.

Особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного навантаження (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
118 2875
Скачать документ

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

пОЛКОВЕНКО оЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК [591.84+576.31]:591.471.37

Особливості остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні
опорного навантаження

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті зоології ім. І.І. Шмальгаузена НАН України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Родіонова Наталія Василівна

Інститут зоології ім. І.І. Шмальгаузена НАН України

завідувач відділу цитології та гістогенезу

Офіційні опоненти доктор біологічних наук, професор

Ільєнко Микола Микитович

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка

професор кафедри зоології

доктор біологічних наук, професор

Новак Віталій Петрович

Білоцерківський державний аграрний університет

завідувач кафедри анатомії та гістології

ім. П.А. Ковальського

Провідна установа

Національний аграрний університет, м. Київ

Захист відбудеться “28_”____03_____ 2007 року о ____годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. Глушкова 2, біологічний
факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул Володимирська, 64.

З дисертацію можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ-33, вул Володимирська,
58)

Автореферат розісланий “_24__” ____02_____ 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Цимбалюк О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Найтиповішими змінами в кістковому скелеті при
зниженні опорного навантаження (в умовах космічних польотів, при
тривалій гіпокінезії, імобілізації тощо) є зменшення маси, міцності та
мінеральної щільності кісткової тканини. Втрата кісткової тканини
кваліфікується як остеопенія, іноді остеопороз. Особливо це стосується
кісток, які несуть опорне навантаження (довгі кістки, кістки тазу,
хребці): в них збільшується ризик переломів [Григорьев, Ступаков,
Воложин, 1994; Оганов, Шнайдер, 1996; Carmeliet et al., 2001;
HYPERLINK
“http://www4.infotrieve.com/newmedline/summary.asp?presearch=1&term=Iwas
aki Y” Iwasaki et al., 2002; Дурнова та ін., 2004; Оганов, 2005;
Березовский, Литовка, 2006]. За даними ВООЗ остеопороз – одне з
захворювань, обумовлених малорухливим способом життя (гіпокінезія) і за
розповсюдженістю та смертністю від його наслідків (переломи кісток у
людей похилого віку, особливо у жінок) займає третє місце після
серцево-судинних та онкологічних захворювань.

Цитологічні механізми втрати кісткової тканини при гіпокінезії та
мікрогравітації залишаються багато в чому неясними. В наземних модельних
дослідах та у космічних експериментах на щурах і мавпах встановлено
зниження інтенсивності остеопластичних процесів у кістках, зменшення
кількості остеобластів та їх функціональної активності [Zerath, 1998;
Rodionova et al., 2000; Дурнова та ін., 2004 та ін.]. Показано посилення
процесів остеоцитарного остеолізу і апоптоза остеоцитів в кісткових
структурах [Noble et al., 2000; Rodіonova, Oganov, Zolotova, 2002;
Klein-Nulend, 2003 та ін.].

Однак, щодо особливостей остеокластичної резорбції кісткової тканини при
зниженні опорного навантаження, питання залишається дискусійним. Деякі
дослідники пов‘язують остеопоротичні перебудови в кістках при
гіпокінезії та мікрогравітації зі збільшенням кількості остеокластів
[Mattew et al., 2003 та ін.]. Інші припускають, що активізація
остеокластичної резорбції не відбувається, а втрата кісткової маси є
наслідком гальмування процесів остеогенеза [Rubin et al., 2000 та ін.].
Так, у дослідженнях на біосупутниках “БІОН-3-4-5” (тривалість польоту
18,5-21,5 діб) показано, що зменшення (на 30-35%) об‘єму трабекул у
великогомілкових і плечових кістках щурів супроводжується зниженням
кількості остеобластів та відсутністю змін у популяції остеокластів
[Wronskі et al., 1987 та ін.]. В експериментах на “БІОН-8”, SLS-1, SLS-2
(тривалість польотів 2 тижні) гістоморфометричні дослідження довгих
кісток щурів показали збільшення кількості остеокластів [Дурнова та ін.,
1990, 1994, 1996 та ін.].

Дані про зміни в популяції остеокластів є суперечливими і в
експериментах на щурах з модельованої гіпокінезії (зняття опорного
навантаження з задніх кінцівок) [Weinreb et al., 1989; Mattew et al.,
2003 та ін.]. В гістологічних дослідженнях кісток мавп після 30-денного
перебування в умовах АНОГ (кут -5°) та 10-денного експерименту на мавпах
за умов “сухої” імерсії показано значне зменшення губчастої кісткової
тканини, однак не виявлено змін у кількості й активності остеокластів
[Дурнова та ін., 2004]. Також залишаються маловивченими особливості
процесів остеокластичної резорбції у різних зонах довгих кісток при
зниженні опорного навантаження.

Слід також враховувати, що інтенсивність процесів резорбції у кістковій
тканині визначається не тільки кількістю остеокластів, але й
функціональною активністю кожної клітини [Gruber, 2001 та ін.]. Тому для
оцінки інтенсивності резорбтивних процесів при гіпокінезії та
мікрогравітації необхідними є дані про ультраструктурні особливості
остеокластів. Наявність в зонах резорбції остеокластів різних
функціональних станів показано в електронно-мікроскопічних дослідженнях
[Родіонова, 1983, 1989 та ін.]. Однак, у літературі не знайдено
відомостей про ультраструктуру остеокластів при гіпокінезії і
мікрогравітації.

Маловивченим є також питання про морфологічні особливості взаємодії
остеокластів з остеобластами і остеоцитами в зонах резорбції
[Notelovitz, 2002; Daci et al., 2002 та ін.]. Недослідженими залишаються
також особливості остеокластогенезу при зниженні опорних навантажень,
але такі відомості є важливими для оцінки інтенсивності процесів
ремоделювання кісткових структур. Необхідність вивчення особливостей
функціонування остеокластів в умовах космічного польоту відображена в
Інтернет-ресурсі Search Strategy (NASA SPACELINE Office). Все
вищевказане обумовлює актуальність наших досліджень.

Зв’язок теми дисертації з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана відповідно до тематичного плану наукових
досліджень Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України в
рамках науково-дослідницької теми відділу цитології та гістогенезу
“Цитологічні механізми структурно-функціональних адаптацій в опорних і
кровотворних тканинах при дії на організм деяких факторів зовнішнього
середовища” (номер держреєстрації 0100U006481).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з‘ясувати особливості
остеокластичної резорбції кісткової тканини при зниженні опорного
навантаження (модельована гіпокінезія та мікрогравітація).

Для досягнення мети роботи були поставлені наступні задачі:

– дослідити гістоструктурні перебудови в різних зонах стегнових кісток
щурів при знятті опорного навантаження на задні кінцівки (модельована
гіпокінезія);

– виявити зміни в популяції остеокластів (кількість остеокластів, у тому
числі функціонально-активних, кількість ядер в них, питому площу
остеокластів) в різних зонах адаптивного ремоделювання кісток за умов
модельованої гіпокінезії;

– вивчити динаміку утворення остеокластів у зонах резорбції кісток при
знятті опорного навантаження на задні кінцівки;

– проаналізувати зміни в ультраструктурі остеокластів у зонах
ремоделювання кісткової тканини при модельованій гіпокінезії та
мікрогравітації (космічна станція SLS-2, біосупутник “БІОН-11”);

– виявити морфологічні особливості взаємовідносин остеокластів з
остеобластами і остеоцитами в зонах резорбції кісткової тканини при
гіпокінезії та мікрогравітації.

Об’єкт дослідження: остеокластична резорбція кісткової тканини при
зниженні опорного навантаженн на кістковий скелет.

Предмет дослідження: гістоструктурні перебудови в кістковій тканині та
морфо-функціональні особливості остеокластів при модельованій
гіпокінезії та мікрогравітації.

Матеріал дослідження: стегнові кістки білих щурів, біопсійний матеріал
із гребеня клубової кістки нелюдиноподібних мавп (Macaca mulatta).

Методи дослідження: гістологічний – для вивчення змін у кістковій
тканині й популяції остеокластів; радіоавтографічний – для дослідження
динаміки остеокластогенезу; метод електронної мікроскопії – для
вивчення змін в ультраструктурі остеокластів і міжклітинних взаємодій у
зонах резорбції; морфометрія – на світлооптичному та
електронно-мікроскопічному рівнях – для об‘єктивізації результатів
досліджень; статистичний метод – для оцінки вірогідності результатів
вимірів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження морфо-функціональних особливостей остеокластичної резорбції
при зниженні опорного навантаження на кістковий скелет.

Одержані нові дані, що засвідчують значну роль остеокластів у втраті
кісткової тканини при тривалій гіпокінезії та мікрогравітації. Показано,
що в зонах адаптивного ремоделювання кісткових структур, насамперед у
губчастій кістці епіфізів і метафізів, збільшується кількість
остеокластів і функціонально-активних форм у популяції. В меншому
ступені це характерно для кісткової тканини діафізів.

Вперше з використанням 3Н-тімідіну встановлено, що при тривалій
гіпокінезії за локусом зняття опорних навантажень відбувається
прискорення процесів остеокластогенезу.

Посилення процесів остеокластичної резорбції при гіпокінезії та
мікрогравітації підтверджено оригінальними даними
електронно-мікроскопічних досліджень: в популяції виявлено остеокласти з
більш інтенсивно розвиненими порівняно з контролем комплексом Гольджі та
структурами, що забезпечують специфічні функції резорбції: фібрилярним
шаром, фаголізосомами, “щіточною облямівкою”.

Вперше показано, що в умовах мікрогравітації у популяції остеокластів
з‘являються “гігантські” остеокласти, в яких спостерігається вищий
порівняно з контролем та типовими функціонально-активними остеокластами
ступінь розвитку зони специфічних функцій, описані структурні
особливості їх резорбтивної функції при мікрогравітації. Одержані нові
дані про морфологічні взаємодії остеокластів з остеобластами й
остеоцитами в зонах резорбції.

Результати досліджень є внеском в розуміння клітинних механізмів
адаптивного ремоделювання та втрати кісткової тканини при знятті опорних
навантажень на кістковий скелет.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені особливості
остеокластичної резорбції в довгих кістках при зниження опорного
навантаження (тривалій гіпокінезії та мікрогравітації) можуть бути
використані в медицині для цілеспрямованої розробки заходів із
профілактики й лікування остеопеній та остеопорозу, обумовлених
малорухливим способом життя, зокрема при розробці та тестуванні
остеопротекторів. Результати досліджень слід також враховувати в
космічній біології та медицині при підготовці й проведенні експериментів
на тваринах і для запобігання ушкоджень опорно-рухового апарату
космонавтів в тривалих космічних польотах. Одержані результати можна
рекомендувати для включення в спецкурси із цитології, гістології та
патології кісткової тканини в біологічних і медичних вищих навчальних
закладах.

Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес і
наукові дослідження на кафедрі анатомії та гістології ім.
П. О. Ковальського, в лабораторії гістології Білоцерківського державного
аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовано наукову
літературу з проблеми, сформульовано основні положення дисертаційної
роботи та висновки, виготовлено фотодокументацію та ілюстрації. Здобувач
брав участь зі співавторами публікацій у постановці експериментів на
тваринах із гіпокінезії для гістологічних, гісторадіоавтографічних та
електронно-мікроскопічних досліджень (проводив забір та обробку
біоматеріалу, виготовляв гістопрепарати і гістоавтографи). Самостійно
проведені гістологічні й морфометричні дослідження, а також науковий і
статистичний аналіз одержаних даних. Для електронно-мікроскопічних
досліджень здобувач використовував біозразки та фотоматеріали з фондів
відділу цитології і гістогенеза Інституту зоології НАН України. Науковий
аналіз гістоавтографів та електронних мікрофотографій проведено за
участю наукового керівника, проф. Н. В. Родіонової.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені та обговорені
на ХІІ конференції з космічної біології та авіакосмічної медицини
(Москва, 2002), на ІІІ Національному Конгресі анатомів, гістологів,
ембріологів і топографоанатомів України (Київ, 2002), на Другій
Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі,
Крим, 2002), на Російській конференції з міжнародною участю “Организм и
окружающая среда: адаптация к экстремальным условиям” (Москва, 2003), на
35th COSPAR Scientific Assembly (Париж, 2004), а також на засіданнях
відділу цитології і гістогенезу та на конференції молодих дослідників
(Інститут зоології НАНУ, Київ, 2004), на ХІІІ конференції з космічної
біології та авіакосмічної медицини (Москва, 2006), на 36th COSPAR
Scientific Assembly (Пекін, 2006).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових
праць, які містять основні положення проведеного дослідження: з них 9
статей – 3 у фахових виданнях, затверджених ВАК України, 6 – у наукових
журналах, матеріалах конференцій і з’їздів, а також 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертаційна робота надрукована на 168 сторінках основного тексту.
Складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів
дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів,
висновків, списку
використаної літератури. Ілюстрована 36 мікрофотографіями, 20 електроног
рама-ми, 24 малюнками (графіками), 3 таблицями. Список використаних
літературних джерел включає 210 найменувань (26 – держав СНД, 179 –
інших зарубіжних країн).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень.

Модельована гіпокінезія. Експерименти проведені на статевозрілих білих
щурах лінії Wistar (самці, вага ?220-240 г). Гіпокінезія моделювалася за
методом, запропонованим Morey-Holton, Wronski (1981) та модифікованим
А. Я. Капланським та Г. І. Дурновою (ДНЦ – Інститут медико-біологічних
проблем, РАН, Москва, Росія), шляхом зняття опорного навантаження з
задніх кінцівок тварин (метод “вивішування” за хвіст, кут 35°). При
цьому тварини вільно пересувалися на передніх кінцівках у межах клітки
до води й кормів. Під час усіх експериментів тварини знаходилися на
стандартному раціоні. Було проведено два експерименти. В першому
експерименті (тривалістю 28 діб) 17 тваринам (9 дос-лідним та 8
контрольним) однократно вводили 3Н-тімідін для радіоавтографічних
досліджень. У другому експерименті, якій складався з двох серій дослідів
(кожен тривалістю 28 діб) у 18 тварин (9 – контроль і 9 – дослід) було
взято стегнові кістки для гістологічних та електронно-мікроскопічних
досліджень. Біозразки кісток відбирали після проведення тваринам
ефірного наркозу.

Мікрогравітація.

Космічна станція SLS-2. Дослід був поставлений на статевозрілих щурах
лінії Sprague-Dawley (самці, середня вага тварин – 250 г) в рамках
міжнародного співробітництва спільно з російськими та американськими
вченими на борту американської космічної станції SLS-2. Тривалість
польоту 2 тижні. Тварини були розділені на дві групи (по 5 особин у
кожній). Перша група – польотна, друга група – наземний синхронний
контроль. Тварини з групи синхронного контролю знаходилися на Землі в
аналогічних контейнерах та умовах, що і щури в космічному апараті.

Біосупутник “БІОН-11”. Космічний експеримент (тривалістю 14 діб) був
проведений в рамках міжнародного співробітництва спільно з російськими
вченими на нелюдиноподібних мавпах (Macaca mulatta). Перша група тварин
– польотна (2 особини). До групи наземного синхронного контролю (мавпи
сиділи у кріслах) входили 3 особини.

По закінченні експериментів зразки кісткової тканини із метафізів
стегнових кісток білих щурів (SLS-2) та з гребеню клубової кістки мавп,
взятих методом біопсії (“БІОН-11”) були надані відділу цитології і
гістогенезу проф. В. С. Огановим (ДНЦ – Інститут медико-біологічних
проблем, РАН, Москва). Для дослідження змін в ультраструктурі
остеокластів при дії факторів космічного польоту використано матеріали
(епоксидні блоки з біозразками кістки, негативи і електронні
мікрофотографії) із фондів відділу цитології та гістогенезу.

Методи дослідження. Гістологічні методики. По закінченні експериментів
із модельованої гіпокінезії у щурів було вичленовано довгі кістки, які
фіксували у 10% нейтральному формаліні 2-3 тижні, декальцинували у
трилоні Б (рН – 7,4) 2,5 місяці, зневоднювали у спиртах зростаючої
концентрації (70є, 80є, 96є), потім – у суміші абсолютного спирту і
ксилолу (1:1). Після цього біозразки просвітлювали у ксилолі та у суміші
ксилолу й парафіну і заключали у парафін. З кісток у сагітальній площині
на одному рівні виготовляли гістозрізи (8-10 мкм) на мікротомі марки
Reichert (Aвстрія) та зафарбовували гематоксилін-тіонін-еозіном і
гематоксилін-азур2-еозіном [Мажуга, Вечерская, 1974, в нашій
модифікації]. Використовували реактиви фірми “Amersham”, Австрія.

Радіоавтографія. Для вивчення динаміки утворення остеокластів при
модельованій гіпокінезії нами застосовано метод радіоавтографії з
3Н-тімідіном. Цей метод дає можливість дослідити проліферативну
активність клітин і динаміку клітинних популяцій [Епифанова, Терских,
Полуновский, 1983, та ін.]. 3Н-тімідін (“Amersham”, Австрія) однократно
інтраперітонеально вводили білим щурам за 3 дні до закінчення першого
експерименту в дозі 0,5 мкKu/г маси тіла. Стегнові кістки вичленовували
через 1 год., 48 год., 72 год. після введення ізотопу, фіксували в 10%
нейтральному формаліні, обробляли за вищеописаною методикою та заключали
в парафін. На гістозрізи наносили дрібнозернисту фотоемульсію типу “М”
(Московський завод фотопластин). Гісторадіоавтографи експонували (14
діб) у холодильнику, після експонування проявляли за методикою
[Епифанова, Терских, Полуновский, 1983] і зафарбовували гематоксиліном
Майера-еозіном. На гістоавтографах підраховували індекс мічених ядер в
остеокластах (на 100 ядер) та інтенсивність мічення ядер (кількість
зерен срібла) в проксимальних метафізах стегнових кісток в досліді та
контролі.

Електронна мікроскопія. Біозразки кісткової тканини (?1 мм3) фіксували у
2,5 % розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері (рН 7,2-7,4),
дофіксовували у 1 % осмієвій кислоті на фосфатному буфері, зневоднювали
у спиртах та заключали у аралдит (“Sigma”, Німеччина). Активність кислої
фосфатази виявляли за методом Гоморі в модифікації [Бухвалов, 1982].
Ультратонкі зрізи виготовляли скляними ножами на ультрамікротомі
“УМТП-5”. З епоксидних блоків зі зразками кістки виготовляли напівтонкі
зрізи (1-2 мкм), які зафарбовували метиленовим синім з метою виявлення в
них остеокластів. Контрастування ультратонких зрізів проводилося
цитратом свинцю за методикою [Venable et al., 1965]. Зрізи вивчали та
фотографували в електронному мікроскопі “Тесла ВС-500”.

Методика морфометричного аналізу. На гістопрепаратах стегнових кісток
від кожного щура підрахунки здійснювалися на 50 зрізах. На кожному зрізі
в зонах, що досліджувались (проксимальні та дистальні епіфізи та
метафізи, періост, ендост і судинні канали діафізу) на трьох полях зору
методом точкового підрахунку [Автанділов, 1991] на еквівалентних
площинах зрізу при збільшенні об.Х25, ок.Х12,5 підраховували наступні
показники: відносний питомий об‘єм кісткових трабекул в епіфізах і
метафізах та в кістковій тканині середньої частини діафізу, питому площу
щілин і порожнин, а також судинних каналів у діафізах. Крім того,
визначали: кількість остеокластів на кісткових трабекулах епіфізів і
метафізів, а також у періості, ендості та судинних каналах діафізу,
кількість ядер в остеокластах на гістозрізі, питому та абсолютну площу
остеокластів. Використовували комп‘ютерну систему аналізу зображень для
світлових мікроскопів із цифровою камерою Canon PowerShot і програму
“Biowizard”.

На гістоавтографах мінімальна кількість зерен срібла, при якій ядра
остеокластів вважали міченими, складала 4 зерна, максимальна для
підрахунку – 40 зерен. Інтенсивність мічення підраховували в 100 ядрах
остеокластів, а також аналізували розподіл ядер за кількістю міток у
різні строки досліду.

Електронні мікрофотографії сканувалися на сканері НР ScanJet 3570C.
Методом точкового підрахунку [Автандiлов, 1991] визначався відносний
питомий об‘єм клітинних органел за допомогою програми “Photoshop- 6.0”.

Статистичний аналіз одержаних результатів із гістологічних,
гісторадіоавтографічних та електроно-мікроскопічних досліджень
проведений з використанням програми EXCEL, а також “Statistica 6”.

Основні результати досліджень.

Гістоструктурні перебудови в стегнових кістках щурів при модельованій
гіпокінезії. Вивчені зміни в гістоструктурі проксимальних і дистальних
епіфізів і метафізів, а також у кістковій тканині діафізів. У кісткових
трабекулах проксимальних і дистальних епіфізів дослідних тварин виявлені
зміни в архітектоніці з ознаками деструктивного характеру. В кістковій
тканині трабекул спостерігаються вузькі щілини, овальні або видовжені
порожнини, часткове руйнування трабекул. Ці порушення гістоструктури
орієнтовані в різних напрямах відносно поздовжньої вісі кістки.
Морфометричний аналіз показав, що в проксимальних епіфізах деструктивні
зміни кісткової тканини в дослідних тварин виражені сильніше, ніж у
дистальних. Так, у проксимальних епіфізах питомий об‘єм кісткових
трабекул знижується на 22,7% (0,531+0,02 в контролі та 0,410+0,022 в
досліді, Р>

B

F

H

O

U

Ue

H?e>

@

B

¬

TH

B

D

ластів в умовах експериментальної гіпокінезії порівняно з контролем, ми
підраховували середню інтенсивність мічення ядер в остеокластах в
експозиціях 48 годин і 72 годин. В експозиції 48 годин досліду середня
інтенсивність мічення ядер остеокластів у досліді складала 24,8+0,9
зерен срібла, до 72 годин вона знижувалась до 7,1+0,3 зерен, (тобто ? у
3,1 рази). В контролі інтенсивність мічення ядер в остеокластах
складала: в експозиції 48 годин – 25,5 + 1,2 зерен. До 72 годин
інтенсивність мічення ядер в остеокластах знизилась до 12,1+ 0,6 зерен
(тобто у 2,2 рази) (рис.5).

Рис. 5. Зміна середньої інтенсивності мічення ядер остеокластів
3Н-тімідіном в зонах ремоделювання кісткових трабекул у метафізах
стегнової кістки щурів при гіпокінезії.

* – різниця вірогідна порівняно з контролем, Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020