєвим
моментом організації хроматину є та обставина, що хроматинова фібрила
формує петлі, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах
клітинного ядра. Тобто ДНК петлі є топологічно еквівалентною до
циркулярної ДНК.

На сьогодні досягнуто значного прогресу щодо розуміння детальної
молекулярної структури нуклеосоми на підставі, в першу чергу,
кристалографічних досліджень (Luger et al., 1997; Richmond and Davey,
2003). Але це стосується статичної структури нуклеосоми. Численні
дослідження особливостей функціонування хроматину in vivo призвели до
фундаментального уявлення, що хроматин у цілому і нуклеосома зокрема, є
динамічними утвореннями, здатними до певних конформаційних перебудов.
Характер та молекулярні механізми таких перебудов здебільшого
залишаються недостатньо вивченими. Структурні перетворення нуклеосоми,
що залежать від зміни зовнішніх умов, є добре відомими завдяки
дослідженням in vitro, але у відповідь на досить екстремальні впливи,
які є далекими від фізіологічних. До цілком фізіологічних факторів слід
віднести зміни топологічного стану циркулярної ДНК (або ДНК у складі
ядерних петель), вплив яких на структуру нуклеосоми є практично не
дослідженим.

Проблема молекулярних механізмів конформаційної динаміки нуклеосоми та
хроматину в цілому є тісно пов’язаною із загальним розумінням
молекулярних механізмів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину,
серед яких можна відокремити два ключові моменти: неспецифічні
електростатичні взаємодії, що стабілізують хроматин; вплив специфічної
послідовності пар основ ДНК, який призводить до феномена переважного
позиціювання нуклеосом відносно послідовності, що має велике значення
для функціонування геному. Існуючі якісні уявлення щодо вказаних
механізмів нуклеопротеїнових взаємодій не дозволяють кількісно описати
відповідні процеси.

Дисертація присвячена розв’язанню наукових проблем, що пов’язані з
молекулярними механізмами електростатичних нуклеопротеїнових взаємодій у
складі хроматину, позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар
основ ДНК, конформаційної динаміки нуклеосом у складі циркулярної ДНК за
фізіологічних умов. Указані проблеми мають велике значення для розуміння
загальних принципів нуклеопротеїнових взаємодій та молекулярної
організації й функціонування апарату спадковості, фізичним субстратом
якого є хроматин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась у тісному зв’язку з науково-дослідними темами “Особливості
структурної організації хроматину еукаріот, які визначають ефективність
дії на ДНК фізичних та хімічних факторів” (№ держреєстрації 0197U003138,
1997-2000 рр.) та “Вплив біологічно-активних речовин та еластичних
напружень ДНК на будову хроматину в ядрах клітин” (№ держреєстрації
0101U002169, 2001-2005 рр.), які входили до Комплексної наукової
програми “Здоров’я людини”, і в рамках яких автор дисертаційної роботи
був одним з відповідальних виконавців.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у тому, щоб встановити
молекулярні механізми структурної динаміки хроматину та
нуклеопротеїнових взаємодій у його складі. Об’єктом дослідження є
хроматин, предмет дослідження – його структурна динаміка та
нуклеопротеїнові взаємодії у його складі. Відповідно до мети вирішуються
наступні завдання:

1. Розробка кількісної теорії електростатичних взаємодій позитивно
заряджених лігандів з ДНК та аналіз взаємодії гістонових комплексів з
ДНК на її підставі.

2. Розробка кількісної теорії електростатичного внеску у вигин молекули
ДНК та її застосування до структури нуклеосоми.

3. Розробка теорії переважного позиціювання нуклеосом відносно
послідовності пар основ ДНК.

4. Вивчення конформаційної рухливості ДНК у складі нативних клітинних
ядер.

5. Вивчення та теоретичний аналіз конформаційної динаміки нуклеосоми,
субнуклеосомної частинки тетрасоми – комплексу ДНК із тетрамером
гістонів (Н3-Н4)2, наднуклеосомної частинки, утвореної за участю
лінкерного гістона, у складі циркулярної ДНК.

6. Вивчення та аналіз впливу послідовності пар основ ДНК та ацетилування
гістонів на конформаційну динаміку нуклеосоми та інших нуклеогістонових
комплексів.

Для вирішення поставлених завдань застосовано наступні експериментальні
та теоретичні методи дослідження: тирозинова флуоресценція білків,
флуоресценція бромистого етидію, релаксація комплексів у присутності
ДНК-топоізомерази І, футпринтинг ДНК за допомогою ДНКази І та вільних
радикалів, електрофорез, комп’ютерне моделювання, теоретичний аналіз
експериментальних результатів за допомогою розроблених теоретичних
моделей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено теорію
взаємодії позитивно заряджених лігандів з ДНК на підставі рівняння
Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра. На відміну від розроблених
раніше теоретичних підходів, теорія дозволяє більш точно кількісно
оцінювати термодинамічні параметри взаємодії позитивно заряджених білків
з ДНК.

Вперше розроблено теоретичну модель, яка вказує, що молекулярним
механізмом компактизації ДНК у присутності позитивно заряджених лігандів
є утворення лігандом полікатіонних містків між віддаленими по ланцюгу
ділянками ДНК.

Розроблено теорію електростатичного внеску у вигин молекули ДНК на
підставі рівняння Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра. Теорія
вперше дозволяє кількісно оцінити ефект асиметричної нейтралізації
зарядів, яка значно полегшує вигин ДНК у складі нуклеопротеїнових
комплексів.

Аналіз конформаційної динаміки нуклеосом у залежності від іонної сили
удосконалює уявлення про основний механізм такої динаміки, яка зумовлена
можливістю руйнування електростатичних контактів гістонів з ДНК та
контактів димера гістонів Н2А-Н2В з тетрамером (Н3-Н4)2.

Розроблена теорія позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар
основ ДНК є оригінальним ефективним засобом передбачати переважні
нуклеосомні позиції з точністю до 10 п.о.

Вперше показано існування структурної динаміки нуклеосоми та інших
нуклеогістонових комплексів у складі циркулярної ДНК за фізіологічних
умов. Вперше охарактеризовані певні конформаційні стани нуклеосоми та
інших нуклеогістонових комплексів, які залежать від топологічного стану
ДНК. Вперше продемонстровано вплив послідовності пар основ ДНК та
ацетилування гістонів на структурну динаміку нуклеосоми.

Вперше запропоновано динамічну модель організації хроматину, згідно з
якою головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів
хроматину є значне підвищення конформаційної рухливості ДНК, що є
необхідною умовою функціонування геному.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в дисертації
результати мають значення для розуміння молекулярної організації
хроматину та функціонування апарату спадковості, а також загальних
принципів нуклеопротеїнових взаємодій. Розроблена теорія взаємодії
позитивно заряджених лігандів з ДНК може бути застосована для аналізу
термодинаміки взаємодії білків з ДНК, теорія електростатичного внеску у
вигин ДНК – для вивчення широкого класу нуклеопротеїнових комплексів, в
яких ДНК є вигнутою. Теорія позиціювання нуклеосом застосовується на
практиці для передбачення переважних позицій нуклеосом на певних
фрагментах ДНК. Ця теорія може бути також використана для аналізу
потенційних особливостей структури хроматину геномних послідовностей
ДНК. Підходи, що розроблені для досліджень структурної динаміки
нуклеосом у складі циркулярної ДНК, можуть бути використані для
дослідження особливостей структури та конформаційних перетворень інших
нуклеопротеїнових комплексів.

Особистий внесок здобувача. Усі результати, як експериментальні, так і
теоретичні, що наведені в дисертації, були отримані здобувачем особисто.
Те саме стосується розроблених методів аналізу даних та узагальнюючих
теоретичних концепцій. В обговоренні результатів приймали участь
С.М.Храпунов та А.Прюнель (Інститут Жака Моно, Франція).
Експериментальний підхід щодо релаксації циркулярної ДНК у присутності
ДНК-топоізомерази І розроблено сумісно з А.Прюнелем. Клітинні ядра були
надані для дослідження Н.В.Бондар та С.Ф.Безруковим; плазміди, що
містять певні фрагменти ДНК, та гістонові комплекси – співробітниками
Інституту Жака Моно (Франція) А.Прюнелем, Ф. Де Лючія, М. Алілятом та
К.Лавелем; гістон Н5 та його фрагменти – В.Рамакрішнаном (Кембриджська
Лабораторія молекулярної біології, Велика Британія). Усім вказаним
особам автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи оприлюднені на IX
симпозіумі “Структура и функции клеточного ядра” (Черноголовка, 1987),
VI конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), X
симпозіумі “Структура и функции клеточного ядра” (Гродно, 1990), 9
конференції “Ферменты микроорганизмов – нуклеазы” (Казань, 1991), VIІ
конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1991), XІ симпозіумі
“Структура и функции клеточного ядра” (Санкт-Петербург, 1993),
Міжнародному біофізичному конгресі (Амстердам, 1996), нараді
Європейської молекулярно-біологічної лабораторії з транскрипції
(Гейдельберг, 1996), конференції “Structures nuclйaires et chromatine”
(Париж, 2000), XII Конференції з біомолекулярної стереодинаміки (Олбані,
США, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 30 друкованих праць,
з них 22 статті та тези 8 доповідей на наукових конференціях та з’їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, шести
розділів, висновків, списку використаних джерел. Перший розділ
присвячено огляду літератури, другий – опису матеріалів та методів
дослідження, в інших розділах викладено результати власних досліджень та
їх обговорення. Дисертація ілюстрована 77 рисунками та 11 таблицями.
Перелік використаних джерел охоплює 351 найменування. Дисертаційну
роботу викладено на 305 сторінках машинописного тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. В роботі використано клітинні ядра
печінки щурів та гістонові комплекси (октамер гістонів (Н2А-Н2В-Н3-Н4)2,
димер Н2А-Н2В, тетрамер (Н3-Н4)2, лінкерний гістон Н5 та його глобулярна
частина GH5), які виділяли з ядер еритроцитів курчат та очищували за
стандартними методиками. Використано також ацетильовані гістонові
комплекси з культури клітин мишачої лімфоїдної лейкемії та гістони Н3 і
Н4 з усуненими кінцевими невпорядкованими ділянками (хвостами), які було
отримано з оброблених трипсином нуклеосомних кор-частинок еритроцитів.
Для досліджень релаксації у присутності ДНК-топоізомерази І використано
дві серії фрагментів ДНК розміром від 349 до 366 п.о. (з кроком 1–2
п.о). Перша серія, позначена як Taq, веде походження від певного
фрагменту плазміди pBR322, друга (Bam) – від ділянки гена 5S рРНК
морського їжака Lytechinus variegatus. Фрагменти довжиною 256 та 359
п.о. серії Bam використовували для досліджень флуоресценції бромистого
етидію (БЕ). Ділянка фрагмента 256 п.о. довжиною 199 п.о. (із
радіоактивною міткою на 5′-кінці одного чи іншого ланцюгу)
використовувалася для футпринтинга ДНК за допомогою ОН• радикалів.

Приготування топоізомерів. Лінійні фрагменти ДНК циркуляризували за
допомогою ДНК-лігази у присутності бромистого етидію (для отримання
негативних топоізомерів) чи нетропсину (для отримання позитивних
топоізомерів). Окремі топоізомери розділяли шляхом препаративного
електрофорезу в поліакриламідному гелі, із смуг якого екстрагували ДНК.
Для досліджень релаксації з топоізомеразою І фрагменти перед
циркуляризацією було дефосфорильовано та помічено на 5′-кінцях
радіоактивним фосфором 32Р.

Реконструкція нуклеогістонових комплексів проводилась за стандартними
методами ступінчастого діалізу суміші певного комплексу з ДНК у 2 М NaCl
проти буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 7,5) або сольового
стрибка від 2 до 0,5 М NaCl та наступного діалізу проти буферу ТЕ.

Футпринтинг ДНК. Нуклеогістонові комплекси, реконструйовані на лінійному
199 п.о. фрагменті ДНК, оброблялися ОН• радикалами за методом Dixon et
al. (1991), після чого зразок наносили на поліакриламідний гель для
електрофорезу в нативних умовах. Відповідні смуги вирізалися з цього
гелю, із них отримували розщеплену ДНК, яку наносили на поліакриламідний
сіквенуючий гель для електрофорезу в денатуруючих умовах. Нуклеосоми,
реконструйовані на певних топоізомерах, обробляли мікрококовою
нуклеазою. Отримані таким чином кор-частинки нуклеосом обробляли ДНКазою
І. Після електрофорезу в нативних умовах ДНК екстрагували з відповідних
смуг, мітили радіоактивним фосфором 32P та наносили на сіквенуючий гель.

Релаксація у присутності ДНК-топоізомерази І. Реконструйовані комплекси
інкубували з еукаріотичною ДНК-топоізомеразою І у буфері релаксації
(приблизно фізіологічна іонна сила) при 37°С та наносили на
поліакриламідний гель для електрофорезу в нативних умовах. ДНК із
відповідних смуг релаксованих комплексів екстрагували та наносили на
поліакриламідний гель для електрофорезу в присутності хлорокіну з метою
кількісного аналізу складу топоізомерів.

