.

Поліморфізм фрагментів днк та особливості геномної організації деяких видів ссавців і дводольних рослин (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
125 3822
Скачать документ

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

ТРЯПІЦИНА Наталія Василівна

УДК 575:636.082:573.4

Поліморфізм фрагментів днк та особливості геномної організації деяких
видів ссавців і дводольних рослин

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті агроекології Української Академії аграрних
наук

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор

Глазко Валерій Іванович

Завідувач відділу радіоекології

Інституту агроекології УААН

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

Димань Тетяна Миколаївна

Білоцерківський аграрний
університет,

завідувач кафедри екотрофології

кандидат біологічних наук,

Балацький Віктор Миколайович,

Інститут свинарства УААН

завідувач лабораторії генетики

Провідна установа: Київський національний аграрний університет

при Кабінеті Міністрів України,
м. Київ

Захист відбудеться 11 травня 2006 р. об 11 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.26.371.01 Інституту агроекології УААН за
адресою: 03143, м.Київ, вул. Метрологічна,12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології
УААН за адресою: м. Київ, вул..Метрологічна,12.

Автореферат розіслано 11 квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук
Л.І.Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. При вирішенні теоретичних і прикладних
завдань сільськогосподарської генетики необхідно мати високополіморфні
молекулярно-генетичні маркери, які б дозволяли адекватно оцінювати
рівень генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і тварин
а також споріднених з ними диких видів (Глазко, Созинов, 1993;
Сиволап, 1998).

В останні роки стали інтенсивно використовуватися маркери,
отримання яких базується на ампліфікації різних класів повторюваної ДНК,
зокрема мікросателітної (ISSR-PCR-маркери) (Caetano-Annoles, 1995; Wolfe
et al., 1998; Gupta et al., 1998) і транспозонної (IRAP-PCR-маркери)
(Waugh et al., 1997; Kalendar et al., 1999; Leigh et al., 2003). Обидва
класи маркерів є фрагментами геномної ДНК, що фланковані інвертованими
повторами. Основною їх перевагою є високий рівень поліморфізму та
відтворення, що робить можливими міжлабораторні порівняння. Недоліком
цих маркерів є відсутність інформації про функції й хромосомну
локалізацію. Це ускладнює інтерпретацію даних, які отримуються з їх
використанням, оскільки не дозволяє оцінити рівень нейтральності цих
маркерів до дії добору та їх універсальність для визначення генотипів
рослин і тварин на всіх таксономічних рівнях. Не визначені також чіткі
критерії для цілеспрямованого підбору цих маркерів для роботи з
рослинними і тваринними геномами, що сприяло б ефективнішому їх
використанню при паспортизації геномів, MAS-селекції, оцінці
внутрішньопородньої, внутрішньосортової й внутрішньопопуляційної
генетичної мінливості, вивченню генетичних наслідків впливу різних
факторів добору, у тому числі стресових.

З огляду на це, розробка нових підходів до оцінки рівня
інформативності молекулярно-генетичних маркерів, що базуються на
використанні характеристик із фізичним і математичним змістом, і
виявлення найбільш інформативних ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для
оцінки генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і
тварин є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими прогамами, планами, темами. Дослідження
проводилися відповідно до тематичного плану науково-дослідних робіт
Інституту агроекології УААН за темою: „Теоретично обгрунтувати і
розробити практичні заходи щодо екологічного використання
природоресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого
розвитку аграрного виробництва і покращання якості життя людини” (номер
державної реєстрації 0101U003298), підпрограма „Теоретично обгрунтувати
і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для
цілеспрямованого формування сталих агросистем” (номер Державної
реєстрації 0101U003296).

Мета і задачі досліджень. Метою дослідження була оцінка
інформативності, універсальності та нейтральності до дії добору
ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів залежно від особливостей досліджуваних
геномів (сільськогосподарські види рослин і тварин та споріднені дикі
види) і від характеристик локусів повторюваної ДНК, що їх фланкують
(мікросателітні послідовності з ди- і тринуклеотидними субповторами та
транспозонні послідовності).

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Провести порівняльний аналіз поліморфізму молекулярно-генетичних
маркерів, отриманих із використанням ди- і тринуклеотидних
мікросателітних праймерів у геномах ссавців (на прикладі диких і
доместикованих представників підродини Bovinae) і рослин (на прикладі
диких і доместикованих представників підродини Phaseoleae).

2. На підставі сімейного аналізу дослідити поліморфізм, успадкування і
нейтральність до дії факторів добору ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів, а
також оцінити можливі мутаційні події в поколіннях групи великої рогатої
худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового
радіоактивного випромінювання.

3. Оцінити універсальність ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для
використання в оцінці та паспортизації геномів рослин і тварин.

4. Дослідити залежність рівня поліморфізму ISSR-PCR-маркерів від
композиційних і термодинамічних характеристик фланкуючих їх локусів ди-
і тринуклеотидних мікросателітних послідовностей.

Об’єкт досліджень – поліморфізм молекулярно-генетичних
ISSR-PCR-маркерів і IRAP-PCR-маркерів та фактори, що його визначають
у доместикованих і диких представників рослин і тварин.

Предмет досліджень – геноми доместикованих та споріднених з ними диких
видів рослин і тварин.

Методи досліджень. У роботі було використано загальноприйняті методики
виділення й очищення рослинної і тваринної ДНК. Для отримання
мультилокусних ампліфікаційних спектрів використано метод полімеразної
ланцюгової реакції у двох модифікаціях (ISSR-PCR, IRAP-PCR). Для
отримання електрофоретичних спектрів продуктів ампліфікації використано
метод агарозного горизонтального гель-електрофорезу. Статистичну обробку
результатів, кореляційний і регресійний аналіз проведено із
використанням статистичних програм. Для розрахунків генетичних дистанцій
(Nei, 1976) та побудови філогенетичних дендрограм використано пакет
програм Phylip 3.65. Для розрахунків термодинамічних показників
олігодуплексів використано програму Oligonucleotide Properties
Calculator Version 3.07.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що
молекулярно-генетичні маркери двох типів (ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркери),
які раніше вважалися селекційно-нейтральними, у тварин піддаються тиску
добору. Виявлено, що в ISSR-PCR- маркерів відповідь на дію добору
залежить від термодинамічних характеристик мікросателітних локусів, що
їх фланкують. Визначено найбільш інформативні ISSR-PCR-маркери для
внутрішньопороднього та внутрішньопопуляційного типування великої
рогатої худоби, а також для філогенетичного аналізу представників
підродини Bovinae.

Розроблено методику оцінки внутрішньопопуляційної генетичної мінливості
у ВРХ, яка ґрунтується на сімейному аналізі поліморфізму й успадкування
ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів. У рослин (дикі і культурні представники
підродини Phaseoleae) вперше виявлена залежність між рівнем поліморфізму
ISSR-PCR-маркерів і термодинамічними характеристиками мікросателітних
локусів, що їх фланкують. Показано, що ISSR-PCR-маркери, фланковані
мікросателітними послідовностями з високими термодинамічними
характе-ристиками є перспективними для визначення генотипів сої на
міжвидовому рівні, а з низькими термодинамічними показниками – для
оцінки генотипів сортів сої.

Розроблено новий підхід до оцінки і підбору мікросателітних праймерів
при вирішенні конкретних генетичних задач, що ґрунтується на
використанні композиційних і термо-динамічних характеристик
олігодуплексів між праймером і матричною ДНК.

Науково-практична цінність отриманих результатів. Проведено оцінку
впливу хронічного низькодозового радіактивного випромінювання на
модельну групу тварин для прогнозування його наслідків на види
сільськогосподарських тварин і людину. У відповідь на дію факторів
екологічного стресу виявлено переважне відтворення гетерозигот у
дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським поколінням F0 та
порушення в передачі від батьків до потомків алельних варіантів певних
ISSR-PCR- та IRAP-PC-локусів. Паспортизовано генотипи 13-ти сортів сої з
використанням ISSR-PCR-маркерів. Виявлено найперспективніші ISSR-PCR- та
IRAP-PCR-маркери для оцінки генетичної мінливості тварин і рослин на
різних таксономічних рівнях. Розроблено метод цілеспрямованого підбору
мікросателітних праймерів для вирішення ряду завдань
сільськогосподарської генетики з використанням ISSR-PCR-маркерів.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи
доповідалися й обговорювалися на засіданнях вченої ради Інституту
агроекологии і біотехнології в 2001-2005р.; на Міжнародній
науково-практичній конференції „Перспективы развития животноводства в
третьем тисячелетии” 2001р., м.Суми; на Міжнародній конференції ISAG
(International Society for Animal Genetics) 2002 р., м. Геттінген,
Німеччина; на VII з’їзді Українського товариства генетиків і
селекціонерів, 2002 р. Крим; на науково-практичній конференції „Новітні
методи досліджень біологічних об’єктів”, 2004 р., м. Біла Церква; на
міжнародній науковій конференції „Сучасний стан і перспективи розвитку
генетики сільськогосподарських тварин”, 2004 р., м. Київ.

Особистий внесок здобувача полягає в узагальненні літературних даних;
розробці програми й виконанні запланованих досліджень; аналізі,
інтерпретації, та підготовці результатів досліджень до публікацій і
апробації; розробці методики розрахунків; форму-люванні висновків.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових
праць, у тому числі 4 у фахових виданнях ВАК України.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 176
сторінках комп’ютерного тексту. Робота складається з вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів
досліджень та їх обговорення, висновків, рекомендацій виробництву,
заключення та списку використаної літератури, що містить 238 найменувань
переважно зарубіжних авторів. Дисертаційна робота містить 43 таблиці, 14
рисунків, 19 фотографій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить загальні характеристики повторюваної ДНК двох
класів – мікросателітної та транспозонної. Приділено увагу особливостям
розповсюдження цих послідовностей у різних геномах, їх походженню,
біологічному значенню та факторам, що визначають високий рівень їх
поліморфізму. Розглянуто галузі застосування цих повторюваних
послідовностей для отримання різних молекулярно-генетичних маркерів.
Узагальнені дані щодо використання ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів для
вирішення різних генетичних завдань.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом дослідження слугували рослини
4-х видів підродини Phaseoleae: Glycynia Max. (13 сортів), Glycynia
soya (4 дикі усурійські популяції), Glycynia tomentella, Glycynia
clandestine та тварини 4-x видів підродини Bovinae: Bison bonasus,
Bison bison, Bos frontalis та Bos taurus. Останній вид був
представлений зоопарковими тваринами анколє-ватусі та групою
голштинізованої великої рогатої худоби, яка відтворюється в умовах
хронічної дії низькодозового випромінювання (200 Ки/км2) в господарстві
Новошепеличі. Ця група представлена 8-ма родинами, три з яких походять
від корів, які перебували в цій місцевості ще до аварії 1986-го року, та
5 родин – від корів, що були завезені в господарство із поліських
відносно чистих (oAe o ¤ ¦ (?180 ккал/моль),
а також мікросателітними послідовностями із низьким рівнем
термостабільності (показник ентальпії ДНj180 ккал/моль), оскільки вони більшою мірою
дозволяють оцінити найближчу генетичну історію виду.

6. В групі великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної
дії низькодозового випромінювання, достовірно збільшується рівень
гетерозиготності у дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським
поколінням F0, що може свідчити про пристосувальне значення гетерозигот
у популяційно-генетичній відповіді на дію низькодозового іонізуючого
випромінювання.

7. З використанням ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів у дочірніх поколіннях
групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії
низькодозового випромінювання, не виявлено подій, які можна було б
розцінювати як мутаційні.

8. За паспортизації рослинних геномів критерії підбору мікросателітних
праймерів для аналізу генетичної мінливості у культурних і диких рослин
сої відрізняються: для визначення генотипів сортів сої доцільно
застосовувати ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з
низькими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДНj170 ккал/моль).

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для підтримання характеристик породи в популяціях великої рогатої
худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового
випромінювання, необхідно враховувати здатність їх генотипу до швидкої
адаптаційної перебудови вже на міжгенераційному рівні, що проявляється
в підвищенні рівня гетерозиготності і, отже, у зниженні рівня
спеціалізації породи.

2. При проведенні внутрішньопородньої та внутрішньопопуляційної оцінки
генотипів великої рогатої худоби доцільно застосовувати найбільш
поліморфні ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними повторами з
високими термодинамічними характеристиками, зокрема мікросателітними
субповторами (САС) та (АСС), що є чутливішими до дії факторів добору і
краще відображають найближчу генетичну історію виду.

3. Для визначення генотипів сортів сої рекомендується застосування
ISSR-PCR-маркерів, фланкованих мікросателітними повторами з низькими
термодинамічними характеристиками, зокрема із субповторами (AGC).

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тряпіцина Н.В., Глазко В.І. Використання методу ISSR-PCR для
оцінки мутаційних спектрів ссавців у зоні відчуження Чорнобильської
АЕС // Науковий вісник Національного аграрного університету. – Київ. –
2001. – Випуск . – С.175-182.

2. Тряпіцина Н.В., Глазко В.І. Використання методу IRAP-PCR для аналізу
генетичної структури великої рогатої худоби // Вісник Білоцерківського
державного аграрного університету: Збірник наукових праць. – Біла
Церква, 2005. – Вип. 31. – С. 168-175.

3.Тряпицина Н.В., Глазко В.И. Полиморфизм фрагментов ДНК,
фланкированных микросателлитными локусами (ISSR-PCR) у
воспроизводящегося в условиях низкодозового ионизирующего облучения
крупного рогатого скота // Цитология и генетика. – 2005. – №5. –
С.41-50.

4. Тряпицина Н.В., Городная А.В., Глазко В.И. Мутационная
изменчивость черно-пестрой породы крупного рогатого скота,
воспроизводящейся в 10-км зоне отчуждения Чернобыльской АЭС // Вісник
Сумського державного аграрного університету: В сб. перспективи розвитку
скотарства у третьому тисячолітті . – Суми. – 2001. – С.121-123
(визначені завдання, проведені дослідження, проаналізований матеріал,
написана стаття).

5. Глазко В.И., Тряпицына Н.В. Генетическая структура черно-пестрой
породы, воспроизводящейся в зоне ЧАЭС // В сб. “Труды 40-го сьезда по
радиационным исследованиям”. – Москва, 2001. – с.96.

6. Tryapitcyna N.V., Glazko V.I. Cattle polymorphism revealed using
ISSR-PCR at animals from 10km alienation zone of Chernobyl NPS // XXVIII
International Conference on Animal Genetics (ISAG).Gottingen-Germany. –
2002. – P.138.

АНОТАЦІЯ

Тряпіцина Н.В. Поліморфізм фрагментів ДНК та особливості геномної
організації деяких ссавців і дводольних рослин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських
наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика. – Інститут агроекології УААН,
Київ, 2006.

Роботу присвячено використанню ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів для оцінки
генетичної мінливості доместикованих та споріднених з ними диких видів
рослин і тварин. Виявлено залежність між рівнем поліморфізму
ISSR-PCR-маркерів і термодинамічними характеристиками мікросателітних
локусів, які їх фланкують. Визначено найперспективніші ISSR-PCR-маркери
для філогенетичного аналізу представників підродини Bovinae та для
оцінки генетичної мінливості великої рогатої худоби на
внутрішньопопуляційному рівні. Показано, що ISSR-PCR-маркери, фланковані
послідовностями з високими термодинамічними характеристиками, є
перспективними для визначення генотипів у дикої сої, а з низькими – у
сортів сої. В модельній групі великої рогатої худоби, яка відтворюється
в умовах хронічної дії низькодозового радіоактивного випромінювання за
використання ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів виявлено достовірне
збільшення гетерозиготності в дочірньому поколінні F2 по відношенню до
батьківського покоління F0, що свідчить про переважне відтворення
гетерозигот при популяційно-генетичній адаптації до нових факторів
добору. Не виявлено нових ампліфікаційних фрагментів, появу яких можна
було б розцінювати як мутаційну подію. Доведено, що ISSR-PCR- та
IRAP-PCR-маркери, які раніше вважалися селективно-нейтральними, у
великої рогатої худоби піддаються тиску добору.

Ключові слова: молекулярно-генетичні маркери, поліморфізм,
мікросателітні послідовності, транспозони, композиційні та
термодинамічні характеристики ДНК.

АННОТАЦИЯ

Тряпицына Н.В. Полиморфизм фрагментов ДНК и особенности геномной
организации некоторых млекопитающих и двудольных растений. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных
наук по специальности 03.00.15 – генетика.– Институт агроэкологии УААН,
Киев, 2006.

Диссертационная работа посвящена проблеме использования
молекулярно-генетических маркеров, получение которых основывается на
использовании различных классов повторяющейся ДНК, в частности
микросателлитной (ISSR-PCR-маркеры) и транспозонной (IRAP-PCR-маркеры)
для возможностей генотипирования сельскохозяйственных видов животных и
растений, а также для оценки генофондов близких к ним диких и условно
доместицированных видов. Впервые выявлена зависимость между уровнем
полиморфизма ISSR-PCR-маркеров и термодинамическими характеристиками
фланкирующих их микросателлитных локусов у растений (дикие и культурные
представители подсемейства Phaseoleae) и животных (дикие и
доместицированные представители подсемейства Bovinae). Выявлены маркеры,
наиболее перспективные для генетического типирования исследованных
животных и растений на различных таксономических уровнях. В модельной
группе крупного рогатого скота, воспроизводящейся в условиях
хронического действия низкодозового радиоактивного излучения с
использованием семейного анализа выявлены достоверные отклонения от
распределения в дочерних поколениях F1 и F2 родительских аллельных
вариантов ISSR-PCR- и IRAP-PCR-локусов, а также увеличение уровня
гетерозиготности в дочернем поколении F2 по отношению к родительскому
поколению F0, что может свидетельствовать о преимущественном
воспроизведении гетерозигот как результате популяционно-генетической
адаптации к действию новых факторов отбора. Обсуждается способность
генотипа крупного рогатого скота к быстрой адаптационной перестройке уже
на межгенерационном уровне. Показано, что молекулярно-генетические
маркеры 2-х типов (ISSR-PCR- и IRAP-PCR-маркеры), которые ранее
считались селективно-нейтральными, подвержены действию отбора.
Установлено, что у крупного рогатого скота действие отбора на ISSR-PCR-
маркеры зависит от композиционных и термодинамических характеристик
фланкирующих их микросателлитных локусов. В большей степени такому
действию подвержены ISSR-PCR- маркеры, фланкированные относительно
термостабильными микросателлитными последовательностями, а также
микросателлитными последовательностями с низкой термостабильностью.
Наиболее нейтральными к действию отбора являются ISSR-PCR-маркеры,
фланкированные микросателлитными последовательностями со средними
термодинамическими характеристиками, в частности с показателем
энтальпии, близкой к ДНj=161,8±0,084. Протипированы 13 сортов сои.
Показано, что ISSR-PCR-маркеры, фланкированные микросателлитными
последовательностями с высокими термодинамическими характеристиками
являются перспективными для типирования диких видов сои, а с низкими
термодинамическими показателями – для генотипирования сортов сои. Между
анализируемыми сортами рассчитаны генетические взаимоотношения с
использованием различных сочетаний ISSR-PCR- и IRAP-PCR-маркеров.
Разработан новый подход к оценке и подбору микросателлитных праймеров
при решении конкретных генетических задач, который основывается на
расчете композиционных и термодинамических характеристик олигодуплексов
между праймерной последовательностью и матричной ДНК. Выведены формулы,
позволяющие проводить предварительные оценки информативности
микросателлитных праймеров для их целенаправленного подбора.

Ключевые слова: молекулярно-генетические маркеры, полиморфизм,
микросателлитные последовательности, транспозоны, композиционные и
термодинамические характеристики ДНК

ABSTRACT

Nathaliya Tryapitcyna. DNA-fragments polymorphism and genome
organization peculiarities of some mammals and dicotyledonous plants. –
Manuscript.

The thesis for PhD degree in Agriculture by speciality 03.00.15 –
genetics- Institute of Agroecology of UAAS, Kyiv, 2006.

The thesis covers the problems of ISSR-PCR- and IRAP-PCR markers
utilization for genetic diversity quantification of plants and animals
domesticated and closely related wild species.

Correlation between ISSR-PCR-markers polymorphism level and
thermodynamic characteristics of its microsatellite flank loci was
found. The most suitable ISSR-PCR-markers for cattle intrapopulational
genotyping as well as for phylogenetic studies of subfamily Bovinae
representatives were selected. Fact, that the ISSR-PCR-markers flanked
by the microsatellite loci with high thermodynamic characteristics are
more suitable for wild soybean genotyping and with low one – for
soybean cultivars quantification were shown. In model group of cattle
reproducing under of low irradiation dose influence conditions the
heterozygozity increasing in F2 generation in comparison with parental
F0 generation were found. It is probably that the heterozygous animals
have advantages for reproduction under new selection-factor pressure. It
was not revealed new amplicons, that may be evaluated as mutational
event. The non-neutrality of the ISSR-PCR- and IRAP-PCR-markers, which
were considered to be neutral for the selection, was demonstrated for
the cattle.

Key words: molecular-genetic markers, polymorphism, microsatellite
sequences, transposones, compositional and thermodynamic DNA
characteristics

PAGE 1

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020