НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
ПОБЄЛЄНСЬКИЙ ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ
УДК 615.361.018.441.014.41:57.085
Експериментальне вивчення ефективності застосування кріоконсервованої
культури мікрофрагментів підшлункової залози на моделі алоксанового
діабету у щурів
14.01.35 – кріомедицина
автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Науковий керівник
доктор медичних наук, професор
Хворостов Є.Д
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському національному університеті імені
В.Н.Каразіна Міністерство освіти і науки України, м. Харків.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Хворостов Євген Дмитрович,
Харківський національний
університет імені
В.Н.Каразіна, м.Харків,
завідувач кафедри хірургічних
хвороб.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Міміношвілі Омарі Ісидорович,
Інститут невідкладної відновної
хірургії, м. Донецьк;
завідувач кафедри госпітальної
хірургії,
зам. директора ІНВХ, завідувач
відділу абдомінальної
хірургії і політравми.
доктор медичних наук
Компанієць Антоніна Михайлівна,
Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН
України, м.Харків,
завідувач відділу кріопротекторів.
Провідна установа: Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН
України
м.Харків.
Захист відбудеться “_19 ” _червня 2007 р. о “13-30” годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул.
Переяславська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології
І кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
Автореферат розісланий “_18 ” _травня___2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук, професор
Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За даними ВОЗ цукровий діабет належить до
захворювань, які не піддаються радикальному лікуванню [Ефимов А.С.,
1994, 1996; Дедов И.И., 2000, 2001; Сhen C. et. al., 1996]. Необоротний
розвиток проліферативної ретинопатії, нефропатії, мікроангіопатії нижніх
кінцівок, полінейропатії та інших ускладнень, яки призводять до сліпоти,
термінальної стадії ниркової недостатності, гангрени нижніх кінцівок,
“діабетичної стопи” – ось неповний перелік причин ранньої інвалідизації
і смерті хворих.
Клінічний досвід свідчить, що класична інсулінотерапія в цілому здатна
вирішити проблему гострих ускладнень діабету, таких як кетоацидоз, але
не завжди може зупинити розвиток хронічних ускладнень [Ефимов А.С. и
соавт., 2000; Корпачев В.В., 2001]. У таких випадках доцільне поєднання
консервативних і хірургічних методів лікування [Бойко Н.И., 1991;
Ковалев А.А., 1996; Бекетов О.Д., 1998]. Досягнутий певний прогрес у
застосуванні трансплантації острівців підшлункової залози, для якої
може бути використаний відповідний матеріал – ізольовані (-клітини,
острівці, мікрофрагменти підшлункової залози як людини, так і
новонароджених тварин (свині, кролики і т.п.) [Морозов Ю.И. и соавт.,
1995; Шумаков В.И., 1993, 1998; Ковальская И.А., 1997, 2000; Волков И.А.
и соавт., 1998; Дроздович И.И., Турчин И.С., Ларин А.С., 2003; Ricordi
C., 1988, 2006; Maffi P. еt al., 2006; Pileggi A. еt al., 2006]. У
останні роки знову спостерігається помітне зростання інтересу до
ксенотрансплантації острівців підшлункової залози, що пов’язано з
необхідністю пошуку альтернативних джерел інсулін-продукуючих клітин
(Shumakov V. et al., 2006; Dufrane D. еt al., 2006; Melzi R. et al.,
2006]. Експериментальними і клінічними дослідженнями показано, що
ксенотрансплантація здатна стабілізувати перебіг цукрового діабету,
зупинити у ряді випадків прогрес хронічних діабетичних ускладнень
[Максименко С.Ф. и соавт., 1993; Демин Ю.А., 2000; Shumakov V. et al.,
2006]. Проте накопичений клінічний досвід невеликий і не дозволяє
остаточно деталізувати показання і протипоказання до застосування цієї
операції. У літературі практично відсутні дані про використання для
трансплантації кріоконсервованого матеріалу, не проведений порівняльний
аналіз ефективності застосування нативного та кріоконсервованого
матеріалу підшлункової залози, зокрема залежно від різних способів і
локалізації введення. Вивчення цих питань в даний час є актуальним,
таким, що має важливе теоретичне і практичне значення.
Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота
виконана відповідно до плану науково-дослідної роботи кафедри
хірургічних хвороб факультету фундаментальної медицини Харківського
національного університету імені В.Н. Каразіна “Нові технології в
лікуванні цукрового діабету”, № державної реєстрації 0103U004282,
2002-2005 рр.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було експериментальне
дослідження ефективності застосування і особливостей впливу
кріоконсервованої культури мікрофрагментів підшлункової залози (ККМФПЗ)
новонароджених поросят на глюкозний гомеостаз, ліпідний обмін і імунний
статус щурів з алоксановим діабетом залежно від локалізації введення
біоматеріалу.
Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
Вивчити вплив кріоконсервування на здатність ККМФПЗ синтезувати
ендогенний інсулін в умовах in vitro і in vivo.
Вивчити ефективність застосування ККМФПЗ у щурів з експериментальним
алоксановим діабетом залежно від локалізації введення біоматеріалу.
Вивчити вплив ККМФПЗ на глюкозний гомеостаз і ліпідний обмін у щурів з
алоксановим діабетом.
Оцінити стан імунного статусу щурів з розвитком алоксанового діабету на
фоні введення ККМФПЗ.
На підставі проведених експериментальних досліджень теоретично
обґрунтувати можливість використання ККМФПЗ в клініці.
Об’єкт дослідження. Параметри глюкозного і ліпідного гомеостазу,
ліпідної пероксидації, імунного статусу у щурів з алоксановим діабетом і
після введення ККМФПЗ.
Предмет дослідження. Кріоконсервована культура мікрофрагментів
підшлункової залози новонароджених поросят.
Методи дослідження: хірургічні, кріобіологічні, біохімічні,
імунологічні, патоморфологічні і статистичні. При виборі
експериментальної моделі діабету враховувалися сучасні уявлення про
клінічний розвиток патології і можливість екстраполяції отриманих
результатів на людину. Для оцінки стану глюкозного гомеостазу
використані як функціональні і біохімічні показники, так і математичний
аналіз складових (функція панкреатичних (-клітин в умовах базальної
глікемії). Оксидативний статус оцінювали за основними показниками, що
характеризують інтенсивність ліпоперо-ксидації.
З метою вивчення проявів алоксанового діабету в острівковій тканині ПЗ і
дії на неї біоматеріалу, що вводиться, було проводено гістологічну
оцінку морфологічних змін в цих структурах.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження вуглеводного і ліпідного обміну, імунного статусу щурів з
експериментальним цукровим (алоксановим) діабетом на фоні застосування
ККМФПЗ, новонароджених поросят. Встановлена їх здатність чинити
виражений антиглікемічнй ефект, нормалізувати глюкозний гомеостаз і
метаболізм ліпідів у щурів з алоксановим діабетом. Показана залежність
ефективності застосування ККМФПЗ від локалізації введення: в печінку, в
селезінку, під капсулу нирки, в парапанкреатичну клітковину і
внутрішньом’язово. Показано, що введення ККМФПЗ є ефективним методом
корекції імунного статусу у щурів з розвитком алоксанового діабету.
Вперше проведено морфологічне дослідження підшлункової залози щурів з
розвитком алоксанового діабету і після введення ККМФПЗ, встановлена
стимулююча дія біоматеріалу на репарацію островкових клітин тварин.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень,
спрямовані на вивчення ефективності застосування кріоконсервованого
біологічного об’єкту – ККМФПЗ новонароджених поросят, як альтернативного
джерела інсулінпродукуючих клітин, відкриває нові перспективи в
лікуванні цукрового діабету.
На підставі порівняльного аналізу ефективності застосування ККМФПЗ при
введенні в різні органи і тканини щурам з алоксановим діабетом вибрана
локалізація – у парапанкреатичну клітковину, використання якої сприяє
найбільш вираженій корекції патологічних порушень.
Експериментально обґрунтована доцільність застосування ККМФПЗ
новонароджених поросят з метою досягнення тривалого клінічного ефекту –
зниження глікемії, нормалізації ліпідного обміну і імунного статусу в
комплексному лікуванні цукрового діабету в клінічній практиці.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно
проведено аналіз даних літератури, отримані результати експериментальних
досліджень, здійснений їх первинний аналіз і статистична обробка.
Спільно з науковим керівником проведено планування експериментальної
роботи, інтерпретовані отримані результати і сформульовані остаточні
висновки. В опублікованих спільно з співавторами роботах особистий
внесок здобувача полягає:
у роботі [1] – у проведенні хірургічних досліджень по корекції
цукрового діабету;
у роботі [2] – у обґрунтуванні і проведенні моделювання аллоксанового
діабету;
у роботі [3] – у проведенні клінічних досліджень на експериментальній
моделі аллоксанового діабету у щурів;
у роботі [4] – у проведенні експериментальних досліджень біохімічних
показників і рівня глікемії у щурів з АД і після застосування ККМФПЗ;
у роботі [5] – у плануванні експериментів та вивченні морфології
під-шлункової залози щурів з АД і після застосування ККМФПЗ;
у роботі [6] – у проведенні моделювання АД у щурів, хірургічного
введення ККМФПЗ та проведенні статистичної обробки отриманих
результатів.
у патенті [7] – запропонував і проводив трансплантацію острівцевих
клітин підшлункової залози методом лапароскопії.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
були доповідались і обговорювались на конференціях “Гастроентерологічний
тиждень”, м. Москва, 1997, 1998 р.; “Актуальні питання госпітальної
хірургії” м. Ужгород, 1999 р.; “Хірургічна корекція цукрового діабету”,
м. Київ, 2003 р.
Публікації матеріалів дисертації. За матеріалами дисертаційної роботи у
наукових фахових виданнях опубліковано 6 статей та отримано 1 патент на
винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 162 сторінках
друкованого тексту, з яких 130 сторінок основного змісту. Дисертаційна
робота складається із введення, огляду літератури, опису матеріалів і
методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і
узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаних
літературних джерел, який налічує 330 найменувань, розміщених на 32
сторінках. Робота містить 19 таблиць, 11 рисунків і 12 мікрофотографій.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження
У роботі були використані статевозріли щури-самці лінії Вістар масою
180-210 г, що утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України при нормальному
освітленні і годуванні ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до
національних “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”,
які узгоджуються з положеннями “Європейської конвенції про захист
хребетних тварин, що використовуються для експериментальних і інших
наукових цілей” (Страсбург, 1985).
Дослідження було проведено на експериментальній моделі цукрового діабету
I типу – аллоксанового діабету. Для його моделювання алоксан –
моногідрат (ICN Biomedical Inc.) вводили одноразово під шкіру щурам в
дозі 130 мг/кг маси тварини після попереднього 24-годинного голодування
при вільному доступі їх до води.
175 щурів були розподілені на 7 груп: 1 контрольна – 7 інтактних щурів;
2 – з розвитком патології алоксанового діабету (АД), які не отримували
біоматеріал – 28 щурів; 5-ти іншим групам щурів після появи розгорненої
картини АД на 14-у добу було введено ККМФПЗ: в печінку – 28 щурів, в
селезінку – 28 щурів, під капсулу нирки – 28 щурів, в парапанкреатичну
клітковину – 28 щурів і внутрішньом’язово – 28 щурів. З експерименту
тварин виводили шляхом декапітації під ефірним наркозом на 3-ю, 7-у,
14-у, 28-у добу до і після введення ККМФПЗ.
Тканину ПЗ новонароджених поросят для культивування отримували по методу
[Турчін І.С., 1996]. Технологія її кріоконсервування була розроблена у
відділі експериментальної кріомедицини Інституту проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України [Сандомирський Б.П., Волкова Н.О., Гальченко
С.Є., Белочкіна І.В., 2000]. Для кріоконсервування брали мікрофрагменти
острівкової тканини ПЗ новонароджених поросят після культивування.
Загальна схема підготовки матеріалу наступна: експлантація ПЗ (
мікродисекція ПЗ в живильному середовищі 199 ( культивування впродовж
5-7-ми діб в живильному середовищі 199 з додаванням 10% ембріональної
телячої сироватки (ЕТС) і антибіотиків (100 од/мл) ( заморожування в
середовищі з 10% ДМСО за двоетапною програмою: 10С/хв. до – 70С/хв з
подальшою зупинкою, потім 100 С/ хв. до – 300 С/хв. з подальшим
зануренням в рідкий азот (-1960). Зберігання біоматеріалу при даній
температурі в герметично закритих контейнерах здійснювали протягом року
в низькотемпературному банку Інституту проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України.
У експеримент брали біоматеріал, який від моменту культивування і
кріоконсервування до застосування зберігали в умовах
низькотемпературного банку від 2-3-х тижнів до 10-12-ти місяців. Для
культивування і подальшого кріоконсервування брали тканину острівців ПЗ
у поросят у віці одного дня.
Перед введенням ККМФПЗ розморожували на водяній лазні при 370С,
триразово відмивали фізіологічним розчином від кріопротектору. Введення
ККМФПЗ щурам виконували під легким ефірним наркозом пункціями в
паренхіму печінки і селезінки, під капсулу нирки, в клітковину
панкреатичної залози, а також у м’язу бічної поверхні стегна. Доза
біоматеріалу, що вводилася, складала 0,5 г. Всі операції проводили в
умовах операційної з дотриманням стерильності.