Електрофорез у нативних умовах проводили у 4% поліакриламідному гелі у
буфері ТЕ. Електрофорез із метою розділення топоізомерів проводили у 4%
поліакриламідному гелі у присутності хлорокіну. Електрофорез у
денатуруючих умовах проводили на апараті та за стандартним протоколом
фірми “BioRad”. Усі гелі було візуалізовано на фосфоріміджері Storm
(“Molecular Dynamics”). Кількісний аналіз гелів проводився за допомогою
програмного забезпечення ImageQuant (“Molecular Dynamics”).

Флуоресценція вимірювалася у кварцових кюветах при 25°С на
спектрофлуориметрах “Элюмин-2М” або “Hitachi F-2000”. Власну
флуоресценцію гістонів збуджували світлом із довжиною хвилі 280 нм,
реєстрували при 304 нм. Флуоресценцію БЕ збуджували світлом при 330 нм,
реєстрували при 600 нм. Ступінь зростання флуоресценції БЕ
використовували для визначення щільності адсорбції БЕ на ДНК х (число
адсорбованиих молекул на пару основ) та концентрації вільного барвника
L.

Теоретичні методи. Для моделювання конформації ДНК у складі
реконструйованих комплексів було застосовано теорію рівноважних
конфігурацій еластичного стержня (Tobias et al., 1994), яка дає змогу,
для певних граничних умов, знайти для кожного значення ?Lk (різниця між
Lk та найбільш вигідним твістом) циркулярної ДНК малого розміру
(мініциклу) певну рівноважну конфігурацію петлі, її еластичну енергію,
райзинг мініциклу Wr та рівень торсійних напружень у складі петлі ?Tw.
Підгонка теоретичних моделей під експериментальні результати
здійснювалась за методом Жордана-Гаусса за допомогою спеціально
розробленої комп’ютерної програми. Якість підгонки оцінювалась за
критерієм ч2. Процес адсорбції БЕ аналізувався у межах моделі з
перекриттям потенційних сайтів зв’язування (McGhee and von Hippel, 1974)
та оригінальної моделі двох структурних станів нуклеопротеїнової
частинки. Результати релаксації нуклеогістонових комплексів
аналізувалися на підставі оригінальних моделей двох чи трьох структурних
станів.

Механізми електростатичних нуклеопротеїнових взаємодій у складі
хроматину. У межах широко відомої теорії конденсації протиіонів Меннінга
(Manning, 1978) навкруг такого високо зарядженого поліелектроліту, яким
є ДНК, утворюється шар конденсованих протиіонів високої локальної
концентрації, яка не залежить від зовнішньої іонної сили розчину. Тоді
заряд на фосфатних залишках ДНК є екранованим завдяки шару протиіонів, і
головний внесок у електростатичну енергію системи дає ентропія
змішування конденсованих протиіонів. На підставі уявлень Менінга
Рекордом та співавт. (Anderson and Record, 1982) розроблено теорію
взаємодії позитивно заряджених лігандів із нуклеїновими кислотами, яка
часто використовується для оцінки числа електростатичних контактів у
комплексі такого ліганду з нуклеїновою кислотою.

Проте, опис найближчого іонного оточення ДНК за Менінгом є досить грубим
спрощенням. Як свідчать різноманітні теоретичні та експериментальні
дослідження, в області іонної сили до 1 М одноосновної солі розподіл
іонів навкруг ДНК досить точно описується рівнянням Пуассона-Больцмана
(ПБ-рівняння) для рівномірно зарядженого циліндра.

Теорія електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів із ДНК.
З метою побудувати теорію взаємодії, яка була б зручною для аналізу
конкретних випадків взаємодії позитивних лігандів з ДНК, ми
використовуємо спрощене ПБ-рівняння (Fuoss et al., 1951; Le Bret and
Zimm, 1984), яке нехтує присутністю коіонів у найближчому оточенні ДНК,
але має аналітичне рішення.

На підставі спрощеного ПБ-рівняння у роботі отримані аналітичні вирази
для електростатичної енергії поліелектроліту та показано, що значення
енергії практично не відрізняються від результатів чисельних розрахунків
за строгим ПБ-рівнянням. На основі отриманого аналітичного виразу
електростатичної енергії було одержано рівняння, що пов’язує константу
зв’язування позитивно зарядженого ліганду з ДНК із зарядом ліганду
(числом нейтралізованих фосфатних залишків у сайті взаємодії) N, його
розміром (загальним числом фосфатних залишків у сайті взаємодії) Z,
неелектростатичними внесками в енергію взаємодії та іонною силою розчину
С. Залежність логарифма константи від логарифма концентрації солі може
бути апроксимована, особливо у вузькому інтервалі іонної сили, прямою
лінією, як це й спостерігається у багатьох експериментах. У граничному
випадку С ? 0 нахил логарифмічної залежності константи від концентрації
солі дорівнює –0,88N, що співпадає з результатом Рекорда і співавт.,
теорія яких, таким чином, є граничним випадком запропонованої теорії.

Більшість білків, які взаємодіють з ДНК за електростатичним механізмом,
не повністю нейтралізують сайт зв’язування на ДНК (Z > N). Такий
випадок, що він є більш загальним, має свої особливості у порівнянні з
повною нейтралізацією (Z = N). Зростання Z практично не впливає на
характер залежності константи від іонної сили, але призводить до
значного зростання її абсолютної величини. При С=0,1 М та N=5 зростання
Z від 5 до 10 підвищує константу майже на три порядки, при Z?3N значення
константи виходить на плато. Отже, при однаковому числі
електростатичних контактів, зв’язування з ДНК ліганду більшого розміру є
більш вигідним енергетично. Фізичний механізм такого підвищення
спорідненості при неповній нейтралізації сайту взаємодії на ДНК полягає
у підвищенні числа протиіонів, які визволяються у зовнішній розчин після
зв’язування ліганду.

Запропонований підхід на підставі спрощеного ПБ-рівняння повністю
підтверджує головний висновок розроблених раніш теорій поліелектролітів:
визволення протиіонів у зовнішній розчин є головним фізичним механізмом
зв’язування з ДНК позитивно заряджених лігандів. Але наш підхід дозволяє
більш точно кількісно описати процес взаємодії позитивних лігандів із
ДНК та отримати більш адекватні способи аналізу експериментальних даних
із метою оцінки числа електростатичних контактів та внесків від
неелектростатичних взаємодій. Крім того, запропонована теорія виявляє
невідомий раніш ефект зростання спорідненості ліганду до ДНК при
збільшенні його розміру.

Компактизація ДНК у присутності полікатіонів. Білки, що компактизують
ДНК у клітинному ядрі, мають деякі типові ознаки. Вони є, повністю або у
частині молекули, невпорядкованими поліпептидами, що містять позитивно
заряджені амінокислоти, які, як правило, згруповані у кластери. Очевидне
припущення полягає в тому, що такі кластери можуть незалежно один від
одного взаємодіяти з віддаленими по ланцюгу ділянками ДНК. Розглянуто
теоретичну модель, компонентами якої є безмежно довга молекула ДНК у
розведеному водному розчині, одноосновна сіль та ліганд, що складається
з двох кластерів позитивних залишків. Кластери з’єднані гнучкою ділянкою
поліпептидного ланцюга, тобто ліганд може утворювати полікатіонний
місток, коли два кластери взаємодіють із віддаленими по ланцюгу сайтами
ДНК.

Одержано рівняння, що оцінює хімічний потенціал ланки ДНК м як функцію
енергії електростатичного розштовхування між ланками та енергії
утворення полікатіонного містка. Обидва внески залежать від щільності
клубка ДНК та іонної сили розчину: перший знижується, другий зростає при
підвищенні концентрації солі. Мінімізація м дає оцінку рівноважної
об’ємної щільності ланок та умову переходу клубка у компактний стан
(глобулу), звідки знайдена “фазова діаграма” для переходу клубок-глобула
у координатах з (відношення загальної концентрації ліганду до загальної
концентрації сайтів зв’язування на полімері) та концентрації солі С.

Як показує “фазова діаграма”, при низьких значеннях іонної сили ліганд
не може компактизувати ДНК при будь-яких значеннях з: незважаючи на
високу ефективність електростатичних взаємодій ліганду з ДНК, високе
електростатичне розштовхування не дозволяє перевести полімер у
компактний стан. Підвищення іонної сили призводить до зниження
розштовхування між ланками полімеру і, відповідно, до полегшення
утворення компактної форми. Причому оптимум має місце приблизно при
фізіологічних значеннях концентрації солі. Дисоціація ліганду при
подальшому підвищені іонної сили знов робить компактизацію неможливою.
Отже, компактизація ДНК у присутності полікатіонів та характер
залежності цього процесу від іонної сили добре пояснюються, якщо
прийняти утворення полікатіонних містків як єдиний молекулярний механізм
компактизації. Суттєвим моментом при цьому є та обставина, що “запуск”
процесу утворення містків є можливим лише після досягнення певного рівня
нейтралізації зарядів ДНК сумісною дією полікатіона та
низькомолекулярних катіонів. Викладена теорія, яка носить якісний
характер, добре пояснює відомі властивості компактизації хроматину: в
умовах низької іонної сили in vitro хроматинова фібрила є
декомпактизованою низкою нуклеосом, яка формує компактну фібрилу
товщиною 30 нм за фізіологічних іонних умов. Зрозуміло, що викладена
теорія описує лише загальний механізм процесу компактизації внаслідок
утворення полікатіонних містків невпорядкованими ділянками корових
гістонів та лінкерного гістона Н1.

Електростатичний внесок у вигин ДНК. З метою проаналізувати зміни
електростатики при вигині, молекула ДНК знов була апроксимована як
рівномірно заряджений циліндр. При вигині такого циліндра поверхнева
щільність заряду перетворюється у неоднорідну – збільшується з того
боку, куди здійснюється вигин, та зменшується – з протилежного.
Відповідно, якщо для прямого циліндра потенціал залежить лише від
відстані від осі, у ПБ-рівнянні вигнутого циліндра з’являється кутова
залежність потенціалу. Ці зміни позначені далі як зміни електростатичних
взаємодій на короткій відстані. Іншим наслідком вигину є зменшення
відстані між будь-якими двома точками вздовж осі полііона (зміни на
довгій відстані). У роботі запропонована форма ПБ-рівняння для вигнутого
циліндра, яка бере до уваги лише ефекти першого типу. ПБ-рівняння для
вигнутого циліндра у повній формі було раніше вирішено Фіксманом
(Fixman, 1982) із метою описати залежність від іонної сили персистентної
довжини ДНК. Оскільки рівномірний вигин є неможливим у розчині, де
напрям кривизни у будь-якій точці є випадковим, модель Фіксмана дає
верхню оцінку електростатичного внеску в персистентну довжину.

Запропоноване “редуковане” ПБ-рівняння було вирішено чисельно.
Залежність електростатичної енергії від радіуса кривизни ДНК дає оцінку
електростатичного внеску в персистентну довжину. Оскільки враховуються
тільки електростатичні взаємодії на короткій відстані, наш підхід
дозволяє оцінити нижню границю такого внеску. Реальні експериментальні
значення персистентної довжини (Hagerman, 1981; Kam et al., 1981;
Cairney and Harrington, 1982) знаходяться між двома теоретичними
оцінками в області низької іонної сили та узгоджуються з ними при
концентрації солі вище 10 мМ, коли дві теоретичні моделі практично
співпадають, і персистентна довжина перестає залежати від іонної сили.
Оскільки наш підхід є більш простим, ніж підхід Фіксмана, він може бути
легко застосованим для оцінки електростатичного внеску в рівномірний
вигин ДНК у складі нуклеопротеїнових комплексів при іонній силі вище 10
мМ.

Була розглянута модель, в якій ДНК вигинається на поверхні білка при
нейтралізації фосфатних залишків у зоні контакту (асиметрична
нейтралізація). Відповідні граничні умови дають нове рішення ПБ-рівняння
та оцінку електростатичної енергії для цього випадку. Важлива роль
асиметричної нейтралізаціїї зарядів ДНК у стабілізації вигнутого стану
ДНК у нуклеосомі була запропонована раніше (Mirzabekov and Rich, 1979).
Отримані співвідношення та їх чисельне вирішення дозволяють оцінити цей
ефект кількісно та з’ясувати його фізичний механізм.

Головним внеском в електростатичну енергію є внесок від ентропії
змішування іонної атмосфери навкруг ДНК. Відповідно, електростатична
енергія вигину залежить, головним чином, від ентропійних витрат на
перерозподіл іонів у межах іонної атмосфери. Слабка залежність
персистентної довжини від іонної сили вказує, що цей перерозподіл
практично не залежить від концентрації іонів у зовнішньому розчині.
Тобто, підвищення локальної концентрації протиіонів там, де поверхнева
щільність заряду підвищується внаслідок вигину, приблизно компенсується
зниженням локальної концентрації протиіонів на протилежному боці
циліндра. При цьому середня локальна концентрація, як і для прямого
циліндра, майже не змінюється.

Але, при асиметричній нейтралізації заряду на поверхні циліндра у складі
нуклеопротеїнового комплексу, пониження щільності заряду на протилежному
відносно білка боці молекули ДНК супроводжується визволенням деякої
частини протиіонів у зовнішній розчин. Таке визволення є тепер
некомпенсованим (протилежний бік є нейтралізованим), тобто призводить до
підвищення ентропії системи: електростатичний внесок у енергію вигину
ДНК у цьому випадку є негативним (вигідним) і таким, що залежить від
іонної сили. Застосування отриманих рівнянь до вигину ДНК у нуклеосомі
показує, що в області С між 0,01 та 0,1 М приблизно 30–50%
неелектростатичних витрат на вигин є компенсованими завдяки
електростатичного внеску, тобто асиметрична нейтралізація суттєво
стабілізує структуру нуклеосоми.

Конформаційні перетворення нуклеосоми, що залежать від іонної сили
розчину, були досліджені за допомогою методів власної тирозинової
флуоресценції гістонів на нуклеосомах, реконструйованих на полімерній
ДНК. Результати проаналізовані на підставі розглянутих вище теоретичних
підходів.

Зниження іонної сили від 2,5 до 1 мМ NaCl призводить до суттєвого
зниження анізотропії флуоресценції. Аналіз літературних даних указує, що
це свідчить про руйнування контактів між димером Н2А-Н2В та тетрамером
(Н3-Н4)2 у складі нуклеосоми, при цьому відбувається розгортання
кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК довжиною ~20 п.о. Побудована
теоретична модель, що описує ймовірність компактного нерозгорнутого
стану ділянки. Вільна енергія компактного стану має три внески: енергія
вигину ділянки; енергія гістон-гістонових взаємодій між димером і
тетрамером; енергія електростатичного розштовхування між кінцевою
ділянкою та центральним витком нуклеосомної ДНК. Перший та останній
внески є несприятливими (позитивними), другий – сприятливим для
компактного стану. Енергія вигину була оцінена на підставі викладеного
вище теоретичного підходу. Енергія гістон-гістонових взаємодій – на
підставі значень константи зв’язування димера з тетрамером у 2 М NaCl
(Benedict et al., 1984). Порівняння з експериментальними результатами
свідчить, що зростання електростатичного розштовхування є основною
силою, що сприяє розгортанню кінцевих ділянок при пониженні іонної сили.

Екстраполяція енергії розштовхування до фізіологічної іонної сили
вказує, що ця енергія прямує до 0 в області С ~ 100 мМ. Крім того,
знижується спорідненість гістонів до ДНК (згідно до теорії
електростатичних взаємодій). В результаті змінюється енергетичний
баланс: якщо при С = 1 мМ руйнування контактів димера з тетрамером є
значно більш легким, ніж руйнування контактів димера з ДНК, у
фізіологічних умовах більш легким стає руйнування електростатичних
ДНК-гістонових контактів. Кількісні оцінки вказують на можливість
спонтанного розгортання кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК за
фізіологічних умов. Цей висновок підтверджується результатами Anderson
et al. (2002) та описаними нижче результатами щодо конформаційної
динаміки нуклеосоми.

Добре відомо, що при зростанні іонної сили відбувається дисоціація
нуклеосоми: в області концентрації NaCl ~0,6–1,2 М дисоціює димер
гістонів Н2А-Н2В, при ~1,2–2,0 М – тетрамер (Н3-Н4)2. Цей процес також
було досліджено методами тирозинової флуоресценції. Одночасний вимір
інтенсивності та анізотропії флуоресценції дозволив окремо реєструвати
ступінь дисоціації димера Н2А-Н2В та тетрамера (Н3-Н4)2 від ДНК:
анізотропія фіксує руйнування контактів димера з тетрамером,
інтенсивність – контактів обох комплексів із ДНК. Окремо досліджена
також дисоціація комплексу димера з ДНК у відсутності тетрамера.
Термодинамічний аналіз отриманих кривих дисоціації дозволив розрахувати
залежність від іонної сили відповідних констант зв’язування. Ці
залежності, в свою чергу, були проаналізовані на підставі теорії
електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів із ДНК.
Отримані параметри (табл. 1) дозволяють зробити наступні висновки.

Нуклеосомна ДНК стабілізована 26 електростатичними контактами (приблизно
в середньому 1,9 контакти на виток подвійної спіралі) з глобулярною
поверхнею октамера гістонів, що добре узгоджується з кристалографічними
даними Luger et al. (1997). Це демонструє можливості застосованої
теорії.

При взаємодії димера з нуклеосомою (на відміну від його взаємодії з
вільною ДНК) з’являється досить великий негативний неелектростатичний
внесок у загальну енергію взаємодії, який зумовлює зростання
спорідненості димера до нуклеосоми. Очевидно, що цей внесок складається
з двох компонент: негативна енергія взаємодії димера з тетрамером (яка
превалює) та позитивна енергія вигину ДНК.

Таблиця 1

Параметри взаємодії гістонових комплексів з ДНК

Тип комплексу Число електроста-тичних контактів N* Неелектростатичний
внесок у енергію взаємодії ДGT (kBT)**

Димер Н2А-Н2В, взаємодія з ДНК 6 0

Димер Н2А-Н2В, взаємодія з нуклеосомою 6 – 7,3

Тетрамер (Н3-Н4)2 14 +6,4

* із глобулярною частиною комплексів – невпорядковані хвости вже не
взаємодіють з ДНК в зоні дисоціації.

**kB – константа Больцмана, T – абсолютна температура.

Оцінка обох компонент на підставі відомих величини вигину в нуклеосомі
та параметрів взаємодії між димером та тетрамером дає добре узгодження з
величиною, наведеною в табл.1. Позитивний внесок в енергію взаємодії
тетрамера з ДНК зумовлений вигином ДНК у комплексі з тетрамером
(тетрасомі), але його величина (табл. 1) відповідає радіусу кривизни 8,5
нм – приблизно у два рази більше, ніж у нуклеосомі. Тобто, в зоні
дисоціації тетрасома характеризується значним латеральним відкриттям
відносно її структури у нуклеосомі. Як показано нижче, потенційна
можливість латерального відкриття тетрасоми реалізується у фізіологічних
умовах під дією надспіралізації у циркулярній ДНК.

Вигин ДНК та позиціювання нуклеосом відносно послідовності нуклеотидів.
У складі хроматину нуклеосоми утворюються на великій кількості різних
послідовностей ДНК, і, практично, завдяки величезній ефективності
електростатичних взаємодій, ДНК будь-якої природної послідовності здатна
бути інкорпорованою в нуклеосому. Проте велика кількість
експериментальних даних свідчить про феномен переважного позиціювання
нуклеосом на певних послідовностях ДНК, і таке позиціювання є дуже
важливим для регуляції генетичної активності.

З метою з’ясувати механізм позиціювання було запропоновано модель
нуклеосомної ДНК як гетерогенного ізотропного стержня, еластичні
властивості якого залежать від послідовності пар основ уздовж подвійної
спіралі. Застосовано два набори констант жорсткості щодо вигину для 10
типів динуклеотидних контактів у ДНК. Перший набір базується на вимірах
персистентної довжини для синтетичних полімерів (Hogan and Austin,
1987), другий – на даних щодо температури плавлення динуклеотидів у
складі ДНК (Gotoh and Tagashira, 1981). Обидва набори дають подібні
результати щодо енергії вигину нуклеосомної ДНК певної послідовності.
Згідно запропонованого алгоритму, в межах певної послідовності
розраховується величина енергії вигину для всіх можливих позицій
нуклеосомного “вікна” довжиною 125 п.о. У випадку досить короткої
молекули ДНК, яка може містити лише одну нуклеосому, точка мінімуму
енергії є точкою переважного позиціювання. Для довгих послідовностей
ДНК, які містять кілька нуклеосом, нуклеосоми розташовуються на
випадкових сайтах, що не перекриваються і характеризуються певними
значеннями енергії вигину. Далі застосовується стандартна процедура
Монте-Карло, яка дозволяє мінімізувати енергію вигину цієї системи.

Запропонована модель очевидно має декілька обмежень: застосовані
параметри потребують уточнення, еластичні властивості динуклеотидів
залежать від контексту послідовності, суперспіраль ДНК у нуклеосомі не є
ідеальною (у її складі присутні області більш та менш різкого вигину)
тощо. Незважаючи на це, модель виявляється достатньою, щоб, у багатьох
випадках, задовільно описати відомі з літератури експериментальні
результати щодо позиціювання нуклеосом in vitro з точністю до одного
витка подвійної спіралі.

Аналіз позиціювання нуклеосом на довгих фрагментах ДНК дозволяє
констатувати, що велике значення має також ефект границі, яка визначає
рамку розташування нуклеосом. Роль такої границі може відігравати
нуклеосома у певній найбільш імовірній позиції або регуляторний білок,
зв’язаний з ДНК у певному специфічному сайті.

Проведений аналіз указує також на інший важливий фактор позиціювання –
конформаційну рухливість нуклеосоми. Коли певна ділянка ДНК
характеризується дуже високою енергією, що її потрібно витратити на
вигин усієї ДНК у нуклеосомі, експериментальні результати свідчать про
змінену форму нуклеосоми з частковим розгортанням нуклеосомної ДНК. У
такому випадку розрахунки ймовірності позиціювання нуклеосоми призводять
до узгодження з експериментом, якщо довжина нуклеосомної ДНК є зниженою
приблизно до одного витка суперспіралі.

Структурна динаміка нуклеосоми у взаємозв’язку з топологією циркулярної
ДНК. Флуоресценція бромистого етидію. Представлений вище аналіз деяких
важливих аспектів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину вказує
на потенційну здатність нуклеосоми до структурних перетворень. Важливим
фактором, який може впливати на ці перетворення за фізіологічних умов, є
надспіралізація циркулярної ДНК. Далі викладені результати, які були
отримані при дослідженні хроматинових комплексів із циркулярною ДНК
методом флуоресценції БЕ. Барвник, інтеркалюючи між сусідніми парами
основ ДНК, розкручує їх на певний кут і, відповідно, викликає зміну
топологічного стану циркулярної ДНК. Завдяки вимірам флуоресценції БЕ,
можна дослідити процес його адсорбції на ДНК, який сам залежить від
рівня надспіралізації та еластичних властивостей ДНК. Якщо циркулярна
ДНК утворює нуклеопротеїновий комплекс, його конформаційні зміни, що
залежать від топології ДНК, будуть впливати на процес інтеркаляції.

Топологічні та еластичні властивості ДНК у складі клітинних ядер. ДНК
хроматинової петлі в клітинному ядрі є топологічно еквівалентною до
циркулярної ДНК, і для неї виконуються всі специфічні закономірності,
пов’язані з надспіралізацією. За рахунок того, що інтеркаляція БЕ
викликає у складі циркулярної ДНК (хроматинової петлі) надспіралізацію
позитивного знаку, спорідненість БЕ до інтактної або релаксованої шляхом
внесення одноланцюгових розривів петлі є різною. Після внесення розривів
у ДНК петлі (за рахунок опромінення лазерним світлом у присутності
слідової кількості БЕ або шляхом м’якої обробки ДНКазою І)
спостерігається зростання флуоресценції доданого БЕ, тобто спорідненості
барвника до ДНК. Шляхом флуоресцентного титрування було отримано
ізотерми адсорбції БЕ на ДНК клітинних ядер до та після внесення
одноланцюгових розривів. Аналіз ізотерм дозволяє визначити константу
зв’язування, частку доступної для барвника ДНК, щільність
надспіралізації у (яка була у відсутності БЕ) та силову константу
надспіралізації Ksc. Два останні параметри входять до відомого виразу
для вільної енергії надспіралізації Gsc, який для вільної циркулярної
ДНК має вигляд (тут і далі енергія в одиницях kBT):

Gsc = (Ksc/N)(?Lk)2, (1)

де N – загальна кількість пар основ, ?Lk = Lk – Lk0, Lk0 – найбільш
вигідний твіст лінійної ДНК у певних умовах. Оскільки у = ?Lk/Lk0, Gsc
можна виразити через у. Знаючи кут розкручування сусідніх пар основ за
рахунок інтеркаляції, неважко також врахувати рівень надспіралізації, що
залежить від присутності БЕ: треба замінити ?Lk у рівн.1 на ДLktot = ДLk
+ ДLkЕ, де ДLkЕ – рівень надспіралізації, що вноситься барвником.

Ізотерми адсорбції були отримані також у присутності гепаріну, який
ефективно знімає білки з ДНК. Усі параметри, що оцінені в результаті
аналізу ізотерм (частка доступної ДНК, щільність надспіралізації у ядрах
до та після видалення білків, середній розмір хроматинової петлі), є
очікуваними на підставі даних літератури. Але єдиний параметр – значення
Ksc для нативних (у відсутності гепаріну) ядер – виявився несподівано
низьким.

Силова константа надспіралізації показує, наскільки швидко зростає
енергія еластичних напружень при зростанні надспіралізації (рівн. 1).
Згідно класичного рівняння Уайта-Фуллера ?Lk = ?Tw + Wr, еластичні
напруження певним чином розділюються між змінами твісту ?Tw (торсійні
напруження) та вигином ДНК, який призводить до ненульового райзингу Wr.
Для мініциклів ДНК (див. нижче) вигин є дуже невигідним енергетично, усі
напруження реалізуються як торсійні, і Ksc має значення ~4000. Для більш
довгих циркулярних плазмід існують значні флуктуації Wr, що знижує Ksc
до ~1000. Значення Ksc для ядер у присутності гепаріну (1800(300) є дещо
більшим, ніж для циркулярних плазмід, що можна пояснити утрудненням
конформаційної рухливості ДНК у межах малого об’єму ядра. ДНК у складі
хроматину нативних ядер має певну просторову організацію, що вона
залежить від міцних нуклеопротеїнових взаємодій. Отже можна було б
очікувати, що райзинг хроматинової петлі не може змінюватись, ДНК
хроматину є завдяки цьому дуже жорсткою (еластичні напруження
реалізуються тільки у вигляді змін твісту), і значення Ksc наближається
до своєї верхньої оцінки. Але експеримент указує, що величина Ksc для
нативних ядер є навіть майже в два рази меншою, ніж після усунення
гістонів (1100(300). Отже, ДНК хроматину нативних клітинних ядер
зберігає високу конформаційну рухливість. Цей на перший погляд
парадоксальний висновок знаходить своє пояснення у механізмах
конформаційної рухливості нуклеосоми та інших нуклеогістонових
комплексів, результати вивчення яких представлено нижче.

Топологічні та еластичні властивості вільних мініциклів ДНК. Ізотерми
адсорбції БЕ були отримані для двох лінійних фрагментів ДНК довжиною 256
та 359 п.о., а також для окремих циркулярних топоізомерів цих
фрагментів. Дві ізотерми, “лінійну” та “циркулярну”, можна об’єднати в
одну, зобразивши залежність ln(Llin/L) від щільності зв’язування х БЕ на
ДНК (L – концентрація вільного БЕ для топоізомера, Llin – концентрація
вільного БЕ, що є необхідною для досягнення того самого значення х на
лінійній ДНК). Ордината такої залежності порівнює спорідненості БЕ до
циркулярної та лінійної ДНК: якщо ордината є позитивною, то
спорідненість до циркулярної ДНК є більш високою; якщо ордината є
негативною, – навпаки. Приклад такої ізотерми для топоізомера з ДLk =
–1,15 (256 п.о.) представлено на рис. 1. Для циркулярних плазмід
більшого розміру ізотерма є прямою лінією, нахил якої є пропорційним до
силової константи надспіралізації Ksc. Для мініциклу (рис.1) замість
однієї можна виділити три послідовних лінійних ділянки з різною
величиною нахилу до осі абсцис. Аналогічно виглядають ізотерми для
негативного топоізомера 359 п.о.

Рис. 1. Ізотерми адсорбції БЕ на вільному топоізомері з ДLk = –1,15 (256
п.о.) у двох буферах (ТЕ-NaCl – буфер ТЕ+100 мМ NaCl). ДLktot= ДLk+ДLkЕ
– загальний рівень надспіралізації у мініциклі. Цифрами І, ІІ, ІІІ
позначені послідовні лінійні ділянки ізотерм. Відповідні конфігурації
мініциклу розраховані в межах теорії рівноважних конфігурацій для різних
значень ДLk.

Ділянка І має високий нахил (Ksc=5400(800) – спорідненість швидко
знижується при зростанні щільності зв’язування. В цьому жорсткому режимі
(значення Ksc свідчить про відсутність внеску райзингу в загальний
рівень еластичних напружень) ізотерма перетинає ось абсцис (нульову
лінію). У точці перетину вихідне негативне значення ДLk топоізомера є
компенсованим завдяки позитивному внеску в надспіралізацію від
інтеркальованого БЕ. Після проходження точки релаксації, починаючи
приблизно із загальної величини ДLktot=+0,3 (рис.1), спостерігається
зміна жорсткого режиму на більш гнучкий – ділянка ІІ, Ksc=1400(800, що
практично збігається зі значенням силової константи для плазмідної ДНК.
Можна вважати, що мініцикл у режимі ІІ здатен ефективно змінювати свій
райзинг. На відміну від циркулярної ДНК великої контурної довжини, в
мініциклі райзинг змінюється раптово після накопичення певного рівня
торсійних напружень – відбувається так званий “натиск райзингу”. Це
явище добре вивчено теоретично, його ілюструють також результати
розрахунків рівноважних конфігурацій мініциклів у залежності від ДLk.
До певного значення ДLk можливою є лише планарна конфігурація, для якої
ДLk = ДTw, – інші конфігурації потребують значного вигину мініциклу, що
дорого коштує енергетично. Енергія при цьому, яка є практично енергією
торсійних деформацій, швидко зростає за параболою з великим коефіцієнтом
(силовою константою). При певному значенні ДLk виникає ситуація, коли
більш вигідним енергетично є значний вигин у кільці з утворенням
8-подібної конфігурації (рис. 1), оскільки після цього енергія починає
зростати значно повільніше. При деякій кількості супервитків вигин ДНК у
маленьких термінальних петлях стає надмірно великим, і тоді режим
титрування ІІ змінюється знов на жорсткий режим ІІІ (рис. 1). Рівень
еластичної напруги, при якій це відбувається, залежить від контурної
довжини мініциклу: режим ІІ для негативного топоізомеру 359 п.о.
продовжується до значно більших значень щільності зв’язування (рівня
позитивної надспіралізації). Для позитивного топоізомеру того ж
мініциклу початковий жорсткий режим зникає – додаткова позитивна
надспіралізація відразу накопичується у вигляді супервитків 8-подібної
конфігурації.

Отже, флуоресценція БЕ дозволяє зафіксувати процес перетворення
мініциклу з планарного кільця у 8-подібну перекручену форму. Це є першим
експериментальним доказом реальності такого перетворення. Наслідком
перетворення є значне зниження загальної жорсткості ДНК: необхідно
тільки витратити деяку енергію на початковий вигин ДНК, після чого
еластичні напруження накопичуються з меншими енергетичними витратами.
Такі властивості відразу відкривають один з шляхів збільшення
конформаційної рухливості ДНК у складі нуклеопротеїнових комплексів, де,
за рахунок взаємодій з білком, ДНК вже є значно вигнутою і вже має
ненульовий райзинг. Тобто у місці входу-виходу ДНК з комплексу можуть
утворюватись певні граничні умови, що сприяють більш легкій зміні
райзингу при появі еластичних напружень.

Конформаційна рухливість кінцевих ділянок ДНК у нуклеосомі. Ізотерми
адсорбції БЕ на мініциклах, що містять реконструйовану нуклеосому, є
дещо схожими на такі, що спостерігаються для вільного топоізомера (рис.
2). Ізотерми починаються з короткої ділянки з високим нахилом до осі
абсцис – жорсткого режиму. Частина негативної надспіралізації
топоізомера (ДLkp) знята нуклеосомою (за рахунок утворення лівої
суперспіралі на поверхні октамера гістонів), барвник титрує лише частку
напружень, що залишилися в складі вільної петлі. Точка перетину нульової
лінії дозволяє оцінити ДLkp = –0,93. Ця величина є характерною для
відкритої форми нуклеосоми без перехрещень лінкерних ділянок, що вона
повинна бути реалізованою на топоізомері з ДLk = –1,15 (див. нижче).
Жорсткий режим змінюється на дуже гнучкий, якому відповідає Ksc ~ 300,
тобто значно нижче, ніж для вільного топоізомера. Гнучкий режим
починається із загального ДLktot ~ –1,2 (тобто коли вільна петля у
складі мініциклу перетворюється на релаксовану) і продовжується до
ДLktot ~ –0,2. Тобто надспіралізація петлі змінюється приблизно на +1,
що вказує на формування позитивного перехрещення у складі петлі. Таке
перехрещення спостерігається під електронним мікроскопом у присутності
БЕ.

Рис. 2. Ізотерми адсорбції БЕ на топоізомері з ДLk = –1,15 (256 п.о.),
на якому реконструйовані контрольні чи ацетильовані нуклеосоми.
Позначення як на рис. 1. Суцільні криві є результатом інтерполяції
даних.

Отже, на відміну від вільного мініциклу, петля у присутності нуклеосоми
характеризується значно вищою конформаційною рухливістю. Рухливість
зростає всупереч: 1) значному зменшенню контурної довжини петлі у
порівнянні з такою мініциклу; 2) тому факту, що ДНК формує ліву
суперспіраль на поверхні октамера гістонів, тобто можна було б
очікувати, що утворення позитивного (правого) перехрещення лінкерів
повинно бути утрудненим у порівнянні з вільним мініциклом.

Висока конформаційна рухливість петлі у процесі зміни райзингу може
брати походження з кількох джерел. По-перше, утворення специфічних
граничних умов на кінцях петлі може сприяти значному полегшенню зміни
райзингу. По-друге, конформаційна рухливість самої нуклеосоми повинна
підвищувати загальну рухливість ДНК. По-третє, наближенню лінкерів при
утворенні позитивного перехрещення мають сприяти позитивно-заряджені
невпорядковані хвости гістонів. Утрата позитивних зарядів унаслідок
ацетилування хвостів призводить до підвищення жорсткості у гнучкому
режимі, тобто до утруднення формування позитивного перехрещення лінкерів
(рис. 2). Цей результат знаходить своє підтвердження в експериментах
щодо релаксації нуклеосом у присутності ДНК-топоізомерази І (див.
нижче).

Конформаційна рухливість тетрасоми. Ізотерма адсорбції БЕ на мініциклах,
що містять реконструйовану тетрасому, у буфері ТЕ починається з
приблизно нульових значень ln(Llin/L), що вказує на приблизно
релаксований стан петлі після реконструкції (рис. 3). Далі це значення
ординати зберігається до загального ДLktot ~ 1. Подібне плато при
високій спорідненості БЕ (значно більш високій, ніж для вільного
топоізомера та нуклеосоми при тих самих значеннях щільності зв’язування,
порівн. рис. 1, 2) вказує на структурне перетворення у тетрасомі зі
зміною її хіральності.

Рис. 3. Ізотерми адсорбції БЕ на топоізомері з ДLk = –0,87 (359 п.о.),
на якому реконструйовані тетрасоми. Позначення як на рис. 1. Суцільна
крива для ТЕ розрахована на підставі моделі двох структурних станів, для
ТЕ-NaCl – є інтерполяцією даних.

Можливість такого перетворення була вперше запропонована Hamiche et al.
(1996) на основі дослідження реконструкції тетрасом на негативних та
позитивних топоізомерах мініциклів. ДНК утворює в нуклеосомі і тетрасомі
ліву суперспіраль, відповідно, ДLkр має негативний знак (частинка знімає
негативну надспіралізацію у складі петлі). Під впливом позитивної
надспіралізації, що її індукує інтеркаляція БЕ, тетрасомна суперспіраль
перетворюється на правозакручену. Зміна хіральності суперспіралі змінює
знак ДLkр, і залежна від БЕ позитивна надспіралізація знімається
тетрасомою, що зберігає релаксований стан петлі до певних значень
щільності зв’язування. Подальше зростання щільності зв’язування викликає
акумуляцію позитивної надспіралізації, і спорідненість до БЕ швидко
знижується.

Розроблена модель двох структурних станів частинки у присутності БЕ
була використана для розрахунку ізотерми адсорбції. Узгодження з
експериментом (рис. 3) досягається при використанні параметрів: ДLkр =
–0,65±0,09 та +0,70±0,15, Ksc = 3600 та 2000 (±1200) для лівого та
правого станів відповідно, енергія переходу у правий стан ДGр = 1±1 kBT.
Параметри є дуже близькими до таких, що отримані на підставі аналізу
релаксації у присутності ДНК-топоізомерази І (див. нижче), якщо
врахувати різницю у періодичності ДНК в умовах релаксації та титрування.
Аналогічна ізотерма, отримана для мініциклу 256 п.о. (ДLk = –1,15),
також свідчить про структурний перехід у тетрасомі зі зміною
хіральності.

Ізотерма адсорбції у ТЕ + 100 мМ NaCl (рис. 3), на відміну від вільних
мініциклів (рис. 1) та нуклеосом (рис. 2), значно відрізняється від
ізотерми, отриманої у ТЕ. Зростання іонної сили очевидно призводить до
різкого зниження спорідненості БЕ та до неможливості досягти того самого
рівня позитивної надспіралізації, як у випадку ТЕ. Складається враження,
що структурне перетворення у тетрасомі є заблокованим. Механізм такого
блокування стає зрозумілим, якщо взяти до уваги необхідність зростання
ступеня закручення правої подвійної спіралі ДНК при перетворенні
тетрасоми у праву форму. Ймовірно, послаблення нуклеопротеїнових
взаємодій при зростанні іонної сили робить можливим інтеркаляцію БЕ
всередині частинки (достатньо однієї молекули барвника). Зрозуміло, що
така інтеркаляція є несумісною із закрученням подвійної спіралі, тобто
зі структурним перетворенням із зміною хіральності суперспіралі. Отже,
блокування структурного перетворення у присутності БЕ та зростанні
іонної сили є насправді ще одним доказом цього структурного
перетворення.

¦

?

?

Xp

¶

o

¦

?

Zn

p

¶

o

?

„@

¤x ¤x^„@

„A`„A

„A`„A

нструйованих на мініциклах, а також їх аналіз на підставі моделі двох
структурних станів, виявляють ще два аспекти, пов’язані з конформаційним
перетворенням у тетрасомі. По-перше, флуоресцентне титрування
контрольних і ацетильованих тетрасом на мініциклі 256 п.о. (ДLk = –1,15)
свідчить про полегшення перетворення у тетрасомі зі зміною її
хіральності після дестабілізації кінцевих ділянок гістонів унаслідок
ацетилування. Цей вплив дестабілізації гістонових хвостів на структурну
динаміку тетрасоми підтверджено в експериментах з релаксацією тетрасом у
присутності ДНК-топоізомерази І (див. нижче).

По-друге, виникає питання, чи справді тетрамер гістонів (Н3-Н4)2, який у
складі нуклеосоми має вигляд лівозакрученої підкови, може змінювати свою
хіральність. Адже вищезгадані спостереження стосуються тільки поведінки
ДНК-компоненти тетрасомного комплексу. Модифікація двох SH-груп гістонів
Н3 (два цистеїна різних молекул Н3 знаходяться поблизу від центральної
частини тетрамера, приблизно у зоні осі симетрії другого порядку
частинки) відомим ковалентним реагентом ДТНБ
(5,5′-дітіобіс(2-нитробензойна кислота)) призводить до реверсії вільних
енергій двох структурних форм тетрасоми: права форма стає менш
енергетичною. Цей результат, що він є доказом залучення білкової частини
тетрасоми в її структурне перетворення, було підтверджено у
релаксаційних експериментах з ДТНБ-тетрасомами (Alilat et al., 1999).

Отже, результати флуоресцентного титрування тетрасом однозначно
свідчать, що БЕ, індукуючи позитивну надспіралізацію, викликає у
тетрасомі структурне перетворення зі зміною хіральності суперспіралі
ДНК. При цьому змінюється також хіральність тетрамера гістонів (Н3-Н4)2.
Дестабілізація кінцевих невпорядкованих ділянок гістонів полегшує
структурне перетворення.

Структурна динаміка нуклеосоми у взаємозв’язку з топологією циркулярної
ДНК. Релаксація у присутності ДНК-топоізомерази І. Внаслідок високої
жорсткості ДНК малого розміру серед продуктів релаксації вільних
мініциклів, як правило, є присутнім лише один топоізомер. Коли розмір
мініциклу є кратним спіральній періодичності ДНК плюс пів-періоди
(близько 5 п.о.), два топоізомери можуть бути отримані у рівних
кількостях, завдяки рівній імовірності недокручення або перекручення
подвійної спіралі при її замиканні у кільце. В інших випадках формується
лише один топоізомер, який відповідає найменшій зміні твісту відносно
лінійної ДНК. Аналіз релаксаційних експериментів на вільних мініциклах
дозволяє встановити спіральну періодичність ДНК, яка відповідає найбільш
вигідному твістові в умовах релаксації, та Ksc для вільної ДНК. Ці
значення виявилися незалежними від складу використаних буферів
релаксації. Середнє значення Ksc = 4100(300 для мініциклів обох
використаних серій. Спіральна періодичність розрізняється для двох серій
ДНК (тобто для різних послідовностей пар основ): 10,494(0,003 п.о./виток
для серії Taq та 10,538(0,003 для серії Bam.

Структурна динаміка нуклеосоми. На відміну від вільних мініциклів,
продукти релаксації реконструйованих нуклеосом містять не менше двох
топоізомерів. Отже, мініцикл із нуклеосомою у своєму складі, у
порівнянні з вільною ДНК, поводиться як менш жорстка система.

Рис. 4. Відносні внески f топоізомерів у їх розподілах після релаксації
нуклеосом на мініциклах різного розміру серії Taq у залежності від ДLk
цих топоізомерів. Суцільна крива є результатом підгонки під модель трьох
структурних станів нуклеосоми.

Відносні внески топоізомерів у їх розподілах (для мініциклів усіх
досліджених розмірів) у залежності від ДLk цих топоізомерів представлено
на рис. 4. Слід зауважити, що сума внесків (імовірностей) усіх
топоізомерів у розподілі дорівнює 1 тільки в межах одного розміру
(одного експерименту), тобто загальна залежність на рис. 4 не є
нормалізованою для всіх ?Lk. На кривій виявляються три локальні
максимуми, які наводять на думку про існування принаймні трьох
структурних станів нуклеосоми з різними значеннями характеристичної
різниці числа зачеплень, що вноситься нуклеосомою, ДLkp.

Для опису залежності на рис. 4 було використано модель кількох станів
нуклеосоми. Внесок певного стану на певному топоізомері в загальну
релаксаційну рівновагу визначається вільною енергією G мініциклу, що
містить нуклеосому в певному стані (за аналогією з рівн. 1):

G = (Ksc/Nl)(?Lk – ?Lkp)2 + ?Gp,

де перший доданок – енергія надспіралізації петлі, Nl – розмір петлі у
п.о., ?Lkp – специфічний для кожного стану внесок нуклеосоми у загальне
значення ?Lk топоізомера, ?Gp – відносна конформаційна енергія
нуклеосоми у певному стані (для одного зі станів приймається за 0). Коли
?Lk = ?Lkp, петля є релаксованою, тобто реалізується мінімум енергії
(максимум імовірності). Виявилося, що мінімальне число станів,
використовуючи яке можна задовільно описати експериментальну залежність
на рис. 4, дорівнює трьом. Знайдені значення параметрів моделі та
конфігурації ДНК у трьох формах нуклеосоми наведені у табл. 2.

Таблиця 2

Топологічні та енергетичні параметри нуклеосом у складі мініциклів

Конформаційні стани

Закритий негативний Відкритий Закритий позитивний

Конфігурації мініциклу з нуклеосомою, розраховані в межах теорії
рівноважних конфігурацій для ДLk=ДLkp

Wr0* –1,64 –1,01 –0,31

Taq, контрольні гістони ДLkp ( 0,03 –1,69 –1,04 –0,56

ДGp (kBT) ( 0,1 0 0,8 2,0

Taq, ацетильовані гістони ДLkp ( 0,03 –1,73 –1,02 –0,61

ДGp (kBT) ( 0,1 0 –0,8 2,8

Bam, контрольні гістони ДLkp ( 0,03 –1,40 –0,72 –0,41

ДGp (kBT) ( 0,1 0 1,7 3,9

*райзинг для випадку релаксованої петлі, відповідає зображеним
конфігураціям.

Згідно розрахунків рівноважної конфігурації петлі, “канонічна”
нуклеосома з 1,7 витками лівої суперспіралі дає Wr мініциклу, близький
до ДLkp першого, закритого негативного стану. Відкрита форма нуклеосоми,
~1,4 витка без перехрещення лінкерів, є наслідком руйнування найменш
міцних контактів ДНК з октамером гістонів на вході-виході з нуклеосоми.
Можливість реалізації цієї форми демонструє аналіз міжмолекулярних
взаємодій у нуклеосомі (див. вище), електронна мікроскопія нуклеосом,
реконструйованих на мініциклах із ДLk ~ –1 (Goulet et. al, 1988), та
результати про доступність нуклеосомної ДНК до рестриктаз (Polach and
Widom, 1995). Закрита позитивна форма нуклеосоми (1,7 витка з позитивним
перехрещенням лінкерів) виявлена вперше. Наявність цієї форми
підтверджується результатами щодо високої здатності нуклеосоми
витримувати позитивні еластичні напруження, що індукуються БЕ (див.
вище).

Надспіральний парадокс – досить давня проблема, що досі не була
вирішена, яка полягає в розбіжності між даними про структуру нуклеосоми
(1,7 витка лівої суперспіралі ДНК мають вносити величину приблизно –1,7
у рівень надспіралізації циркулярної ДНК) та топологічними вимірами на
мініхромосомах (циркулярних ДНК з ~20 нуклеосомами), які свідчать, що
середнє питоме значення ? –1 на одну нуклеосому. Факт існування
нуклеосоми у різних структурних станах негайно дає очевидне рішення
парадокса: у хроматині існує рівновага трьох конформаційних станів з
різними значеннями ДLkp, що у середньому дає питоме значення на
нуклеосому, близьке до –1. Звичайно, у хроматині енергетика цієї
рівноваги має дещо відрізнятися від такої, що має місце в мініциклах.

Роль ацетилування гістонів у динаміці нуклеосоми. Конформаційна
рівновага нуклеосом може бути модифікована принаймні двома важливими
способами. Один з них – дестабілізація невпорядкованих кінцевих ділянок
гістонів за рахунок їх ацетилування. На аналогічній до наведеної на рис.
4 залежності, що була отримана для ацетильованих нуклеосом, пік, який
відповідає відкритому станові нуклеосоми, стає домінуючим. Енергетичні
параметри (табл. 2) вказують, що спостерігається зменшення внесків обох
закритих станів нуклеосоми на користь відкритого.

Стає зрозумілою одна з фізіологічних ролей, що її відіграє ацетилування
гістонів, яке завжди корелює з транскрипційною активністю. Значна
частина кінцевих ділянок гістонів сконцентрована в структурі нуклеосоми
у місці входу-виходу нуклеосомної ДНК. Дестабілізація взаємодії цих
ділянок із ДНК унаслідок ацетилування повинна призвести до зростання
електростатичного розштовхування кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК,
тобто до зростання енергетичної вартості закритих конформаційних станів
нуклеосоми. Можна, таким чином, ідентифікувати відкритий конформаційний
стан нуклеосоми як активований – такий, що має певний потенціал щодо
підвищення транскрипційної активності за рахунок зростання доступності
ДНК та, можливо, дестабілізації димерів гістонів Н2А-Н2В.

Структурно-динамічний поліморфізм нуклеосом. Інший фактор, який впливає
на конформаційну рівновагу нуклеосом, – послідовність пар основ ДНК.
Результати аналізу релаксацій нуклеосом, реконструйованих на мініциклах
іншої послідовності (серія Bam), вказує, що внесок позитивного закритого
стану є дуже низьким (табл. 2), тобто має місце динамічний поліморфізм
нуклеосом.

Нуклеосоми, реконструйовані на двох досліджених послідовностях ДНК,
відрізняються також за твістом нуклеосомної ДНК. Значення ДLkp
негативного закритого та відкритого станів для нуклеосом Bam і Taq
відрізняються між собою приблизно на 0,3 (табл. 2). Якщо райзинг
відкритих станів обох нуклеосом дорівнює –1,01, то нуклеосомна ДНК має
дуже різні значення ДTwp (різниця в твісті між нуклеосомною та вільною
ДНК): ДTwp ? 0 для нуклеосоми Taq, тоді як для нуклеосоми Bam ДTwp =
+0,29. Футпринтинг нуклеосомної ДНК за допомогою ДНКази І підтверджує,
що нуклеосомна ДНК Taq є більш розкрученою по відношенню до такої Bam;
ступінь розкручення узгоджується з даними релаксації. Отже, істинна
спіральна періодичність нуклеосомної ДНК Taq приблизно дорівнює
періодичності у розчині (10,49 п.о./виток), а для нуклеосом Bam
становить 10,26 п.о./виток. Відповідні локальні періодичності hloc
(періодичності контактів ДНК із білковою поверхнею), які відрізняються
від істинних завдяки хіральності нуклеосомної суперспіралі, можна
оцінити як 10,37 та 10,14 п.о./виток для нуклеосом Taq і Bam відповідно.

Виявлений динамічний поліморфізм повинен відображати певні відмінності й
у просторовій структурі нуклеосоми. Розрахована в межах теорії
рівноважних конфігурацій залежність еластичної енергії петлі від ДLk для
випадку 1,7 витка регулярної нуклеосомної суперспіралі (рис. 5)
демонструє наявність двох локальних мінімумів (для обох петля не містить
торсійних напружень), які й відповідають двом закритим структурним
станам нуклеосоми (табл. 2). Оскільки застосована теорія не бере до
уваги електростатичних взаємодій, другий мінімум повинен насправді
зсуватися до більш негативних значень ДLk, як це спостерігається в
експерименті.

Рис. 5. Еластична енергія петлі як функція ДLk мініциклу, який містить
1,7 витків регулярної (зображена ліворуч унизу) чи деформованої шляхом
вигину її осі (праворуч унизу) нуклеосомної суперспіралі.

Різниця в енергії між двома мінімумами дорівнює близько 4 одиниць kBT,
що наближається до значення ДGp позитивного стану нуклеосоми Bam (табл.
2). Отже, регулярна нуклеосомна суперспіраль дозволяє задовільно описати
динамічні властивості нуклеосоми Bam, але не нуклеосоми Taq. Для
пояснення значної присутності позитивного стану у випадку нуклеосоми Taq
необхідно знайти спосіб так змінити граничні умови на кінцях петлі, щоб
вони сприяли більш легкому формуванню позитивного перехрещення лінкерних
ділянок. Одна з можливостей полягає у вигині осі нуклеосомної
суперспіралі, як це зображено у нижній частині рис. 5. Залежність
вільної енергії мініциклу, що містить таку структуру (рис. 5), показує
значне зниження різниці між двома мінімумами – приблизно до
експериментальних значень для нуклеосоми Taq. Припущення щодо
викривлення осі суперспіралі у нуклеосомі Taq не є цілком гіпотетичним.
Аналогічна деформація нуклеосомної суперспіралі спостерігалася в
кристалах нативних нуклеосом із низьким розділенням (Richmond et al.,
1984), як можливість такої деформації можна інтерпретувати результати
дослідження резонансного переносу енергії (Tomschik et al, 2005).
Імовірно, вигин осі нуклеосомної суперспіралі є неможливим для деяких
послідовностей ДНК, унаслідок чого нуклеосоми на таких послідовностях є
більш конформаційно жорсткими.

Структурна динаміка тетрасоми. Тетрамер гістонів (Н3-Н4)2 займає у
нуклеосомі центральну позицію, є найбільш міцно зв’язаним з ДНК і, після
звільнення димерів гістонів (Н2А-Н2В) у процесі активації хроматину,
його комплекс з ДНК – тетрасома – тимчасово замінює нуклеосому у
хроматині. Результати релаксаційних експериментів підтверджують дані
флуоресцентного методу (див. вище) щодо вражаючої конформаційної
рухливості тетрасоми.

Рис. 6. Відносні внески f топоізомерів у їх розподілах після релаксації
тетрасом на мініциклах різного розміру серії Taq у залежності від ДLk
цих топоізомерів. Суцільна крива є результатом підгонки під модель двох
структурних станів. Конфігурації мініциклу з тетрасомою в двох станах
розраховані в межах теорії рівноважних конфігурацій для двох ДLk=ДLkp.

Залежність від ДLk відносних внесків топоізомерів у їх розподілах є
бімодальною (рис. 6), що негайно вказує на існування двох конформацій
тетрасоми з негативним та позитивним значеннями ДLkp, тобто з різною
хіральністю. Перша з конформацій є лівою і більш вигідною енергетично,
що природно, бо тетрамер має вигляд закрученої ліворуч підкови у складі
нуклеосоми. Друга є закрученою праворуч конформацією. Аналіз даних на
підставі моделі двох станів та теорії рівноважних конфігурацій дозволяє
отримати топологічні, енергетичні та структурні параметри двох станів
(табл. 3). Зокрема, експериментальні значення Ksc є, згідно до
розрахунків, дуже чутливими до радіуса r тетрасомної суперспіралі. У
правому стані радіус виявився значно більшим (табл. 3).

Таблиця 3

Топологічні, енергетичні та структурні параметри тетрасом у складі

мініциклів

ДНК та тип гістонів Конформа-ційний

стан ДLkp

(0,03 Ksc/Nl

(1 ДGp

(kBT)

(0,1 Wr0

(0,05 r (нм)

(0,1 hloc

(п.о./

виток)

(0,1

Taq,

нативні лівий –0,74 8 0 –0,82 4,3 10,2

правий 0,51 4 1,9 0,31 5,1

Bam,

нативні лівий –0,68 12 0 –0,86 3,8 10,0

правий 0,60 4 2,9 0,30 5,1

Taq, трипси-низовані лівий –0,64 5 0 –0,74 4,7 10,2

правий 0,35 4 0,6 0,17 5,3

Знайдена для нуклеосом різниця між серіями ДНК у випадку тетрасом
суттєво знижується. Але певний поліморфізм зберігається: тетрасома Bam
характеризується дещо меншим радіусом суперспіралі у лівому стані та
більш високою енергією конформаційного перетворення ДGp (табл. 3).
Тобто, тетрасома Bam, як і відповідна нуклеосома, є більш конформаційно
жорсткою у порівнянні з Taq. Крім того, зберігається різниця у локальній
спіральній періодичності hloc, що вона спостерігалася для відповідних
нуклеосом.

Загальними характеристиками тетрасом на обох досліджених серіях ДНК
(табл. 3) є: 1) наявність структурного перетворення зі зміною
хіральності, коли під впливом позитивної надспіралізації тетрасома
перетворюється на більш енергетичну закручену праворуч форму; 2) вказана
зміна хіральності супроводжується латеральним розкриттям тетрасоми
(збільшенням радіусу тетрасомної суперспіралі); 3) тетрасомна ДНК, у
порівнянні з нуклеосомною, характеризується більшим значенням твісту
(зменшенням спіральної періодичності). Латеральне розкриття тетрасоми у
її позитивному стані було підтверджено електронно-мікроскопічними
спостереженнями (Alilat et al., 1999).

Виявляється, що гістонові хвости відіграють значну роль також у процесі
структурного перетворення тетрасоми. Тетрасоми були реконструйовані з
використанням трипсинизованих гістонів (обох або одного з двох). Аналіз
релаксації свідчить, що усунення хвостів трипсином призводить до
суттєвого полегшення структурного перетворення, а також до додаткового
латерального розкриття (збільшення радіусу суперспіралі) у обох
структурних формах (табл. 3). Головним чином за цей ефект відповідає
хвіст гістона Н3. Релаксаційні експерименти з використанням
ацетильованих тетрамерів демонструють менш значні зміни, але в тому ж
напрямку. Таким чином, тетрасома може бути латерально розкритою у двох
випадках: у ході перетворення у праву форму та після усунення кінцевих
ділянок гістона Н3. Така кореляція наводить на думку, що кінцеві ділянки
є дестабілізованими у складі правої форми тетрасоми, або, іншими
словами, їхня дестабілізація є необхідною для структурного перетворення
у праву форму з латеральним розкриттям тетрасоми. На підставі
кристалічної структури нуклеосоми можна припустити “інтеркаляцію”
хвостів у малий жолобок в структурі лівої тетрасоми. Малий жолобок при
цьому збільшується на зовнішньому боці суперспіралі, що повинно
блокувати ДНК у вигнутому стані.

Структурна динаміка та позиціювання тетрасоми. Модифікація тетрамера
гістонів (Н3-Н4)2 ковалентним реагентом SH-груп ДТНБ призводить до
реверсії енергетичної вартості двох структурних форм тетрасоми: права
форма стає переважною (див. вище). Таке “блокування” тетрасоми у правій
формі відкриває можливість дослідити структуру цієї форми у складі
лінійної ДНК (199 п.о., серія Bam) методом футпринтинга ДНК за допомогою
вільних ОН• радикалів.

Футпринтинг не виявляє жодної різниці у доступності певних нуклеотидів
для радикалів між контрольними та ДТНБ-нуклеосомами. Унікальна позиція
нуклеосоми досить точно передбачається теорією позиціювання (див. вище).
Фур’є-трансформація частоти розщеплення обох нуклеосом дає оцінку
періодичністі контактів hloc = 10,3(0,1. Періодичність контактів є
однаковою для нативних та ДТНБ-тетрасом (hloc = 10,1(0,1). Це
підтверджує припущення, зроблене у ході аналізу релаксаційних
експериментів тетрасом, про незалежність hloc від конформаційних
перетворень, а також висновок про збільшення твісту тетрасомної ДНК у
порівнянні з нуклеосомною. Але нативний тетрамер займає на дослідженому
фрагменті кілька позицій, що перекриваються (що теж узгоджується з
теорією позиціювання), тоді як тетрамер-ДТНБ займає дві окремі позиції
на протилежних кінцях фрагменту. Отже, одна з функцій, що її виконує in
vivo виявлене структурне перетворення у тетрасомі зі зміною хіральності,
може полягати у зміні переважних позицій, які займає тетрасома відносно
послідовності ДНК.

Структурна динаміка нуклеосоми у присутності лінкерного гістону Н5.
Лінкерні гістони (Н1 або його аналог з еритроцитів птахів Н5)
зв’язуються з нуклеосомою в місці входу-виходу нуклеосомної ДНК.
Специфічність зв’язування зумовлена глобулярним доменом (GH5). Але
завдяки невпорядкованій С-кінцевій ділянці довжиною ~100 амінокислотних
залишків, серед яких багато позитивно заряджених, лінкерні ділянки ДНК
формують стеблоподібну структуру (Hamiche et al., 1996), яка зумовлює
певний напрямок специфічної укладки ДНК у складі 30 нм фібрили.

Рис. 7. Відносні внески f топоізомерів у їх розподілах після релаксації
нуклеосом, що містять гістон Н5, на мініциклах різного розміру серії Taq
у залежності від ДLk цих топоізомерів. Суцільна крива є результатом
підгонки під модель двох структурних станів. Конфігурації мініциклу
розраховані в межах теорії рівноважних конфігурацій для вказаних значень
ДLk згідно моделі для стеблоподібної структури на виході з нуклеосоми.

У релаксаційних експериментах із комплексами нуклеосома-Н5 (рис. 7,
табл. 4) спостерігаються наступні відміни у порівнянні з нуклеосомою: 1)
у присутності Н5 відкритий стан нуклеосоми зникає, що й очікувалось,
оскільки Н5 взаємодіє з нуклеосомною ДНК на вході-виході; 2) залишаються
два закриті конформаційні стани, що їх було зафіксовано для нуклеосоми,
і це, у свою чергу, підтверджує їх передіснування в нуклеосомі; 3)
зростає присутність позитивного стану (також і для нуклеосоми Bam); 4)
практично зникає динамічний поліморфізм для двох досліджених
послідовностей ДНК – крива для серії Bam виглядає так само, як крива Taq
на рис.7, за винятком зсуву по осі абсцис, який відображає різницю у
твісті нуклеосомної ДНК; 5) збільшується відстань по осі абсцис між
двома конформаційними станами: негативний стає більш негативним,
позитивний – більш позитивним.

Таблиця 4

Топологічні та енергетичні параметри комплексів нуклеосома-Н5 у складі

мініциклів

ДНК та тип лінкерного гістона Конформаційний стан ДLkp

(0,03 Ksc/Nl

ДGp

(kBT)

(0,1

Taq, Н5 негативний –1,89 3 ( 1 0

позитивний –0,34 6 ( 1 1,2

Bam, Н5 негативний –1,76 4 ( 1 0

позитивний –0,16 6 ( 1 1,6

Taq, GН5 негативний –1,57 6 ( 3 0

позитивний –0,56 7 ( 4 1,0

Bam, GН5 негативний –1,26 6 ( 4 0

позитивний –0,29 12 ( 5 1,9

Ще однією характерною відзнакою Н5-нуклеосом є дивовижно низька, навіть
на тлі загально високої конформаційної рухливості інших досліджених
комплексів, силова константа надспіралізації (табл. 4). Якщо розмір
вільної петлі дорівнює приблизно 190 п.о., то величина Ksc/Nl
відповідає, в середньому, Ksc ~ 800, що практично співпадає зі
значенням, отриманим методом флуоресценції БЕ для ДНК нативних клітинних
ядер.

Як показують розрахунки на підставі теорії рівноважних конфігурацій
еластичного стержня, для досягнення такої низької константи Ksc/Nl
необхідно, щоб два кінця петлі ДНК були у контакті, при цьому тангенти
до осі ДНК у цих точках були паралельними, та розмір петлі Nl не
перевищував 180 п.о. Тобто, отримане значення Ksc/Nl може розглядатися
як доказ існування на кінцях петлі стеблоподібної структури, у якій дві
ділянки ДНК є паралельними одна до одної. З іншого боку, зміщення ДLkp
приблизно на 0,2 у негативний (для негативного стану) чи у позитивний
(для позитивного стану) бік у порівнянні з нуклеосомою (табл. 2, 4),
вказує на відповідне закручення двох ділянок ДНК у складі стебла. Тобто
паралелізм у стеблі досягається поступово: дві лінкерні ділянки,
виходячи з нуклеосоми, формують перехрещення (негативне чи позитивне)
під певним кутом та утворюють стебло у вигляді подвійної спіралі; далі
крок такої спіралі поступово збільшується так, що дві ділянки стають
паралельними на виході зі стебла. Відповідно до таких властивостей
стебла була побудована модель мініциклу, що містить нуклеосому та гістон
Н5. Галерея конфігурацій мініциклу (рис. 7) ілюструє легкість обертання
петлі навкруг стебла. Дещо подібне повинно відбуватися й у хроматині, де
нуклеосома може легко обертатися навкруг стебла у відповідь на зміну
топологічного стану ДНК.

Як показують релаксаційні експерименти з комплексами нуклеосома-GH5
(табл. 4), присутність GH5 є достатньою для зникання відкритого стану
нуклеосоми, що підтверджує взаємодію глобулярного домену з нуклеосомою у
місці входу-виходу ДНК. GH5 полегшує формування позитивної форми
нуклеосоми, але є недостатнім для повного зникнення динамічного
поліморфізму нуклеосом. GH5 є також недостатнім для збільшення ступеня
перехрещення лінкерних ділянок ДНК, що він спостерігається у випадку Н5,
– для формування стебла є необхідним С-кінцевий невпорядкований домен.

Динамічна модель організації хроматину. Результати дисертаційної роботи
дозволяють сформулювати загальну модель динаміки нуклеопротеїнових
комплексів у складі хроматину (рис. 8). Висока загальна конформаційна
рухливість хроматину в складі клітинних ядер знаходить своє пояснення у
високій конформаційній рухливості нуклеогістонових комплексів різного
складу. Зокрема, надзвичайно висока конформаційна рухливість
наднуклеосомної частинки, яка містить гістон Н1/Н5 (верхня частина рис.
8), дозволяє нуклеосомі у складі хроматину легко обертатися навкруг
стеблоподібної структури. Висока обертальна рухливість стебла має
полегшувати компактизацію хроматину завдяки зміні, в разі потреби,
обертальної орієнтації нуклеосоми з метою забезпечення ефек-тивних
міжнуклеосомних взаємодій. Крім того, рухливість стебла дає змогу
хроматину “витримувати” еластичні напруження, що виникають у складі
хроматинової петлі. Одним з головних джерел таких напружень є процес
елонгації транскрипції (нижня частина рис. 8): проходження
РНК-полімерази викликає, як відомо, дві хвилі надспіралізації –
позитивну попереду і негативну позаду полімеразного комплексу. Стебло
виступає своєрідним буфером, здатним гасити такі хвилі на віддалених від
зони елонгації ділянках хроматину.

Роль такого ж буферу виконують негативний та позитивний стани нуклеосоми
після усунення лінкерних гістонів із потенційно активних ділянок
хроматину (середня частина рис. 8). Проте, в цьому випадку в активних
ділянках хроматину на певних послідовностях ДНК, а також завдяки
ацетилуванню гістонів і/або репозиціюванню нуклеосом, конформаційна
рухливість нуклеосоми зменшується, і превалює відкрита форма нуклеосоми.
Часткове розгортання нуклеосомної ДНК у відкритій формі повинно
забезпечувати більшу доступність регуляторних послідовностей до
транскрипційних факторів та дестабілізувати димери гістонів Н2А-Н2В.

Унаслідок цього димери можуть (завдяки дії проміжних переносників)
видалятися з хроматину, де залишається тетрасома (нижня частина рис. 8).
Структурне перетворення тетрасоми зі зміною її хіральності знову ж таки
дозволяє швидко гасити хвилі надспіралізації. Те ж саме послаблення
взаємодії кінцевих ділянок гістонів з ДНК, яке викликало збільшення
жорсткості нуклеосоми, у даному випадку полегшує структурне
перетворення. Загальна рухливість тетрасоми (здатність її до
латерального розкриття, трансляційна рухливість вздовж ДНК) значно
полегшує процес елонгації транскрипції. Негативна надспіралізація позаду
РНК-полімерази зумовлює швидке відновлення структури нуклеосоми.

ВИСНОВКИ

Головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів
хроматину є, поряд із компактизацією, значне підвищення конформаційної
рухливості ДНК. Ця рухливість, що вона зумовлена змінами балансу
різноманітних міжмолекулярних взаємодій та залежить від послідовності
пар основ ДНК і посттрансляційних модифікацій гістонів, дає можливість
вибірково активувати певні ділянки геному при збереженні загальної
щільної упаковки ДНК у клітинному ядрі.

Запропонована теорія електростатичних взаємодій позитивно заряджених
лігандів з ДНК, яка базується на використанні рівняння
Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра та дозволяє оцінювати
значення електростатичного внеску у вигин ДНК, загальну електростатичну
енергію полііону, константи зв’язування позитивно заряджених білків з
ДНК.

Теоретичний аналіз, проведений на підставі теорії електростатичних
взаємодій, вказує, що конформаційна динаміка нуклеосоми зумовлена
можливістю руйнування електростатичних контактів кінцевих ділянок ДНК із
гістонами та (або) контактів димера гістонів Н2А-Н2В з тетрамером
(Н3-Н4)2.

В рамках теоретичної моделі ДНК як ізотропного еластичного стержня
показано, що залежні від послідовності пар основ еластичні властивості
ДНК є головним фактором позиціювання нуклеосом відносно послідовності.
Розроблений теретичний алгоритм, що враховує пружні властивості
динуклеотидних контактів у складі ДНК, у багатьох випадках дозволяє
передбачити переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 пар основ.

Флуоресцентне титрування бромистим етидієм свідчить, що, незважаючи на
щільну компактизацію, ДНК зберігає високу загальну конформаційну
рухливість у складі нативних клітинних ядер. Результати флуоресцентних
експериментів вказують також на високу конформаційну рухливість
нуклеогістонових комплексів, реконструйованих на циркулярній ДНК малого
розміру (мініциклах).

Аналіз релаксації мініциклів ДНК, які містять реконструйовану
нуклеосому, ДНК-топоізомеразою І вказує, що нуклеосома здатна існувати у
трьох структурних формах за фізіологічних умов, в залежності від
топологічного стану ДНК: двох закритих, у яких нуклеосомна суперспіраль
містить 1,7 витка, та у місці входу-виходу ДНК із нуклеосоми формується
негативне або позитивне перехрещення, та відкритого – з 1,4 витка
суперспіралі.

Рівновага між структурними формами нуклеосоми залежить від послідовності
пар основ ДНК, на якій ця нуклеосома сформована. Існування закритого
позитивного стану нуклеосоми зумовлено залежною від послідовності пар
основ деформацією нуклеосомної суперспіралі зі зближенням та зміною
орієнтації лінкерних ділянок ДНК.

У тетрасомі – комплексі ДНК із тетрамером гістонів (Н3-Н4)2 – під
впливом позитивної надспіралізації здійснюється структурне перетворення
зі зміною хіральності суперспіралі та її латеральним розкриттям.

Дестабілізація кінцевих невпорядкованих ділянок гістонів унаслідок їх
ацетилування призводить до зменшення конформаційної рухливості
нуклеосоми та до збільшення рухливості тетрасоми: доступ до закритих
форм нуклеосоми зменшується, структурне перетворення у тетрасомі значно
полегшується після послаблення взаємодії кінцевих ділянок із ДНК.

У нуклеосомі, яка містить лінкерний гістон Н5, лінкерні ділянки ДНК
формують стеблоподібну структуру. Стебло є правою чи лівою подвійною
спіраллю, крок якої поступово змінюється так, що дві ділянки ДНК
виходять із неї майже паралельними, що забезпечує високу обертальну
рухливість стебла.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Теоретическое исследование
структурного перехода в нуклеосоме при низкой ионной силе // Молек.
биология. – 1987. – Т.21, №3. – С.714-723. (Особистий внесок дисертанта:
розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення
результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

2. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структура октамера гистонов в составе
реконструированных полинуклеосом в присутствии гистона Н1 и
двухвалентных катионов // Биополимеры и клетка. – 1987. – Т.3, №4. –
С.192-201. (Особистий внесок дисертанта: реконструкція нуклеосом, виміри
тирозинової флуоресценції гістонів, обговорення результатів зі
співавтором, підготовка роботи до друку.)

3. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Связывание положительно-заряженных
лигандов с ДНК. Влияние ионной силы, заряда и размера лиганда // Молек.
биология. – 1988. – Т.22,№2. – С.414-422. (Особистий внесок дисертанта:
розробка теорії електростатичних взаємодій білків з ДНК, математичні
розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до
друку.)

4. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Теоретическое рассмотрение механизмов
компактизации ДНК поликатионами // Биофизика. – 1989. – Т.34, №1. –
С.28-33. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі,
математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором,
підготовка роботи до друку.)

5. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Влияние сверхспирализации ДНК на
структуру нуклеосом // Молек.биология. – 1991. – Т.25, №1. – С.144-152.
(Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз можливих варіантів
впливу надспіралізації на структуру нуклеосом, математичні розрахунки,
обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

6. Бондарь Н.В., Безруков В.Ф., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Возможная
роль эндогенных нуклеаз в структурной организации хроматина //
Биологические науки. Научные доклады высшей школы. – 1992. – №2. –
С.58-64. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого
етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі
співавторами, підготовка роботи до друку.)

7. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Флюоресцентная спектроскопия в
исследованиях белково-нуклеиновых взаимодействий в хроматине //
Биополимеры и клетка. – 1992. – Т.8, №1. – С.89-100. (Особистий внесок
дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів флуоресцентної
спектроскопії щодо структури хроматину, розробка флуоресцентних підходів
до вивчення білково-нуклеїнових взаємодій, обговорення результатів зі
співавтором, підготовка роботи до друку.)

8. Sivolob A.V., Khrapunov S.N. Translational positioning of nucleosomes
on DNA: the role of sequence-dependent isotropic DNA bending stiffness
// J. Mol. Biol. – 1995. – Vol.247, N5. – P.918-931. (Особистий внесок
дисертанта: розробка теоретичної моделі та алгоритму, математичні
розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до
друку.)

9. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V., Zagariya A.M. Mechanisms
of stabilizing nucleosome structure. Study of dissociation of histone
octamer from DNA // Biochim. Biophys. Acta. – 1997. – Vol.1351, N1-2. –
P.213-222. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації
нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі
співавторами, підготовка роботи до друку.)

10. Sivolob A., Khrapunov S.N. Electrostatic contribution to the bending
of DNA // Biophys. Chemistry. – 1997. – Vol.67, N1-3. – P.85-96.
(Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні
розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до
друку.)

11. Бондар Н.В, Сиволоб А.В., Демідов С.В. Використання методу
титрування бромистим етидієм для дослідження топологічного стану ДНК у
складі ядер // Вістник Київського університету. Біологія – 1998. – вип.
28. – С.23-24. (Особистий внесок дисертанта: розробка методики
визначення топологічного стану ДНК у складі клітинних ядер, виміри
флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів,
обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

12. Sivolob A., De Lucia F., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics
II. High flexibility of nucleosome entering and exiting DNAs to positive
crossing. An ethidium bromide fluorescence study of mononucleosomes on
DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol.285, N3. – P.1081-1099.
(Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію,
теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами,
підготовка роботи до друку.)

De Lucia F., Alilat M., Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics III.
Histone tail-dependent fluctuation of nucleosomes between open and
closed DNA conformations. Implication for chromatin dynamics and the
linking number paradox. A relaxation study of mononucleosomes on DNA
minicircles // J. Mol. Biol. – 1999. – Vol.285, N3. – P.1101-1119.
(Особистий внесок дисертанта: розробка методики релаксації
нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, теоретичний аналіз
релаксації нуклеосом, обговорення результатів зі співавторами,
підготовка роботи до друку.)

13. Alilat M., Sivolob A., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics IV.
Protein and DNA contributions in the chiral transition of the
tetrasome, the histone (H3-H4)2 tetramer-DNA particle // J. Mol. Biol. –
1999. – Vol.291, N4. – P.815-841. (Особистий внесок дисертанта:
визначення позицій нуклеогістонових комплексів методом футпринтинга ДНК,
обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

14. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics V. Ethidium bromide
versus histone tails in modulating ethidium bromide-driven tetrasome
chiral transition. A fluorescence study of tetrasome on DNA minicircles
// J. Mol. Biol. – 2000. – Vol.295, N1. – P.41-53. (Особистий внесок
дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз
результатів, розробка моделі кількох структурних станів тетрасоми у
присутності барвника, обговорення результатів зі співавтором, підготовка
роботи до друку.)

Sivolob A., De Lucia F., Alilat M., Prunell A. Nucleosome dynamics VI.
Histone tail regulation of tetrasome chiral transition. A relaxation
study of tetrasomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. – 2000. –
Vol.295, N1. – P.55-70. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з
релаксації тетрасом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів,
математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами,
підготовка роботи до друку.)

15. Сиволоб А.В. Структурная динамика нуклеосомы и суперспиральный
парадокс // Молек. биология. – 2002. – Т.36, №3. – С.391-396.

16. Сиволоб А.В. Висока конформаційна рухливість ДНК в ядрах клітин //
Вісник Київського університету. Біологія. – 2002. – вип. 36. – С. 17-19.

17. Сиволоб А.В. Енергетика та конформаційна рухливість циркулярної ДНК
малого розміру // Вісник Київського університету. Біологія. – 2002. –
вип. 38. С. 21-22.

18. Sivolob A., Lavelle C., Prunell A. Sequence-dependent nucleosome
structural and dynamic polymorphism. Potential involvement of histone
H2B N-terminal tail proximal domain // J. Mol. Biol. – 2003. – Vol.326,
N1. – P.49-63. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації
нуклеосом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка
теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі
співавторами, підготовка роботи до друку.)

19. Sivolob A., Prunell A. Linker histone-dependent organization and
dynamics of nucleosome entry/exit DNAs // J. Mol. Biol. – 2003. –
Vol.331, N5. – P.1025–1040. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з
релаксації топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка
теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі
співавтором, підготовка роботи до друку.)

20. Prunell A., Sivolob A. Paradox lost: nucleosome structure and
dynamics by the DNA minicircle approach // Chromatin structure and
dynamics: state-of-the-art. New Comprehensive Biochemistry. Vol. 39
(Eds. J.Zlatanova, S.H.Leuba). – Amsterdam: Elsevier, 2004. – P. 45-74.
(Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних
результатів релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І,
вирішення надспірального парадокса, обговорення результатів зі
співавтором, підготовка роботи до друку.)

21. Dragan A.I, Potekhin S.A., Sivolob A., Lu M., Privalov P.L. Kinetics
and thermodynamics of the unfolding and refolding of the three-stranded
б-helical coiled coil, Lpp-56 // Biochemistry. – 2004. – Vol.43, N47. –
P.14891-14900. (Особистий внесок дисертанта: розробка методів підгонки
теоретичних моделей під експериментальні дані, математичні розрахунки,
обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

22. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome conformational flexibility and
implications for chromatin dynamics // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. A. –
2004. – Vol.362, N1820. – P.1519-1547. (Особистий внесок дисертанта:
теоретичне узагальнення власних результатів релаксації нуклеогістонових
комплексів топоізомеразою І, розробка моделі структурної динаміки
хроматину, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до
друку.)

23. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структурные перестройки
нуклеосом в растворах с высокой ионной силой // Тезисы докладов IX
Всесоюзного симп. “Структура и функции клеточного ядра”. – Черноголовка.
– 1987. – С.52. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної
моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами,
підготовка роботи до друку.)

24. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Механизмы стабилизации
нуклеосомы при низкой ионной силе // Тезисы докладов IX Всесоюзного
симп. “Структура и функции клеточного ядра”. – Черноголовка. – 1987. –
С.86. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі,
математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами,
підготовка роботи до друку.)

25. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Механизмы диссоциации
нуклеосомы при высокой ионной силе по данным флуоресцентной
спектроскопии // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии
биополимеров. – Харьков. – 1988. – С.116-117. (Особистий внесок
дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації нуклеосом, математичні
розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи
до друку.)

26. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Структурный переход в
нуклеосоме при низкой ионной силе. Флуоресцентная спектроскопия и
теоретический анализ // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии
биополимеров. – Харьков. – 1988. – С.269-270. (Особистий внесок
дисертанта: виміри тирозинової флуресценції нуклеогістонових комплексів,
розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення
результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

27. Сиволоб А.В., Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Храпунов С.Н. Торсионные
напряжения в ДНК клеточных ядер. Флуоресцентные исследования // Тезисы
докладов VII конференции по спектроскопии биополимеров. – Харьков. –
1991. – С.219. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції
бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення
результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

28. Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Зависимость
активности Ca-Mg эндонуклеазы от структурного состояния хроматина //
Тезисы докладов IX конференции межотраслевого проекта “Нуклеазы”. –
Казань. – 1991. – С.18-20. (Особистий внесок дисертанта: виміри
флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів,
обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

29. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V. The topological
complementarity of the charge groups controlling the interaction of DNA
with core histones in nucleosome // Progr. Biophys. and Mol. Biol.
(International Biophysical Congress, Amsterdam). – 1996. – Vol.65, N1 –
Р.82. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних
результатів щодо конформаційної рухливості нуклеосоми в залежності від
іонної сили, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи
до друку.)

30. De Lucia F., Sivolob A., Alilat M., Cohen-Solal J., Prunell A.
Histone-tail dependent flexibility of nucleosome entering and exiting
DNAs to positive crossing // EMBL Transcription meeting. – Heidelberg. –
1998. – P.256-257. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції
бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення
результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

АНОТАЦІЯ

Сиволоб А.В. Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину. –
Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Представлено експериментальні та теоретичні результати досліджень
механізмів нуклеопротеїнових взаємодій у складі хроматину та
конформаційної динаміки нуклеосом і хроматину в залежності від
топологічного стану циркулярної ДНК. Розроблено теорію взаємодії
позитивно заряджених лігандів з ДНК. Показана важлива роль асиметричної
нейтралізація зарядів ДНК у стабілізації нуклеосоми. Розвинуто теорію
позиціювання нуклеосом відносно послідовності пар основ ДНК, яка
дозволяє передбачати переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 пар
основ. Для нуклеосоми та інших нуклеогістонових комплексів
охарактеризовані певні конформаційні стани, які реалізуються у
фізіологічних умовах та залежать від рівня надспіралізації циркулярної
ДНК. Згідно отриманих результатів, головним загальним наслідком
утворення нуклеопротеїнових комплексів хроматину є, поряд із
компактизацією, значне підвищення конформаційної рухливості ДНК. Ця
рухливість, що вона зумовлена змінами балансу різноманітних
міжмолекулярних взаємодій та залежить від послідовності пар основ ДНК і
посттрансляційних модифікацій гістонів, дає можливість вибірково
активувати певні ділянки геному при збереженні загальної щільної
упаковки ДНК у клітинному ядрі.

Ключові слова: хроматин, нуклеосома, електростатичні взаємодії,
позиціювання нуклеосом, надспіралізація циркулярної ДНК, конформаційна
рухливість.

АННОТАЦИЯ

Сиволоб А.В. Молекулярные механизмы структурной динамики хроматина. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.02 – биофизика. – Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Представлены экспериментальные и теоретические результаты исследований
механизмов белково-нуклеиновых взаимодействий в составе хроматина и
конформационной динамики нуклеосом и хроматина в зависимости от
топологического состояния ДНК. Разработана теория взаимодействия
положительно заряженных лигандов с ДНК. Показана важная роль
асимметричной нейтрализации зарядов ДНК в стабилизации нуклеосомы.
Развита теория позиционирования нуклеосом относительно
последовательности пар оснований, которая позволяет предсказывать
преимущественные нуклеосомные позиции с точностью до 10 пар оснований.
Для нуклеосомы и других нуклеогистоновых комплексов охарактеризованы
определенные структурные состояния, которые реализуются в
физиологических условиях и зависят от уровня сверхспирализации кольцевой
ДНК. В соответствие с полученными результатами, главным общим следствием
образования нуклеогистоновых комплексов хроматина является, наряду с
компактизацией, значительное возрастание конформационной подвижности
ДНК. Эта подвижность, обусловленная изменениями баланса разнообразных
межмолекулярных взаимодействий и зависящая от последовательности пар
оснований ДНК и посттрансляционных модификаций гистонов, позволяет
избирательно активировать определенные участки генома при сохранении
общей плотной упаковки ДНК в клеточном ядре.

Ключевые слова: хроматин, нуклеосома, электростатические взаимодействия,
позиционирование нуклеосом, сверхспирализация кольцевой ДНК,
конформационная подвижность.

SUMMARY

Sivolob A.V. Molecular mechanisms of chromatin structural dynamics. –
Manuscript.

A dissertation submitted to acquire the degree of Doctor of Science in
Biology, speciality 03.00.02 – Biophysics. – Taras Shevchenko National
University of Kiev, Kiev, 2005.

Experimental and theoretical results are presented on the mechanisms of
the DNA-protein interactions in chromatin and the nucleosome and
chromatin conformational dynamics that depends on the DNA topological
properties.

A theory of electrostatic interactions of positively charged ligands
with DNA has been developed on the basis of a simplified
Poisson-Boltzmann equation for DNA modelled as the charged polyion
cylinder. The theory can be used to analyze proteins to DNA binding in a
wide range of salt concentrations. The effect of an increase in the
affinity for the ligand of larger size (provided that the charge remains
the same) has been established. A theoretical analysis of changes in the
electrostatics upon DNA bending has been performed in terms of the
Posson-Boltzmann equation. The electrostatic contribution to the DNA
persistence length is found to be independent on ionic strength at salt
concentrations higher than 10 mM, in agreement with known experimental
data. In the case of an asymmetric neutralization of the DNA charges on
a protein surface the electrostatic bending energy was found to give a
significant favorite contribution to the total bending energy of DNA. A
simple theoretical analysis showed that the formation of polycationic
bridges between distant DNA sites is the principal mechanism of DNA
compaction in the presence of unfolded positively charged polypeptides.

These theoretical approaches have been applied to analyze salt-dependent
nucleosome conformational changes. It has been shown that these changes
are caused by a possibility to break the histone-DNA electrostatic
contacts on the edges of the nucleosome DNA and/or the contacts between
the histone H2A-H2B dimer and (H3-H4)2 tetramer. At low salt (~1 mM
NaCl), due to an increase in the electrostatic repulsion between the
adjucent DNA gyres, a DNA unwrapping occurs on the edges, which is
accompanied by the breakage of the dimer-tetramer contacts. About the
same unwrapping, but with the breakage of 1 to 2 histone-DNA
electrostatic contacts, is possible at physiological ionic strength.
During the nucleosome dissociation at high ionic strength an increase of
the curvature radius (lateral opening) happens in the tetrasome – the
complex of DNA with the histone tetramer (H3-H4)2.

A theoretical model has been derived that accounts for the nucleosome
translational positioning in terms of the bending energy that depends on
the nearest-neighbor interactions between base pairs. The model allows
one to predict the preferred nucleosome translational positions with an
accuracy of about one turn of the double helix. A partial nucleosome
unwrapping on the sites of high bending stiffness may occur. The
nucleosome conformational changes result in changes of positions.

DNA flexibility in chromatin and reconstituted histone-DNA complexes
was studied using fluorescence titration by ethidium bromide. The
experimental evidence has been obtained for the phenomenon of onset of
writhing upon accumulation of some positive supercoiling in the naked
circular DNA of low contour length (minicircle). The nucleosome
reconstituted on the minicircle is characterized by high resistance to
the positive supercoiling. The reason appeared to be the ease with which
the naked DNA loop could undergo a positive crossing. The terasome in
the minicircle has been shown to be able to a chiral transition to a
right-handed conformation. Both nucleosome and tetrasome flexibilities
were found to be modulated by histone acetylation. In agreement with
these results, fluorescence has shown that, regardless of the tight
compaction, DNA retains its high flexibility in the cell nuclei.

The results on the DNA flexibility were confirmed and extended using an
original approach based on the DNA-topoisomerase I relaxations of
particles reconstituted on DNA minicircles, combined with their
theoretical simulation. All the types of particles studied were found to
exist in two to three conformational states, which differ by their
topological and mechanical properties. Structural attributes of the DNA
superhelix inside the particle that fit the state parameters are
subsequently derived by simulations of loop DNA most probable
configurations, using the explicit solutions to the equations of the
equilibrium in the theory of the elastic rod model for DNA.

Tetrasomes were found to exist in two conformational states:
left-handed, which resembles to the tetrasome structure in the
nucleosome; and less preferred right-handed, which is also characterized
by a lateral opening of the particle. The conformational transition to
the right-handed state is significantly facilitated upon destabilization
of unfolded histone tails, especially that of H3. Nucleosomes fluctuate
between three conformational states. Two of these states are closed
~1.7-turn DNA conformations with either negatively or positively crossed
entering and exiting DNAs; the third state is an open ~1.4-turn
conformation with uncrossed DNAs, where the DNA is unwrapped on the
edges. The access to these nucleosome conformations appears to be
regulated by the DNA sequence in interaction with the histones, which
influences the local twist of the wrapped DNA as well as the flexibility
of the entering and exiting DNAs. The tails destabilization through
their acetylation makes the open state to be the most favorable. The
conformational equilibrium between the nucleosome states explains the
linking number paradox.

Linker histones H5 were found to suppress nucleosome access to the open
conformation and to increase nucleosome ability to positive crossing in
a sequence-independent manner. This was accompanied by a large increase
in loop flexibility in either conformation, that the simulation
attributed to the stem formed by H5 C-terminal tail through its bridging
of the entering and exiting DNAs.

The main conclusion of the work is that DNA overall flexibility
increases considerably upon chromatin particles formation, which should
indeed be a requirement of genome function.

Key words: chromatin, nucleosome, electrostatic interactions, nucleosome
positioning, circular DNA supercoiling, conformational flexibility.

PAGE 1

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter