МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ПРИКАРПАТСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ВАСИЛЯ СТЕФАНИКА
Туранська Світлана Петрівна
УДК 541.183
Дослідження міжфазних взаємодій у системі вода-клітини-білок-кремнезем
методами 1н ямр спектроскопії
01.04.18 – фізика і хімія поверхні
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Івано-Франківськ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті хімії поверхні НАН України.
Науковий керівник: доктор хімічних наук
Туров Володимир Всеволодович,
Інститут хімії поверхні НАН
України,
заступник директора з наукової
роботи,
м. Київ
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Тьортих Валентин Анатолійович,
Інститут хімії поверхні НАН
України,
головний науковий співробітник,
м. Київ
доктор хімічних наук, професор
Томашик Василь Миколайович,
Інститут фізики напівпровідників
НАН України,
вчений секретар,
м. Київ
Провідна установа: Інститут колоїдної хімії та хімії води
ім. А. В. Думанського НАН
України,
м. Київ
Захист відбудеться 29 червня 2006 року о 12 год. 00 хв. на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 20.051.03 при Прикарпатському
національному університеті імені Василя Стефаника Міністерства освіти і
науки України за адресою: вул. Шевченка, 79, м. Івано-Франківськ, 76025.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Прикарпатського
національного університету імені Василя Стефаника (вул. Шевченка, 79, м.
Івано-Франківськ, 76025).
Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою, просимо
надсилати за адресою: вченому секретарю спеціалізованої вченої ради К
20.051.03 при Прикарпатському національному університеті, вул. Шевченка,
57, м. Івано-Франківськ, Україна, 76025.
Автореферат розісланий 25 травня 2006 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради К 20.051.03
Кланічка В.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження процесів взаємодії клітин з поверхнею
твердого тіла є важливими при вирішенні багатьох біотехнологічних задач,
зокрема, для одержання продуктів клітинного біосинтезу. Новітні
адсорбенти для вилучення мікроорганізмів знаходять широке застосування
як при очищенні стічних вод, так і для детоксикації організму. Взаємодія
клітин з твердою поверхнею може бути небажаною і призводити до серйозних
руйнівних наслідків через корозію матеріалів або їх деструкцію. Вивчення
взаємодії синтетичних і природних матеріалів з живими клітинами з метою
створення штучних органів є актуальними для багатьох галузей медицини:
ортопедії, офтальмології, стоматології, кардіології, імунології тощо.
Відомо, що імплантація ряду матеріалів у живий організм може викликати
такі небезпечні реакції, як адсорбцію білків, адгезію клітин, зсідання
крові.
Біологічна реакція на імплантат, або адсорбент залежить від міжфазної
енергії матеріалів і клітин, яка обумовлює структуру води поблизу
поверхні. Локальні властивості приповерхневих шарів води, у свою чергу,
безпосередньо визначають характер взаємодії клітина-поверхня. Тому
дослідження структури води поблизу поверхні дозволить характеризувати
поверхневі властивості матеріалу і передбачити біологічну відповідь на
нього. Величини міжфазної енергії клітина-поверхня і енергії взаємодії
клітин з водою можуть свідчити про напрямок і силу взаємодії клітин з
твердою поверхнею, тому наукове обгрунтування надійного неруйнівного
методу для визначення параметрів міжфазних взаємодій у системі клітини –
вода – тверда поверхня є необхідним при створенні матеріалів технічного,
біотехнологічного, медичного призначення (оцінка адгезивної здатності,
або резистентності по відношенню до клітин; встановлення напрямку
модуляції поверхневих властивостей шляхом, наприклад, модифікації їх
поверхні синтетичними полімерами чи високомолекулярними речовинами
природного походження; розробка сорбентів для розділення і очищення
клітинного матеріалу, видалення забруднювачів, важких металів,
органічних речовин; стабілізація систем доставки лікарських препаратів і
продовження терміну їх циркуляції у кров’яному руслі, тощо).
Ці взаємодії часто відбуваються у складних системах, які містять, окрім
води і низькомолекулярних речовин, високомолекулярні сполуки; при
контакті біоматеріалу з внутрішнім середовищем організму, що має високий
вміст білку, до взаємодій також залучатимуться молекули ліпопротеїдів,
глікопротеїдів тощо.
Загальновизнаною перевагою неорганічних дисперсних носіїв порівняно з
органічними матеріалами є їх висока механічна міцність,
хімічна інертність, стійкість до біологічної деградації і відносно
низька вартість. Зокрема, широко використовуються носії на основі
кремнезему. Їх перевагами є можливість варіювання в широких межах
пористості і текстури, а також досить сильна адсорбційна здатність по
відношенню до білків і клітин. Застосування кремнезему в медицині
засноване на використанні таких його якостей, як висока дисперсність,
розвинена і доступна поверхня, можливість модифікації поверхні
різноманітними сполуками, висока хімічна чистота, фізіологічна
біосумісність.
З наведеного вище можна зробити висновок, що дослідження
фізико-хімічних закономірностей міжфазних взаємодій у системах, що
містять воду, живі клітини, молекули білку та високодисперсний
кремнезем, є актуальними з точки зору як фундаментальної науки, так і
розробки та практичного впровадження новітніх біотехнологій і матеріалів
широкого функціонального призначення.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася в рамках відомчої тематики Інституту хімії поверхні НАН
України: “Теоретичні дослідження і розробка лікарських композитів з
сорбційним механізмом дії і регульованою фармакодинамікою” (№ держ.
реєстрації 0199U002299), “Закономірності адсорбційної взаємодії та
хімічних перетворень на поверхні дисперсних оксидів в суспензіях
біоактивних молекул, полімерів, клітин та мікроорганізмів” (№ держ.
реєстрації 0103U006286).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення основних
фізико-хімічних закономірностей і визначення параметрів міжфазних
взаємодій у системах, що містять воду, живі клітини, молекули білку та
високодисперсний кремнезем.
Задачі роботи включали:
підбір клітин, взаємодія яких у водному середовищі може бути вивчена в
експериментах, заснованих на методі виморожування рідкої фази;
дослідження впливу концентрації високодисперсного кремнезему (ВДК) на
життєздатність клітинної культури;
визначення характеристик шарів зв’язаної води в системах клітини-вода,
клітини-вода-кремнезем і клітини-вода-кремнезем-білок;
визначення енергії міжклітинних взаємодій у водному середовищі;
визначення сил адгезії та енергії взаємодії клітин з водою і ВДК;
дослідження впливу ВДК на концентрацію зв’язаної води та фазовий стан
модельних систем, що містять живі клітини і білок;
дослідження впливу аглютинації клітин з ВДК на параметри міжфазної
взаємодії клітини-вода;
оцінка структури води в клітинах з різним її вмістом;
дослідження особливостей будови граничних шарів води на межі розділу фаз
з частинками кремнезему;
створення моделей, що пояснюють механізми взаємодії в досліджуваних
багатокомпонентних системах.
Об’єкти дослідження: системи, що містять воду, дріжджові клітини
Saccharomyces cerevisiae, високодисперсний кремнезем, молекули білку.
Предмет дослідження: використання методу 1Н ЯМР спектроскопії для
характеристики взаємодії клітин з молекулами води, білку та поверхнею
дисперсних оксидів.
Методи дослідження: 1Н ЯМР спектроскопія в поєднанні з методикою
виморожування рідкої фази; оптична мікроскопія із застосуванням
мікробіологічних методів статистики; растрова електронна мікроскопія;
атомно-силова наноскопія; спектрофотометрія; цитохімічні методи;
динамічний метод контролю метаболічної активності.
Наукова новизна одержаних результатів. В дисертації вперше:
показано можливість застосування методу 1Н ЯМР спектроскопії для
дослідження міжфазних взаємодій у водних середовищах, що містять живі
клітини;
на основі експериментальних даних про зміну енергетичних характеристик
шарів зв’язаної води визначено енергію міжклітинної взаємодії, сили і
енергію взаємодії клітин з водою і поверхнею твердого тіла в
багатокомпонентних системах. Показано, що максимальна енергія взаємодії
дріжджових клітин з поверхнею дисперсного кремнезему становить 130 Дж/г;
визначено силу адгезії на межі розділу фаз клітини-вода як функцію
відстані до поверхні клітин. Показано, що сили адгезії діють на
відстанях, сумірних з лінійними розмірами клітин, і величина сил адгезії
для водних суспензій клітин майже на два порядки перевищує сили адгезії
в колоїдних розчинах дисперсних оксидів;
у системі клітини – вода виявлено фазовий перехід (ФП) типу золь-гель
при концентрації клітинної маси 10-12 % (мас.). Присутність ВДК в
системі призводить до зниження концентраційного порогу вказаного ФП.
Так, при концентрації SiO2 5 % ФП спостерігається при концентрації
клітинної маси 2 %;
досліджено вплив дисперсного кремнезему на концентрацію зв’язаної води в
суспензіях, що містять клітини. Показано, що наявність ВДК призводить до
зменшення концентрації незамерзаючої води в системі, мінімальні значення
якої спостерігаються при концентраціях клітинної маси 2 і 25 % мас.;
одержано нові експериментальні дані про вплив дисперсного кремнезему на
фазовий стан водних суспензій, що містять клітини і білок.
Експериментальну залежність міжфазної енергії системи від концентрації
SiO2 пояснено руйнуванням гелеподібної фази клітини – білок і
формуванням замість неї нової фази клітини – білок – кремнезем – вода;
проаналізовано моделі, створені на основі теоретичних розрахунків і
експериментальних вимірювань хімічних зсувів води поблизу поверхні SiO2,
які свідчать, що приповерхневі молекули води є менш асоційованими
порівняно з об’ємними;
показано, що для частково зневоднених дріжджових клітин і гідратованих
кремнеземів, які містять на поверхні щеплені триметилсилільні групи,
виявлено наявність нової, незвичної форми зв’язаної води, особливістю
якої є дуже мала величина хімічного зсуву протонів, що співпадає з
хімічним зсувом молекул води, яка не бере участі в утворенні водневих
зв’язків в якості протонодонора. У відносно вузькому діапазоні зміни
гідратованості дріжджових клітин (250-380 мг/г) стан зв’язаної води
підлягає значним змінам, у результаті яких вода переходить із слабко
асоційованого водневими зв’язками у сильно асоційований стан.
Практичне значення дисертації. Показано можливість застосування нової
неруйнівної методики для визначення параметрів взаємодії елементів у
багатокомпонентних системах, що містять воду, живі клітини, молекули
білку і високодисперсні оксиди. Результати роботи можуть бути
реалізовані при дослідженні систем типу клітини-вода-тверда поверхня і
створенні матеріалів медичного чи біотехнологічного призначення,
зокрема, для тестування ефективності нових адсорбентів та біосумісних
матеріалів. Визначення вільної енергії Гіббса, структури приповерхневих
шарів води, сили і енергії взаємодії клітин з водою та твердою поверхнею
методом 1Н ЯМР спектроскопії дозволить кількісно оцінити біологічну
реакцію живих клітин на контактуючий матеріал (адсорбент, імплантат
тощо) без істотного порушення метаболізму і визначити можливі шляхи
модифікації його поверхні.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено пошук і аналіз
літературних джерел, підібрано методику визначення життєздатності
дріжджових клітин у водних суспензіях, розроблено методику для
визначення життєздатності клітин у присутності кремнезему, виконано
дослідження адсорбції молекул білку на клітинах, узагальнено матеріали
дисертації, написано її текст і автореферат. Спільно з науковим
керівником д.х.н. В.В. Туровим одержано та інтерпретовано основні
експериментальні результати, з д.х.н. В.М. Гуньком проаналізовані
розрахункові дані та модельні уявлення щодо структури кластерів води,
зв’язаної з поверхнею ВДК. Аналіз результатів дослідження адсорбції
білку на клітинах виконано спільно з к.х.н. В.М. Барвінченко. Спільно з
к.х.н. В. І. Зарко та Є. М. Пахловим проведено електрофізичні
дослідження, О. В. Шульгою виконано дослідження методами атомно-силової
наноскопії, к.х.н. В.М. Богатирьовим та Р. Лєбодою здійснено адсорбційні
вимірювання. Обговорення результатів проведено з академіком НАН України
О.О. Чуйком.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені та
обговорені на VI Українсько-Польському симпозиумі “Theoretical and
experimental studies of interfacial phenomena and their technological
applications” (Одеса, 2001), молодіжній науковій конференції “Оксидні
функціональні матеріали” (Київ, 2002), міжнародній науково-практичній
конференції “Структурна релаксація у твердих тілах” (Вінниця, 2003), V
Українській конференції молодих вчених з високомолекулярних сполук
(Київ, 2003), всеукраїнській конференції молодих вчених з актуальних
питань хімії (Київ, 2003), наукових семінарах відділу біомедичних
проблем поверхні ІХП НАН України.
Публікації. Основний зміст роботи викладено в 11 публікаціях, серед яких
7 статей і тези 4 доповідей на конференціях.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури (розділ 1), методичної частини (розділ 2), у розділах 3-6
викладені одержані експериментальні дані і запропонована їх
інтерпретація, висновків. Роботу викладено на 168 сторінках друкованого
тексту, який містить 47 рисунків, 12 таблиць та список літератури зі 189
джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтовано актуальність теми дисертації, викладено мету і
задачі роботи, наукову новизну та практичне значення одержаних
результатів.
У першому розділі (огляд літератури) узагальнено результати досліджень
взаємодій типу клітина-поверхня, наведено механізми і фактори, що
впливають на процес, проаналізовано розроблені теорії для їх опису і
підходи до контролю, визначення параметрів міжфазних взаємодій на основі
теоретичних моделей і експериментальних методів. Приводяться дані щодо
будови і фізичних властивостей зв’язаної води в гідратних оболонках
клітин, білкових молекул і кремнезему. Розглядаються можливості існуючих
на даний час методів прямого вимірювання поверхневих сил з точки зору їх
застосування для дослідження взаємодій у системах, що містять живі
клітини. Розглядаються методики ЯМР спектроскопії для дослідження
міжмолекулярних взаємодій. Аналіз літературних даних свідчить, що досі
не розроблено надійного неруйнівного методу для виміру параметрів
міжфазних взаємодій за участю живих клітин, і результати нечисельних
робіт по визначенню сили, енергії і роботи адгезії потребують
експериментальної перевірки.
У другому розділі наведено дані щодо об’єктів і методів досліджень,
описано фізіолого-біохімічні особливості дріжджових клітин, їх
поверхневі властивості, адсорбційні властивості поверхні диоксиду
кремнію по відношенню до клітин. Описано методики, що застосовувалися
при виконанні роботи.
Досягнення мети роботи та виконання задач дослідження здійснено на
основі сучасних експериментальних методів і теоретичних розрахунків. В
якості основного методу дослідження застосовували метод 1Н ЯМР
спектроскопії в поєднанні з методикою виморожування рідкої фази. Цей
метод дозволяє за величиною хімічного зсуву молекул зв’язаної води
оцінювати її структуру, а за зміною інтенсивності сигналу ЯМР у процесах
заморожування-відтанення – визначати енергію взаємодії в системах
клітини-вода, кремнезем-вода, біополімер-вода та їх композиціях. Спектри
знімалися на ЯМР спектрометрах високої роздільної здатності з приставкою
для терморегуляції і електронним інтегратором спектрів (Bruker WP-100 SY
з робочою частотою 100 МГц і смугою пропущення 50 кГц і Varian 400
Mercury з робочою частотою 400 МГц). Вимірювання хімічного зсуву води в
клітинах і на межі розділу фаз з кремнеземом проводили на повітрі з
використанням зовнішнього стандарту (CHCl3, ? = 7.26 м.д.) або в
середовищі дейтерованого хлороформу. Життєздатність клітин визначали
цитохімічним методом і за допомогою запропонованої автором динамічної
методики реєстрації СО2, виділеного клітинами в процесі анаеробного
дихання. Візуалізацію клітин здійснювали методами оптичної мікроскопії
(Мікмед-1) із застосуванням мікробіологічних методів статистики,
електронної скануючої (JSM-35, Jeol) і атомно-силової мікроскопії
(Nanoscope III, Digital Instruments). Величину адсорбції білку на
клітинах визначали спектральним фотометричним методом (Specord M 40,
Carl Zeiss, Jena). Характеристики розчинів контролювали методами
рН-метрії. Екстинкцію розчинів білку визначали за допомогою біуретової
реакції.
Розділ 3 присвячений дослідженням системи клітини-вода, визначенню
характеристик шарів зв’язаної води при заморожуванні клітин у водному
середовищі і розрахунку на їх основі міжфазної енергії клітини-вода,
енергії міжклітинної взаємодії і сил адгезії (сил взаємодії клітин з
водою).
Показник життєздатності дріжджів у процесах заморожування-відтавання
становив ~ 90 %. Життєздатність клітин в експериментах по виморожуванню
рідкої фази становила ~ 70 %.
Оw відповідно), максимальні величини зниження вільної енергії води,
викликаного адсорбцією, в шарах сильно- і слабкозв’язаної води ((Gs і
(Gw), а також величини міжфазної енергії клітини – вода ((S).
Оext = 100 – СДР .
Оext > 90 % мас. (концентровані і розведені клітинні
Рис. 1. Залежність сумарної величини міжфазної енергії системи клітини –
вода від концентрації клітин у суспензії (а) і зовніклітинної міжфазної
енергії від концентрації зовніклітинної води (б).
Оext) дозволяє припустити існування в колоїдній системі клітини – вода
фазового переходу, аналогічного переходу типу золь-гель. Тоді перша з
характеристичних величин (= 44 Дж/г) визначає зміну міжфазної енергії,
що відбувається при розведенні гелеподібної клітинної суспензії до
зникнення вторинної структури. Друга характеристична величина (?Smax =
108 Дж/г) визначає руйнування малих клітинних агрегатів у розведених
суспензіях. Зміна міжфазної енергії ДгSext = 108 Дж/г визначає енергію
міжклітинної взаємодії у клітинній масі пресованих дріжджів.
Наявність фазового переходу при варіюванні концентрації клітин у
суспензії добре реєструється також на залежностях концентрації сильно- і
слабкозв’язаної води від концентрації дріжджової культури в суспензії
(рис. 2).
Відповідно до даних рис. 1 і 2 можна вважати, що при концентраціях
дріжджової культури СДР ? 10 % мас. клітинна суспензія утворює колоїдний
розчин, в якому міжклітинні взаємодії незначно впливають на поверхню
міжфазної взаємодії клітини-вода. Для цього концентраційного інтервалу
були розраховані радіальні залежності сил адгезії (рис. 3).
Рис. 2. Залежність концентрації сильно- і слабкозв’язаної води від
концентрації дріжджової культури в суспензії: 1 – сильнозв’язана;
2 – слабкозв’язана вода.
Рис. 3. Радіальні залежності сил адгезії від відстані до поверхні
клітин у
водних суспензіях хлібопекарських дріжджів. Концентрація клітин:
1 – 3; 2 – 4,5; 3 – 6; 4 – 10 % мас.
Встановлено, що величина сил адгезії для клітинних суспензій майже на 2
порядки перевищує сили адгезії в колоїдних суспензіях дисперсних
оксидів. Сили адгезії діють на відстанях, що перевищують лінійні розміри
клітин. Зі зменшенням концентрації суспензій величина сил адгезії
зростає. Цей ефект обумовлений зменшенням імовірності міжклітинних
взаємодій.
Розділ 4 присвячений дослідженню системи клітини – вода – кремнезем,
опису процесів гідратації і дегідратації, які відбуваються в заморожених
водних суспензіях живих клітин, що містять добавки дисперсного
кремнезему, і змін у величині міжфазної енергії, які мають місце при
взаємодії клітин з високодисперсним кремнеземом.
Дріжджові клітини виявилися досить стійкими і до присутності у водних
суспензіях ВДК. Наявність кремнезему призводила навіть до деякого
покращення процесів життєдіяльності клітин.
За температурними залежностями зміни сигналів зв’язаної води були
розраховані концентрації сильно- і слабкозв’язаної води, максимальні
величини зниження вільної енергії води в шарах сильно- і слабкозв’язаної
води і величини міжфазної енергії, усереднені для води, зв’язаної на
поверхні і всередині клітин і на межі розділу фаз з частинками
кремнезему.
OДР-100%*CДР/100, то зміна концентрації незамерзаючої води, пов’язана з
присутністю кремнезему, визначається за співвідношенням:
OДР-100%*CДР/100.
O стає позитивною.
На рис. 4, а зображені залежності величини міжфазної енергії від
концентрації клітин у потрійній системі клітини – вода – кремнезем.
Для того щоб визначити, як поверхня кремнезему впливає на величину
міжфазної енергії клітини – вода, можна порівняти дані, наведені на рис.
4, а, з відповідною залежністю для бінарної системи (водна суспензія
клітин) (рис. 1, а). Розходження у величинах гS при фіксованій
концентрації клітинної маси в суспензії визначають зміну вільної енергії
в результаті взаємодії клітини – поверхня (рис. 4, б).
З рис. 4 випливає, що присутність кремнезему призводить до різкого
зменшення міжфазної енергії клітини – вода. Це свідчить про інтенсивне
зв’язування клітин з поверхнею кремнезему. Особливо велике розходження у
величинах ?S бінарних і потрійних суспензій спостерігається при малих
концентраціях клітинної маси. На рис. 1, а ділянка залежності ?S(СДР)
ліворуч від зламу відповідає слабкій міжклітинній взаємодії (гелеподібна
фаза не утворюється). Присутність у такій суспензії частинок дисперсного
кремнезему призводить до зменшення величини ?S на 130 Дж/г. Ця величина
визначає максимальну енергію взаємодії клітин з поверхнею кремнезему.
Рис. 4. Вплив концентрації клітинної маси на величину міжфазної енергії
в системі, що містить воду, клітини і кремнезем (а) та на зміну вільної
енергії, обумовлену присутністю високодисперсного SiO2 (5 % мас.) (б).
При більших концентраціях, завдяки сильним міжклітинним взаємодіям,
суспензія клітин утворює гелеподібну фазу. Введення в таку суспензію 5 %
мас. дисперсного кремнезему призводить лише до незначної зміни міжфазної
енергії. Очевидно, у цьому концентраційному інтервалі більша частина
клітин утворює зв’язки клітина – клітина і не бере участі в формуванні
комплексів клітина – поверхня. Найбільш імовірно, що злам на залежності
?S(СДР) при СДР = 2 % мас. у потрійних суспензіях (рис. 4, а), також як
і на рис. 1, а в бінарних, обумовлений фазовим переходом, що
відбувається у клітинній суспензії при її концентруванні.
1 % мас. (рис. 5).
Рис. 5. Залежність зміни міжфазної енергії від концентрації кремнезему
для водних суспензій, що містять 12,5 % клітинної маси.
) на рис. 5 можна трактувати з точки зору формування в потрійній
системі, що містить частинки високодисперсного SiО2 і дріжджові клітини,
нового фазового стану, в якому частинки кремнезему сприяють міжклітинним
взаємодіям. Цей стан характеризується співвідношенням концентрацій
клітин і SiО2 12:1. Для нього спостерігається в 2 рази менша
гідратованість клітин, ніж у бінарній системі. Збільшення концентрації
кремнезему вище стехіометричного співвідношення не впливає на стан
суспензії.
У розділі 5 досліджено систему клітини – вода – кремнезем – білок. З
метою з’ясування механізмів дії кремнезему на клітини вивчали вплив ВДК
на фазовий стан модельних суспензій, що містять клітини і молекули
білку, і визначали особливості будови граничних шарів води поблизу
поверхні частинок SiO2.
$
A
e
–
”
$
R
A
?8
Oe
L N E uoooooeeeeeeeeeeeeTHeeeeee
Oe
??????????
??
jo
??????
?????????Т?Т?у (рис. 6). При цьому гелеподібна фаза клітини – білок була
частково зруйнована. Передбачалося, що в таких умовах система буде
найбільш чутливою до фазових змін, індукованих частинками SiO2.
Рис. 6. Вплив дисперсного кремнезему (А-380) на міжфазну енергію в
суспензіях, що містять 10 % мас. дріжджів і 2,5 % мас. желатину.
= 1,5 % (мас.) гелеподібної фази клітини – білок (за участю молекул
води) і формування замість неї нової фази клітини – білок -кремнезем –
вода. Очевидно, цей ефект відображає загальну закономірність взаємодії
кремнезему з водними суспензіями, що містять клітини і білкові молекули.
До тих пір, поки молекули білку, взаємодіючи з частинками SiО2, можуть
екранувати клітини від прямого контакту з кремнеземом, негативного
впливу на клітини не відбувається. Існує якась критична концентрація
ВДК, при перевищенні якої можливе порушення клітинного метаболізму,
наприклад, у результаті зв’язування мембранних білків і блокування
каналів, що призводить до загибелі клітин.
Проведені дослідження по визначенню екстинкції розчинів білку після
експозиції з клітинами при різних значенях рН і концентрації іонів
полівалентних металів показали, що статистично достовірних величин
адсорбції білку на клітинах не спостерігалося, хоча в цілому у більшості
випадків оптична густина білкових розчинів зменшувалася після витримки
з клітинами. Можливо, при адсорбції незначної кількості білку
перекриваються центри, доступні для зв’язування, і, таким чином,
адсорбція декількох молекул може перешкоджати зв’язуванню сотень інших.
Стимулюючий вплив ВДК на клітини можна очікувати в тому випадку, коли не
відбувається руйнування колоїдної фази клітини – білок і частинки
кремнезему просторово віддалені від клітинних мембран. Механізм
стимулюючого впливу SiO2 на клітини не з’ясований; не виключено, що він
може залежати від будови граничних шарів рідини поблизу поверхні
частинок ВДК. Експериментальні виміри хімічних зсувів і результати
квантово-хімічних розрахунків свідчать про те, що особливістю
адсорбційного шару води на межі розділу фаз з кремнеземом є низька (у
порівнянні з об’ємною водою) асоційованість адсорбованих молекул.
Порушення упорядкованої структури води поблизу поверхні кремнезему може
бути пов’язане з механізмом, що обумовлює стимулюючий вплив кремнезему
на клітини.
У розділі 6 вивчено особливості будови водних асоціатів у частково
зневоднених клітинах. За величиною хімічного зсуву протонів у молекулах
зв’язаної води проведено оцінку структури внутрішньоклітинної води для
дріжджів з різним ступенем дегідратації. Порівняння результатів,
отриманих для клітин і частково гідрофобізованих кремнеземів, свідчить
про формування поблизу гідрофобних ділянок поверхні кластерів води, що
не бере участі в утворенні водневих зв’язків у якості протонодонора.
Для вивчення стану зв’язаної води в мембранах методами спектроскопії
ЯМР, її частка повинна бути по можливості збільшена. Тому для
експериментів використовувалися зневоднені клітини, з яких спеціальними
методами сушки було видалено значну частину внутрішньоклітинної води.
Оскільки при дегідратації з клітин у першу чергу видаляється об’ємна і
слабкозв’язана вода, що входить до складу внутрішньоклітинної рідини, зі
зменшенням концентрації води в клітинах зростає частка води, зв’язаної в
клітинних мембранах. При з’ясуванні особливостей будови води при її
контакті з гідрофобними ділянками поверхні аналогом біфільних клітинних
структур може служити кремнезем, поверхня якого модифікована хімічно
щепленими алкільними групами. Показано, що спектри зв’язаної води в
клітинах являють собою широкий одиничний сигнал, максимум якого має
хімічний зсув 1-2 м.д. при низькому вмісті води і 3-5 м.д. при її
високому вмісті. При зниженні температури ширина сигналу зростає, і
хімічний зсув може бути визначений лише з великою похибкою.
O. Одержана величина хімічного зсуву води в частково дегідратованих
клітинах близька до хімічного зсуву молекул, які не беруть участі в
утворенні водневозв’язаних комплексів або формують водневозв’язані
асоціати в якості електронодонора. При збільшенні вмісту води в клітинах
до 320 мг/г інтенсивність сигналу в сильному магнітному полі помітно
знижується (сигнал 1), проте одночасно з’являється значно ширший сигнал
води з хімічним зсувом д = 5 м.д. (сигнал 2). У зразку, що містить 400
мг/г води, інтенсивність сигналу 1 зменшується ще більше.
O = 320 мг/г, коли в спектрах 1Н ЯМР води, зв’язаної з дріжджовими
клітинами, з’являється сигнал сильно асоційованої води (д = 5 м.д.).
O
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