У всіх тварин, що використовувалися в експерименті, проводився контроль
рівня глюкози в крові в базальному стані. Кров для аналізу брали з
хвостової вени після попереднього чотирьохгодинного голодування. Рівень
глюкози в крові визначали глюкозооксидазним методом із застосуванням
аналізатора глюкози “Ексан-Г” (Литва).
Рівень імунореактивного інсуліну в сироватці крові визначали за
допомогою стандартних наборів “рио-ИНС-ПГ-125І” (Білорусь) методом
радіоімунологічного аналізу “in vitro”. Індекс функції (-клітин (ФБК)
розраховували за допомогою алгоритму НОМА (Homeostasis Model
Assessment), який базується на одночасному визначенні індивідуальних
рівнів інсуліну і базальної глікемії [Matthews D.R. et. al., 1985], по
формулі:
ФБК= (20 х інсулін 0()/(глікемія 0(– 3,5),
де інсулін 0( – рівень імунореактивного інсуліну (мкОд/мл) в сироватці
крові натщесерце, глікемія 0( – базальна глікемія (ммоль/л) в сироватці
крові натщесерце.
Визначення вмісту фруктозаміну в сироватці крові проводили в ході
реакції відновлення з використанням нітросинього тетразолія в
карбонатному буфері (0,1 моль/л, рН 10,8), оптичну щільність вимірювали
при 530 нм [Johnson R.N. et. al., 1982]. Вміст загального холестерину і
тригліцеридів в сироватці крові визначали з використанням стандартних
наборів фірми “Lachema” (Чехія). Концентрацію неестерифікованих жирних
кислот (НЕЖК) в сироватці крові визначали фотоколориметричним методом з
використанням мідного реактиву і диетилдитіокарбоната [Duncomb W.C.,
1963]. Сумарний вміст атерогенної фракції ліпопротеїнов низької і дуже
низької щільності (ЛПНЩ+ЛПОНЩ) в сироватці крові оцінювали
турбодиметричним методом [Колб В.Г., Камышников В.С., 1982]. Вміст
первинних продуктів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) – дієнових,
оксидієнових і триєнових кон’югатів – визначали в гептан/ізопропанольних
екстрактах сироватки крові методом [Плацер З. и соавт., 1970;
Волчегорский и соавт., 1989], що характеризує ступінь ініціації
ліпопероксидації. Проводилося також визначення змісту кінцевих продуктів
ліпопероксидації, а саме продуктів, які реагують з тіобарбітуровою
кислотою (ТБК-активні продукти, ТБКАП), згідно методу [Стальная И.Д.,
Гаришвили Г.Т., 1977]. У гомогенаті печінки визначали початковий і
індукований двовалентним залізом і аскорбатом натрію рівень ТБКАП [Yan
H.Harding, 1997]. Інтенсивність вільнорадикального окислення ліпідів
визначали по величині хемілюмінесценції (ХЛ) [Бабенко Г.А. и соавт.,
1983] з використанням хемілюмінометру, в режимі рахунку фотонів в
сироватці крові і в суспензії печінки по методу [Oda A. еt. al., 1994].
З гематологічних показників оцінювали кількість еритроцитів – 1012/л і
лейкоцитів – 109/л шляхом підрахунку в камері Горяєва по методу [Кост
Е.А., 1968], швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) мікрометодом
Панченкова [Назаренко Е.А., 2000], визначення гемоглобіну –
ціанметгемоглобіновим методом [Кост Е.А.,1968] і лейкоцитарну формулу
загальноприйнятим методом [Меньшиков В.В., 1987].
Динаміку змін імунного статусу щурів визначали за змістом кількості
Т-хелперів (CD4+) і Т-супресорів (CD8+) методом прямої мембранної
імунофлюоресценції [Шторх В., Еммрах И., 1987], використовуючи
відповідні антищурячі ФІТЦ – мічені моноклональні антитіла (МАТ)
(CALTAG, США). Підрахунок проводили в люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ
Р1 (ЛОМО). Визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводили по
методу [Стручков П.В. и соавт., 1985]. Зміну щільності розчину
реєстрували на спектрофотометрі СФ-46. Константу К розраховували як
відношення концентрації С4 і С3. Кількість адгезівних клітин
перітонеальної порожнини (АКПП) оцінювали за допомогою тесту їх
приліпання до поверхні пластикових чашок Петрі. Число АКПП визначали як
різницю між кількістю внесених клітин і кількістю клітин в надосадку
[Пастер Е.У. и соавт., 1989]. Вивчення фагоцитарної активності клітин ПП
визначали по методу [Александров М.Т. и соавт., 1988], підраховуючи
кількість фагоцитуючих клітин (фагоцитарний індекс – ФІ) і середнє число
поглинених мікробних тіл однією клітиною(фагоцитарне число – ФЧ).
Вивчення морфологічних змін у тканині острівців ПЗ у щурів з розвитком
АД і після введення ККМФПЗ проводили на гістологічних препаратах
(Меркулов Г.А., 1980(. Мікроскопію забарвлених гематоксилін-еозином
гістологічних препаратів здійснювали в світловому мікроскопі ЛОМО, х
100; х 400.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному
комп’ютері, використовуючи пакет програм Exel і Statistica. Залежно від
характеру розподілу даних використовували параметричний метод
статистичного аналізу (t-критерій Ст’юдента) або непараметричний
Манна-Уітні, а також використовували r критерій Пірсона для оцінки
кореляції параметрів [Гланц З., 1999]. Як критерій статистичної
достовірності відмінностей приймали рівень 95% (р0,5
Дослідження концентрації інсуліна в сироватці крові і функції ?-клітин
(індекс ФБК) виявилося інформативним показником ефективності
застосування ККМФПЗ ( табл. 4). Так, у щурів з АД вже на 7-му добу
розвитку патології виявилося різке – з 105,67±7,48 до 15,82±1,88 пмоль/л
– падіння рівня інсуліну в сироватці крові, на 14-ту і 28-му добу
спостережень цей показник зменшувався повільно. Застосування ККМФПЗ
приводило до поступового підвищення рівня інсуліна у щурів на 28-му добу
спостережень (табл.4). Різниці між досліджуваними показниками в
залежності від локалізації введення, за вийнятком внутрішньом’язового
застосування, встановлено не було.
Ефективність використання ККМФПЗ підтвердилася дослідженням динаміки
індексу ФБК, який складається з рівня роботи як власних залишкових
панкреатичних (-клітин, так і введених в ході експерименту. Так на 7-му
добу після введення ККМФПЗ індекс ФБК відзначений на однаково низькому
рівні у всіх експериментальних тварин незалежно від локалізації
(табл.4). Але вже з 14-ої доби спостерігалося вірогідне підвищення
даного показника у всіх групах, за винятком тварин з внутрішньом’язовим
введенням ККМФПЗ. на 28-му добу індекси складали від 17% вихідної
величини при веденні в печінку і до 70,5% – при введенні в
парапанкреатичну клітковину. Слід підкреслити, що тількі в групі
експериментальних тварин з введенням ККМФПЗ в парапанкреатичну
клітковину індекс ФБК на 28-му добу вірогідно не відрізнявся від
показника у інтактних щурів, р > 0,5.
З метою підтвердження вираженої антиглікемічної дії ККМФПЗ
використовували метод неферментативного глікозилірування з визначенням
вмісту фруктоз- аміну. Даний метод дозволив встановити, що у щурів з АД
на 7-му добу розвитку патології спостерігається підвищення концентрації
фруктозаміну в сироватці крові. Цей ефект, як видно, пов’язаний з
інтенсивністю протікання процесів неферментативного глікозилірування –
посиленням метаболізму глюкози по гексозоаміновому шляху і утворенням
фруктози в інсуліннечутливих тканинах [Shield et al, 1994]. Найшвидше
рівень фруктозаміну знижувався при введенні ККМФПЗ в парапанкреатичну
клітковину.
Після введення ККМФПЗ рівень фруктозаміну поступово знижувався і на
28-му добу після введенняі в селезінку, під капсулу нирки, в
парапанкреатичну клітковину вірогідно не відрізнявся від такого у
інтактних щурів, що свідчить про фізіологічний рівень не тільки
базальної, але і постпрандіальної глікемії (табл. 5).
6
8
b
d
c
1/4
3/4
Oe
o
–
8
:
@
d
c
3/4
A
A
Ae
AE
E
E
I
I
?
O
O
Oe
Oe
o
o
–
„
??????R?-
D
O
???0????
??????
Oe0????
??????
???0????
@
@
????????
????????
????????
????????
????????
????????
?????????
???Важливою ланкою метаболічних порушень при розвитку ЦД є зниження
ліпогенної дії і зняття впливу гормонів, що інгібують при інсуліновій
недостатності ліполіз в печінці і жировій тканині.
Згідно гіпотезі MсGarry J.D. підвищення НЕЖК в крові пригнічує синтез
інсуліну (-клітинами ПЗ і тим самим призводить до розвитку
інсулінрезистентності, в умовах наявності інсулінсекретуючої активності
ПЗ при ЦД I типу.
У щурів при моделюванні АД спостерігали значне підвищення рівня
тригліцеридів в сироватці крові і концентрації НЕЖК, причому триразове
збільшення НЕЖК на 14-ту добу спостереження, замінювалося деяким
зниженням на 28-му добу, що може пояснюватися загальним виснаженням
периферичної жирової тканини – джерела НЕЖК і падінням їх синтезу de
novo внаслідок недоліку енергетичного субстрату для забезпечення реакції
– НАДФН (табл. 6).
Таблиця 4.
Динамика інсулінемії і функція (-клітин у щурів з АД і після введення
ККМФПЗ, n=7
Група тварин Строк спостереження, доба Інсулін, пмоль/л Глюкоза, ммоль/л
ФБК
АД
7-а 15,82±1,88 16,59±0,82 3,78±0,36
14-а 13,65±0,96 18,07±0,951 2,93±0,18
28-а 12,36±1,52 18,87±1,861 2,51±0,231
ККМФПЖ
в печінку 7-а 26,47±2,16 14,02±0,71 8,27±1,31
14-а 37,25±5,75 8,45±0,411 25,11±4,771
28-а 41,33±6,211 5,60±0,371,2 73,95±17,121
ККМФПЖ
в селезінку 7-а 30,00±3,74 12,01±0,48 11,30±1,59
14-а 43,33±3,721 6,66±0,211 44,68±6,141
28-а 42,17±2,021 4,39±0,231,2 213,52±61,031
ККМФПЖ під капсулу нирки 7-а 35,90±4,34 12,13±0,92 14,00±2,43
14-а 41,00±5,59 6,88±0,351 38,32±3,661
28-а 45,17±3,62 4,73±0,141,2 124,92±19,641
ККМФПЖ в парапанкреати
чну клітковину 7-а 29,50±2,65 10,55±0,38 13,49±1,63
14-а 40,42±3,701 5,54±0,451 97,07±35,031
28-а 41,43±3,531 4,40±0,291,2 301,61±136,701,2
ККМФПЖ внутрішньо-м’язово 7-а 19,32±1,68 15,59±0,32 5,02±0,48
14-а 18,35±0,74 12,37±0,251 6,49±0,33
28-а 22,70±1,37 8,84±0,361 13,87±1,851
Інтактні щури
105,67±7,48 4,16±0,07 532,47±56,10
Примітки: 1 – відмінності достовірні в порівнянні з показником до
введення, р0,05
Таблиця 5
Концентрація фруктозаміну у щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин Концентрація фруктозаміну, ммоль/л
Строк спостереження, доба
7-а 14-а 28-а
АД 3,54±0,29 3,92±0,34 4,22±0,42
ККМФПЗ
в печінку 3,28±0,10 2,91±0,24 2,42±0,221
ККМФПЗ
в селезінку 3,20±0,18 2,82±0,28 2,03±0,061,2
ККМФПЗ під капсулу нирки 3,15±0,16 3,02±0,30 2,11±0,091,2
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину 3,14±0,15 2,76±0,24 1,90±0,111,2
ККМФПЗ внутрішньом’язово 3,33±0,22 3,21±0,19 3,01±0,19
Інтактні щури 1,72±0,115
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з
показником на 7-му добу, р0,5
Таблиця 6
Концентрація тригліцеридів і неестерифікованих жирних кислот в сироватці
крові щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин Строк спостереження, доба Трігліцеріди, мг НЕЖК, ммоль/л
АД 7-а 1,02±0,05 1,21±0,10
14-а 1,73±0,042 1,06±0,042
28-а 1,58±0,061 0,93±0, 071
ККМФПЗ в печінку 7-а 1,07±0,04 1,19±0, 08
14-а 1,05±0,061 0,73±0, 071
28-а 1,02±0,052 0,63±0, 041,2
ККМФПЗ в селезінку 7-а 1,06±0,06 1,16±0,09
14-а 1,03±0,071 1,66±0,211
28-а 0,81±0,051,2,3 0,52±0,0531,2,3
ККМФПЗ під капсулу нирки 7-а 1,01±0,05 1,24±0,12
14-а 1,00±0,09 0,88±0,051
28-а 0,88±0,052 0,58±0,071,2
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину 7-а 0,99±0,05 1,13±0,10
14-а 0,82±0,071 0,54±0,051
28-а 0,79±0,051,2,3 0,45±0,041,2,3
ККМФПЗ внутрішньом’язово 7-а 1,032±0,06 1,25±0,092
14-а 1,035±0,074 1,07±0,051
28-а 1,13±0,062 0,76±0,061
Інтактні щури
0,73±0,042 0,36±0,042
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з
показником на 7-му добу, р0,5.
Введення ККМФПЗ запобігало патологічному підвищенню рівня тригліцеридів
в крові, незалежно від місця введення. Проте, при введенні в селезінку
або в парапанкреатичну клітковину концентрація НЕЖК достовірно не
відрізнялася від контрольних значень і корелювала з довгостроковим
глікемічним контролем.
Істотне підвищення вмісту холестерину в сироватці крові щурів при
розвитку АД попереджалося введенням ККМФПЗ. Виняток становило
внутрішньом’язове введення, при якому зниження даного параметра не
приводило до його нормалізації, навіть на 28-му добу спостережень (табл.
7).
Таблиця 7
Оцінка загального холестерину і атерогенної фракції ліпопротеїнів в
сироватці крові у щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин Строк
спостереження, доба Загальний холестерин, ммоль/л ЛПНП+ЛПОНП, мг/мл
Інтактні щури 7-а 1,94±0,12 1,54±0,082
28-а 2,01±0,122 1,57±0,092
АД 7-а 2,09±0,093 2,20±0,10
28-а 2,98±0,161 3,76±0,141
ККМФПЗ
в печінку 7-а 2,04±0,113 2,25±0,10
28-а 2,31±0,122,3 1,69±0,071,2,3
ККМФПЗ
в селезінку 7-а 2,01±0,103 2,07±0,11
28-а 2,10±0,112,3 1,66±0,081,2,3
ККМФПЗ
під капсулу нирки 7-а 2,08±0,123 2,11±0,10
28-а 2,12±0,122,3 1,71±0,071,2,3
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину 7-а 2,02±0,143 2,06±0,08
28-а 2,09±0,122,3 1,68±0,091,2,3
ККМФПЗ
внутрішньом’язово 7-а 2,08±0,133 2,17±0,12
28-а 2,49±0,142 1,90±0,092
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з
показником на 7-му добу, р0,5
Була проведена комплексна оцінка інтенсивності пероксидації ліпідів у
щурів з АД до і після застосування ККМФПЖ по рівню початкових (ДК, ТК,
ОДК) і кінцевих (ТБКАП) продуктів ПОЛ у сироватці крові, визначенню
інтенсивності ХЛ, індукованої Fe2+ і Н2О2, у сироватці крові і
печинці тварин. Встановлено, що найбільш виражене вірогідне зниження
концентрації ДК, ТК, ОДК і ТБКАП у крові спостерігалося на 14 добу після
введення ККМФПЖ в парапанкреатичну клітковину, на 28 – після введення
під капсулу нирки і в селезінку; наіменший ефект був отриманий при
введенні біоматеріалу внутрішньом?язово і в печінку. Введення ККМФПЖ
внутрішньом?язово і у парапанкреатичну клітковину приводило до
вірогідного зниження Fe2+- і Н2О2-індукованої ХЛ у сироватці крові
щурів на 28 добу після застосування відносно показників при АД.
Дослідження методом ХЛ вільнорадикальних процесів у печінці щурів
показало, що при АД активується утворення вільних радикалів (ХЛ,
індукована Fe2+) і зменшується стійкість до перекисного окислення (ХЛ,
індукована Н2О2); спостерігається, також, значне (у 4,1 раза) зростання
ХЛ після попередньої інкубації гомогената печінки з аскорбатом
(неферментативна активація ПОЛ). Застосування ККМФПЖ введенням у
парапанкреатичну клітковину і внутрішньом?язово сприяло зниженню
досліджених показників, особливо ХЛ, індукованої Fe2+, а також кількості
аскорбат-індукованого ТБКАП, тоді як для початкового і індукованого
Fe2+ рівня ТБКАП встановлено лише слабку тенденцію до зниження.
Порівняльна оцінка ефективності застосування ККМФПЖ свідчить про те, що
зниження активності вільно радикальних процесів у щурів з АД
відбувається опосередковано, через відновлення рівня глюкози в крові, і
залежить від локалізації введення біоматеріалу. Більш ранні строки
стабільного зниження рівня глюкози в крові після введення ККМФПЖ у
парапанкреатичну клітковину поєднуються з більш вираженою і швидкою
нормалізацією рівня вільно радикальних процесів у експериментальних
тварин.
Дослідження гематологічних показників крові щурів з розвитком АД
дозволило встановити, що введення ККМФПЗ на 14-ту добу, у термін
найбільш яскравих клінічних проявів, володіє здатністю нормалізувати
показники периферичної крові, а саме: підвищувати вміст еритроцитів і
знижувати кількість лейкоцитів, нормалізувати такі важливі показники, як
ШОЕ, вміст лімфоцитів з одночасним зниженням кількості моноцитів і
нейрофільних гранулоцитів. Так, здатність ККМФПЗ нормалізувати показники
периферичної крові щурів з розвитком патологічного процесу залежить від
локалізації введення біоматеріалу. Найбільш виражену тенденцію до
нормалізації цих показників спостерігали у щурів при введенні ККМФПЗ в
парапанкреатичну клітковину. В такому випадку досліджені параметри
найбільш наближалися до показників інтактного контролю.
Вивчення стану імунної системи (ІС) при розвитку патології ЦД І типу, що
відноситься до аутоімунних захворювань (Малышев В.А., 1998; Yang Z. et.
al., 2002; Chen C. et. al., 2003; Chen Y. et. al., 2004), пов’язано з
особливостями взаємодії імунної і ендокринної систем. Порушення функції
ендокринної системи, що пов’язана насамперед з продукцією гормонів ПЗ,
спричиняє зміни і в ІС, а саме в її клітинній і гуморальній ланках.
Судячи з отриманих даних, застосування ККМФПЗ може або поcередньо, або
безпосередньо коригувати стан ІС, насамперед, її клітинну ланку, що
знаходиться в щонайтіснішому взаємозв’язку з ендокринною сферою
організму щура. Так для Т-ланки ІС найбільш значущими було повернення до
норми абсолютного змісту CD4+ клітин (Т-хелперів). Не дивлячись на
тенденцію до підвищення концентрації CD8+клітин (Т-супресорів) порівняно
з нелікованими щурами, достовірних змін їх відносного вмісту досягнуто
не було. Це відображається в показниках ІРІ (табл. 8).
Таблиця 8
Відносний вміст CD4+ і CD8+ Т лімфоцитів крові щурів з AД і після
введення ККМФПЗ
Група тварин Строк спостереження, доба
3-я 7-а 14-а 28-а
Т-лімфоцити Т-лімфоцити Т-лімфоцити Т-лімфоцити
СD4+ CD8+ ІРІ СD4+ CD8+ ІРІ СD4+ CD8+ ІРІ СD4+ CD8+ ІРІ
ККМФПЗ в печінку 10,961± 1,211 10,003±1,0 1 1,096±
0,10 1 7,901± 0,90 10,403±
1,10 0,759±
0,102 17,92±
1,402 22,50±
2,602 0,796±
0,68 24,234±
2,50 1 20,633±
3,143 1 1,175±
0,795 1
ККМФПЗ в селезінку 12,444±
1,412 8,603± 0,914 1,446±
0,102 14,50± 1,50 21,414±
2,302 0,677±
0,05 24,612±2,902 26,010±2,44 1,2 0,946±
0,202 1 26,712±
3,10 1 18,7±
2,23 1,428±
0,390 1
ККМФПЗ під капсулу нирки 10,832±
1,901 5,215±
0,60 2,077± 0,20 1 10,117±1,20 12,20±
1,316 0,829± 0,08 25,110±2,80 7,633±
0,902 3,289±
0,104 22,823±
2,803 15,600±1,90 1,463±
0,475 1
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину 15,212±
1,710 12,0±
1,40 1,267± 0,201 14,900±1,235 15,914±
1,60 0,936±
0,10 22,215±2,603 21,30±
2,7331,2 1,043± 0,952 1,2 28,0±
3,20 2 19,0±
2,30 1,474±
0,391
ККМФПЗ внутрішньо-м’язово 14,654±
1,614 4,201± 0,510 3,488± 0,440 14,212± 1,502 1 7,933±
0,904 1,792±
0,402 25,215±3,20 19,402±1,602 1,2 1,299±
0,998 1 22,623±
2,302 1 12,6±
1,016 1 1,795±
0,076
АД 14-а доба СD4+ – 15,02±1,320 CD8+ – 7,16±0,76 ІРІ– 2,098±0,318
Інтактні щури СD4+ – 35,31±1,36 CD8+ – 22,24±1,83 ІРІ –
1,588±0,581
Примітка: 1 – відмінності статистично достовірні порівняно з показниками
АД (p
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter