.

Етіотропна, патогенетична та реабілітаційна терапія хворих на постгонорейні ураження сечостатевого тракту та інші урогенітальні інфекції, ускладне

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
111 3120
Скачать документ

К И Ї В С Ь К И Й Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й У Н І В Е Р С И Т Е Т

імені Т А Р А С А Ш Е В Ч Е Н К А

ГРИНЮК ІРИНА ІВАНІВНА

УДК 577+612.438.014.481+612.438.014.46

Структурний стан хроматину тимоцитів за дії іонізуючої радіації та
пероксиду водню

03. 00. 04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Виноградова Руфіна Петрівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу науково-інформаційних

та патентно-ліцензійних досліджень

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Сиволоб Андрій Володимирович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

доцент кафедри загальної та

молекулярної генетики

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться ”12” грудня 2005 р. о 1000 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.
Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ,
вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий ”_11_” _листопада_ 2005 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради
Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зміни конформації хроматину, його
конденсація-деконденсація відіграють важливу роль у забезпеченні таких
процесів, як транскрипція, реплікація, репарація ушкоджень ДНК,
формування хромосом. Гетерогенність упаковки ДНК у складі релаксованого
хроматину не лише відіграє важливу роль у забезпеченні адекватного
функціонування генетичного апарату, але й визначає чутливість ДНК до дії
стресорних та ушкоджувальних чинників. На сьогодні інтенсивно
досліджуються механізми апоптозу, який реалізується у випадку загрози
порушення стабільності геному клітин та забезпечує вибіркове видалення
таких клітин. За апоптозу, як і за мітозу, має місце конденсація
хроматину, проте вона супроводжується міжнуклеосомною фрагментацією ДНК
у клітинах, що гинуть (Roy, 1997; Hengarten, 2000). Особливості
структурної перебудови хроматину за дії апоптогенних чинників, зокрема,
стадія так званої „крупномасштабної” фрагментації ДНК, що передує
міжнуклеосомній, залишаються недостатньо дослідженими.

Зручним об’єктом для дослідження структурних ушкоджень хроматину є
тимоцити – неповністю диференційовані клітини, які характеризуються
вищою, порівняно з іншими клітинами, нестабільністю генома та нижчою
активністю систем репарації однониткових розривів ДНК. Морфологічний
контроль стану тимоцитів in vitro дозволяє виявити клітини з
фрагментованим хроматином та апоптичні тільця, тоді як за yмов in vivo
вони швидко поглинаються фагоцитуючими клітинами.

Для експериментального моделювання апоптозу тимоцитів використовують
іонізуючу радіацію, головною мішенню якої є ДНК та пероксид водню –
індуктор окисного стресу, яким супроводжується розвиток багатьох
патологічних станів. Відомо, що у термін 3 – 8 год після після дії
іонізуючої радіації у тимоцитах відбувається накопичення міжнуклеосомних
фрагментів ДНК пропорційно до дози 1 – 6 Гр (Meyen et al, 1993;
Zhivotovsky et al, 1993). Вплив пероксиду водню на життєздатність
тимоцитів та клітин інших типів досліджено значно меншою мірою. Ефекти
пероксиду водню значною мірою залежать від його концентрації – за
присутності Н2О2 у концентраціях, що первищували 1 мМ, спостерігається
некротична загибель клітин, тоді як у діапазоні концентрацій 30 – 200
мкМ Н2О2 в тимоцитах виявляються ознаки апоптозу (Oyama et al, 1999;
Dahm-Daphi, 2000).

Пошкодження хроматину за дії апоптогенних чинників обумовлене не тільки
структурно-функціональними порушеннями у ядрі, але й активацією у
цитоплазмі сигнальних каскадів, компонентами яких є активні форми кисню,
іони кальцію, ендонуклеази, каспази, цитохром с. У клітинах різних типів
(В- та Т-лімфоцитах, клітинах мієлоїдного ряду) виявлено взаємозв’язок
між конденсацією та фрагментацією ДНК у ядрі та порушенням
структурно-функціонального стану мітохондрій за дії різних фізіологічних
та фармакологічних індукторів апоптозу (глюкокортикоїди, етопозид,
церамід та ін) (Бра и др., 2005; Zamzami et al, 1995; Bernardi et al,
1999; Orrenius, 2004). Дослідження причинно-наслідкових зв’язків та
виявлення відмінних та спільних ланок у порушенні структурної
організації хроматину за дії чинників різної природи є важливим для
розуміння загальних закономірностей механізмів загибелі та адаптації
клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
згідно плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного
факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у
рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку
біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ державної реєстрації
0101U002291).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльна оцінка
параметрів, які характеризують структурний стан хроматину тимоцитів на
ранньому етапі після дії іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр та 0,1 мМ
пероксиду водню. Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

– оцінити морфологічний стан ядер тимоцитів після дії радіації та
пероксиду водню;

– визначити параметри термічної денатурації хроматину тимоцитів у
контролі та після дії досліджуваних чинників;

– дослідити вміст гістонів у хроматині, виділеному з тимоцитів, після
дії радіації та Н2О2;

– оцінити вплив ? – токоферолу, хлороквіну, сперміну та циклоспорину А
на фрагментацію ДНК у тимоцитах за дії апоптогенних чинників;

– дослідити вплив позаядерних компонентів, виділених з опромінених та
оброблених Н2О2 тимоцитів, на фрагментацію ДНК з використанням
безклітинної системи.

Об’єкт дослідження – порушення структури хроматину у тимоцитах за дії
радіації та пероксиду водню.

Предмет дослідження – морфологічні ознаки апоптозу, термічна денатурація
хроматину, вміст гістонів у хроматині, фрагментація ДНК, безклітинна
система, компонентами якої є ядра, мітохондрії або груба розчинна
фракція.

Методи дослідження – світлова та флуоресцентна мікроскопія, електрофорез
білків, спектрофотометрична оцінка вмісту низькомолекулярних фрагментів
ДНК, термічна денатурація хроматину, оцінка неспецифічної проникності
мітохондріальної мембрани.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне
дослідження структурного стану хроматину в ізольованих тимоцитах за дії
іонізуючою радіації у дозі 4,5 Гр та 0,1 мМ пероксиду водню, встановлено
відмінності у динаміці та характері його порушень. На основі параметрів
термоденатурації оцінено спектри ДНК-білкових взаємодій та їх зміни на
різних рівнях структурної організації хроматину за дії досліджуваних
чинників. Показано зниження вмісту гістонів Н2В та Н1 у хроматині за
інкубації ядер опромінених тимоцитів. Виявлено специфічне зниження
вмісту гістону у субфракції Н1b у ядрах клітин за дії Н2О2. Показано, що
циклоспорин А значно пригнічує фрагментацію ДНК у тимоцитах, підданих
дії Н2О2. Вперше продемонстровано, що внесення у безклітинну систему
мітохондрій або постмітохондріального супернатанту, виділених з
тимоцитів на різних етапах після дії радіації та пероксиду водню,
викликає посилення фрагментації ДНК у ядрах контрольних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють
уявлення про шляхи формування відповіді клітин на дію стрес-агентів та
про початкові механізми ініціації апоптозу за дії іонізуючої радіації та
пероксиду водню. Результати роботи можуть бути використані для
моделювання апоптозу in vitro у клітинах різних типів. Одержані дані
можуть бути корисними для розробки методів корекції патологічних змін
клітинного гомеостазу, а також для направленого пошуку препаратів,
здатних ініціювати або пригнічувати загибель клітин.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний
пошук, аналіз та оцінку наукової літератури за темою дисертаційної
роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження, інтерпретацію,
теоретичне обгрунтування отриманих результатів та підготовлено матеріали
до друку. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за
участі наукового керівника дисертанта д.б.н., проф. Матишевської О.П.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи
було представлено на: VIII Українському біохімічному з’їзді з’їзді
(Чернівці, 2002); 2-ій Міжнародній конференції “Conference for students,
PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics”
(Київ, 2003); III з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів,
2002); III з’їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія i
радіоекологія) (Київ,2003); First (Inaugural) Ukrainian Congress for
Cell Biology (Lviv, 2004); 5-th Parnas conference Molecular mechanisms
of cellular signaling (Kyiv, 2005).

Публікація матеріалів. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8
статей у фахових журналах та 7 тез у збірниках матеріалів вітчизняних та
міжнародних конференцій і з’їздів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 131
сторінці друкованого тексту, містить 18 рисунків та 6 таблиць. Робота
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів
дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення,
висновків, списку використаних джерел (248 посилань).

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей вагою 120 – 150 г,
яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тимоцити отримували
шляхом протирання тимуса через нейлонову сітку у буфер такого складу
(мМ): Na2HPO4 – 3, KCl – 5, NaCl – 120, CaCl2 – 1, глюкоза – 10, MgSO4 –
1, NaHCO3 – 4, HEPES – 10, рН 7,4. Кількість життєздатних клітин
підраховували у камері Горяєва після фарбування 0,4 % розчином
трипанового синього. Інкубацію клітин (2 – 4·106 клітин/мл) здійснювали
у термостаті при 37оС у середовищі RPMI-1640, що містило 5% ембріональну
телячу сироватку. Пероксид водню додавали у середовище інкубації клітин
до кінцевої концентрації 0,1 мМ.

Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких
умов: експозиційна доза – 11,61 х 10-2 Кл/кг (4,5 Гр), потужність дози –
0,24 Гр/хв, фільтри 0,5мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10
мА, фокусна відстань – 50 см.

Для оцінки вмісту некротичних та апоптичних клітин у суспензії
застосовували метод подвійного прижиттєвого фарбування клітин
флуоресцентними фарбниками Хехст 33342 (1 мкг/мл) та пропідіума йодид
(0,04 мкг/мл). Морфологічну оцінку проводили під люмінесцентним
мікроскопом МЛ – 2 (Росія).

Субклітинне фракціонування здійснювали після руйнування тимоцитів
гомогенізацією у щільно притертому гомогенізаторі Поттера у 10-кратному
об’ємі буфера, що містив (мМ): сахарозу – 250, KCl – 50, КH2PO4 – 2,5,
MgCl2 – 2, HEPES – 10, pH 7,4. Грубу ядерну фракцію (1500 g, 10хв)
використовували для отримання ядер методом центрифугування у градієнті
1,5 М сахарози (15000 g, 45 хв, +4оС) у присутності інгібітора протеїназ
0,1 мМ фенілметилсульфанілфториду (ФМСФ) (Борисов та ін., 1999).
Надосадову центрифугували (15000g, 15 хв, +4оС) для отримання
мітохондріальної та грубої розчинної фракції.

Для виділення хроматину ядра (5 х 107) обробляли буфером, що містив
(мМ): ЕДТА -2, NaCl – 280, трис-НСl – 1, рН 7,9, 1% тритон Х-100,
отриманий після центрифугування (12000g 10 хв) осад відмивали у буфері,
що містив 2 мМ ЕДТА та 1 мМ трис-НСl, рН 7,9. Отримання хроматину
проводили при t 0 +4о С за присутності 0,1 мМ ФМСФ.

Термічну денатурацію препаратів хроматину проводили у буфері, що містив
1,5 мМ NaCl та 0,15 мМ лимоннокислий натрій, рН 7,0 у термостатованих
кварцевих кюветах з тефлоновими пробками на спектрофотометрі “SPEKORD –
M40” (Німеччина), зі швидкістю нагрівання 0,3є С за хвилину. На основі
інтегральних кривих термічної денатурації ДНК було побудовано
диференціальні криві та визначено площу піків диференціальних кривих
плавлення, як описано у (Мозжухина та ін., 1990).

Електрофоретичний аналіз вмісту гістонів проводили у блоці 20%
поліакриламідного гелю в присутності 0,1% додецилсульфату натрію за
методом Laemmly. Отриманні на цифрових фотографіях електрофореграм
патерни забарвлених Кумасі G-250 білкових смуг аналізували з
використанням програми TotalLab 1.11 фірми Phoretix.

Кількість високомолекулярної та фрагментованої ДНК у ядрах та клітинах
визначали за методом Бартона (Burton, 1956). Вміст
полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) визначали після лізису клітин у буфері,
що містив мМ: ЕДТА – 10, трис-HCl – 10, рН 7,4, 0,5 % тритон Х-100, як
описано у (Гринюк та ін., 2004).

Деградацію ДНК оцінювали у безклітинній системі, що містила (мМ):
сахарозу -250, КН2РО4-2,5, НЕРЕS – 10, КСl – 50, МgCl2, – 2, ЕГТА 0,1,
дітіотрейтол – 1, АТФ – 2, креатинфосфат – 10, креатинкіназу та ядра (3
х 106) контрольних тимоцитів. До середовища вносили 1 мг білка
мітохондріальної або 0,5 – 2 мг білка грубої розчиної фракції
(постмітохондріального супернатанту 15000g), проби інкубували протягом 2
год при 37? С.

Набухання мітохондрій оцінювали за зміною світлорозсіювання суспензії,
що містила (мМ): сахарозу 150, КСl – 50, КН2РО4 – 2, сукцинат – 1, тріс
НСl – 5 (рН 7,4,) та 2 – 3 мг білка мітохондріальної фракції. Реєстрацію
світлорозсіювання здійснювали у термостатованій кюветі (30оС) на
спектрофотометрі КФК-3 при довжині хвилі 520 нм (Olenev et al, 1976).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими
методами варіаційної статистики (Плохинский, 1981). Розрахунки та
побудову графіків виконували на комп’ютері з використанням прикладної
програми „Microsoft Excel 98”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Морфологічна оцінка тимоцитів на ранньому етапі після дії радіації та
пероксиду водню. Оцінку структурного стану хроматину у контрольних та
підданих дії іонізуючої радіації (4,5 Гр) або 0,1 мМ Н2О2 тимоцитах
здійснювали упродовж 3-годинної інкубації клітин – терміну, який передує
виявленому раніше (Коваль та ін., 2001) накопиченню
полідезоксирибонуклеотидів у клітинах, спричиненому міжнуклеосомною
фрагментацією ДНК.

Дані флуоресцентної мікроскопії, проведеної із застосуванням специфічних
до ДНК барвників Хехст 33342 та пропідію йодида показали, що кількість
життєздатних клітин після опромінення та обробки пероксидом водню
знижується порівняно з контролем майже однаково,

Таблиця 1

Вміст клітин з ознаками апоптозу та некрозу у суспензії тимоцитів за дії
радіації або пероксиду водню (% від загальної кількості, М ± m, n = 6)

Інку-бація

3 год

Життєз-датні

Некро-тичні Апоптичні клітини

разом

апоптичні тільця з конденсованим хроматином з фагменто-ваним ядром

Контроль 85,0 ± 9,2 2,2 ± 0,2 12,8 ± 1,3 5,7 ± 0,4 6,1 ± 0,7 1,0 ± 0,2

4,5 Гр 60,1 ± 5,0* 3,8 ± 0,3* 36,1±3,0* 28,2 ± 2,7* 5,0 ± 0,4 2,9 ± 0,1

0,1 мМ Н2О2 65,2 ± 4,8* 3,6 ± 0,4* 31,2 ± 3,2* 9,1 ± 0,8* 20,2 ± 2,5*
1,9 ± 0,2

* – р >

F

|

~

e

???e

O

O

N

N

O

O

O

N

ну як інгібітора ендонуклеолізу пов’язують з його здатністю впливати на
йонне мікрооточення хроматину. Спермін пригнічував деградацію ДНК
однаковою мірою як у опромінених, так і оброблених Н2О2 тимоцитах –
вміст ПДН знижувався у 1,9 та 1,7 разів відповідно. Інтерпретація даних
щодо пригнічувального ефекту сперміну ускладнена, оскільки за його
присутності посилюється здатність мітохондрій накопичувати та утримувати
Са2+ та спостерігається нормалізація підвищеного рівня Са2+ у цитоплазмі
(Дерябина и др., 2000).

Для оцінки можливої ролі мітохондріального шляху ініціації апоптозу було
використано циклоспорин А – блокатор неселективної пори внутрішньої
мембрани мітохондрій. За присутності 2 мкМ циклоспорину спостерігалось
зниженя у 1,4 рази вмісту ПДН, накопичених у опромінених

тимоцитах. Значно більшою мірою ефект циклоспорину виявлявся у клітинах,
підданих дії Н2О2 – інгібітор пригнічував процес фрагментації в 2,3 рази
порівняно з контролем (рис.3, 3).

Дані щодо пригнічення фрагментації ДНК в опромінених клітинах переважно
сперміном та хлороквіном вказують на залучення процесів ендонуклеолізу
та фосфоліпідного гідролізу до активації шляхів апоптозу в тимоцитах
після дії іонізуючої радіації. Пригнічувальний ефект ?-токоферолу та
циклоспорину на фрагментацію ДНК у тимоцитах за дії Н2О2 свідчить про
першочергову роль процесів генерації активних форм кисню, реакцій
вільнорадикального переокиснення та порушення бар’єрної функції
мітохондріальних мембран у ініціації Н2О2 – залежного апоптозу.

Дослідження фрагментації ДНК тимоцитів у безклітинній системі. Для
з’ясування можливої ролі мітохондрій у сигнальних шляхах, що ведуть до
деградації ДНК у тимоцитах, було використано безклітинну систему,
компонентами якої були 0,25 М сахароза, ізольовані ядра контрольних
тимоцитів, система регенерації АТФ та мітохондрії, виділені з
контрольних та підданих дії досліджуваних чинників тимоцитів. Згідно
даних флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342
цілісність ядер упродовж їх 2-годинної інкубації у безклітинній системі
зберігалась. Внесення у безклітинну систему мітохондрій, виділених з
контрольних тимоцитів, не впливало на структурний стан хроматину у ядрах
та на вміст накопичених за інкубації полідезоксирибонуклеотидів (рис. 4,
2).

Оскільки незалежно від типу клітин та індуктора апоптозу
структурно-функціональні порушення у мітохондріях передують появі
типових морфологічних ознак апоптозу в ядрах (Zamzami et al., 1996;
Crompton, 2000), у безклітинну систему вносили мітохондрії, виділені з
тимоцитів через 1 та 3 год після дії досліджуваних чинників.

Рис. 4. Фрагментація ДНК тимоцитів (% ПДН від загального вмісту ДНК) у
ядрах контрольних тимоцитів за інкубації: без добавок (1); після
внесення мітохондрій контрольних тимоцитів (2); мітохондрій, виділених з
тимоцитів через 1 год (3) або 3 год (4) після дії радіації; мітохондрій,
виділених з тимоцитів через 1 год (5) або 3 год (6) після додавання Н2О2

*- р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020