НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна
ШАНДРЕНКО СЕРГІЙ ГРИГОРОВИЧ
УДК 577.128
Зміни обміну оксиду азоту в організмі щурів при його гіперпродукції та
можливості їхньої корекції (епр спектроскопічні дослідження)
03.00.04 – біохімія
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана а Інституті екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя
МОЗ України
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор
ДМИТРЕНКО Микола Петрович,
завідувач лабораторії біохімії Інституту екогігієни та токсикології
ім.Л.І.Медведя МОЗ України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
СТАРОДУБ Микола Федорович,
головний науковий співробітник відділу молекулярної
біології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України;
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
МЕЛЬНИКОВ Олег Ростиславович,
старший науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу Інституту
експериментальної патології, онкології та радіобіології
ім.Р.Е.Кавецького НАН України.
Захист відбудеться 10 грудня 2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9)
Автореферат розісланий 9 листопада 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук
Кірсенко О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Оксид азоту (NO) ферментативно синтезується
різними типами клітин. При низьких (фізіологічних) концентраціях він як
внутришньоклітинний та міжклітинний месенджер здійснює в організмі
важливі сигнальні і регуляторні функції, зокрема, контролює активність
гуанілатциклази і ряду інших ключових ферментів, тонус судин,
нейромедіацію, агрегацію тромбоцитів, функцію клітин імунної системи
тощо (Moncada S. et all,1999, Palmer R. et all, 1988). Високі
концентрації NO в організмі можуть створюватися екзогенними та
ендогенними чинниками. Надходження в організм екзогенних донорів NO (
оксидів азоту, N- и S-нітрозосполук, неорганічних і органічних нітратів
тощо), які є одними з основних антропогенних забруднювачів довкілля,
може збільшувати концентрацію NO до токсичного рівня, і це є небезпека
для здоров’я людини. Високі рівні NO можливі через індукцію відповідної
ізоформи NO-синтази (тип II), що виникає в клітинах організму при
запальних процесах, зокрема, септичних станах у відповідь на дію ендо- і
екзотоксинів мікроорганізмів (Schmidt H., et all, 1996, Wolf G., et all,
1997). Надзвичайні концентрації NO створюють в організмі умови
нітрозативного і оксидативного стресу, за яких виснажуються
антиоксидантні і репаруючі ДНК системи та полегшується реалізація
цитотоксичної дії NO. Така різнонаправлена дія NO в залежності від його
концентрації спонукає приділяти особливу увагу її визначенню в клітинах
і тканинах організму. На сьогодні дані щодо характеру дії в організмі NO
та шляхів її корекції в більшості досліджень отримані опосередкова-ним
шляхом і є досить суперечливими. Це пов’язано з методичними труднощами,
що виникають при дослідженні обміну NO і його властивостей. NO є
реактогенний радикал, що легко вступає в реакції з залізом, О2, а
особливо з супероксидом (О2-) і тому має обмежений термін життя
(декілька секунд) та радіус дії. Найбільш прямим і незамінним методом,
що дозволяє безпосередньо здійснювати моніторинг інтенсивності
утворення NO, а також вивчати його обмін в дослідах in vitro та
in vivo є метод електронного парамагнітного резонансу (ЕПР). Цим методом
також можна визначати ряд показників, що характеризують процеси в
організмі, які пов’язані з обміном NO та його токсичною дією.
Зв’язок роботи з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану
науково-дослідної роботи лабораторії біохімії Інституту екогігієни та
токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України та виконана у рамках таких тем:
“Дослідження участі оксиду азоту в патогенезі СНІД та СНІД-подібних
імунодефіцитних станів” (1994-1995), № ДР 0193U034229, шифр теми 93/10;
“Дослідження біохімічних механізмів апоптозу клітин імунної системи”
(1994-1996), № ДР 196U024284, шифр теми 5/269; “Роль оксиду азоту в
механізмі дії ліків та отрут” (1995-1996), № ДР 0196U008343, шифр теми
92/49; “Дослідження метаболізму оксиду азоту і формальдегіду та
механізмів їх спільної дії” (2001-2005), № ДР 0101U007592, шифр теми
05.07/00014.
Мета та задачі дослідження: Метою роботи було дослідити методом ЕПР
закономірності змін обміну NO в організмі щурів за умов його
гіперпродукції, що викликана різними чинниками, та можливість корекції
цих порушень.
Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі:
1. Дослідити динаміку вмісту нітрозильних комплексів в умовах
підвищення рівня NO в організмі з екзогенних джерел (інтоксикація щурів,
що викликана нітритом натрію та нітропрусидом натрію) та активації
ендогенного синтезу NO у щурів (ін’єкції вакцини БЦЖ та інтратрахеальна
інсталяція азбестового волокна).
2. Дослідити стан різних фондів тривалентного заліза в плазмі крові
щурів при гіперпродукції NO.
3. Вивчити властивості екзогенного акцептору NO на основі комплексу
унітіолу з залізо-аскорбатом, ефективність його використання для
корекції обміну NO при гіперпродукції NO в організмі.
Об’єкт дослідженння – щури лінії Wistar за умов гіперпродукції NO в
організмі.
Предмет дослідження – встановлення закономірності змін обміну NO при
його гіперпродукції в організмі за рахунок надходження екзогенних джерел
та активації ендогенного синтезу.
Методи дослідження – при виконанні роботи використовувався метод
електронного парамагнітного резонансу. Дослідження виконувалися в
динаміці, через певні проміжки часу після введення щурам речовин, що
досліджувалися. В умовах in vitro дія донору та акцептору NO
досліджувалася на тимоцитах щурів.
Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає у
тому, що розроблено модель активації ендогенного синтезу NO у щурів
шляхом імунізації вакциною БЦЖ, на якій визначено вміст NO, динаміку
утворення нітрозильних комплексів в крові та печінці та сукупність ЕПР
параметрів, що характеризують токсичний вплив NO. Встановлено, що
незалежно від місця локалізації введеного індуктора NO, де виникає
осередок запалення, відбувається загальна індукція NO-синтазних систем в
організмі, що призводить до підвищення рівня NO в різних клітинах,
тканинах та крові. Експериментально доведено, що гіперпродукція NO в
організмі супроводжується збільшенням в плазмі крові лабільного
тривалентного заліза, що впливає на обмін заліза в крові та може
підсилювати стан оксидативного стресу. Створено новий препарат
“Нітоксидел” (комплекс унітіолу з залізо-аскорбатом), що здатен
зв’язувати і транспортувати NO, зменшувати його токсичний вплив при
гіперпродукції в організмі шляхом екранування ендогенних мішеней дії NO.
Практична значимість одержаних результатів. Розроблено та досліджено
метод зниження токсичного впливу NO в умовах його гіперпродукції в
організмі через введення екзогенного акцептору NO, а також метод
інтенсифікації ендогенного синтезу NO в організмі фармакологічними
препаратами, які призводять до індукції NO-синтази та покращують умови
для регуляторної дії NO. Ці методи можуть бути використані в розробці
фармакологічних програм лікування захворювань, патогенез яких
ґрунтується на порушенні обміну NO в організмі.
Розроблено метод визначення концентрації лабільного окисленого заліза в
плазмі крові як біомаркера, що тісно корелює з підвищенням рівня NO. Цей
біомаркер можна використовувати в клінічних дослідженнях для визначення
патологічних станів організму, що пов’язані з гіперпродукцією NO, коли
неможливо використати метод ЕПР для аналізу нітрозильних комплексів в
зразках крові через низьку концентрацію останніх.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснений інформаційний
пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обґрунтована
методологія постановки експериментів, виконані експериментальні
дослідження, проведений аналіз отриманих результатів разом з науковим
керівником професором Дмитренко М.П. Експерименти на тимоцитах та
перитоніальних макрофагах щурів було проведено спільно з науковими
співробітниками лабораторії біохімії Інституту екогігієни та
токсикології Кішко Т.О. та Смердовою Л.М. Отримані результати викладені
у спільних публікаціях. Решта дослідів проводилась здобувачем
самостійно.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були
представлені на засіданнях лабораторії біохімії на протязі 1994-2007
років, Першій національній науково-практичній конференції з проблем
ВІЛ/СНІД (Київ, 1995), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ,
1997), 2-nd Parnas Conference (Gdansk, 1998), міжнародному Європейському
конгресі токсикологів EUROTOX (Istanbul, 2001), “Intracellular
Signalling in Plant and Animal Systems (ISPAS)” (Київ, 2001), VIII
Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), науковій конференції
“Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической
защиты” (Санкт-Петербург, 2004); на II з’їзді токсикологів України
(Київ, 2004); VI Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні
проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини”, присвяченій
100-річчю з дня народження Л.І.Медведя (Київ, 2005).
Публікації. Результати досліджень представлені у 9 статтях в періодичних
наукових фахових виданнях України, що включено в перелік, затверджений
ВАК України, та 15 тезах доповідей на наукових конференцях. За
матеріалами дисертації отримано 2 патенти на винахід.
Обсяг і структура роботи. Дисертацію викладено на 123 сторінках
друкованого тексту, вона містить 10 таблиць, 25 рисунків та складається
з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, викладення
експериментальних результатів та їх обговорення, висновків, списку
використаної літератури. Останній включає 187 джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Розглянуті властивості NO, його біологічна роль,
основні механізми регуляторної та токсичної дії в організмі. Обговорено
дані літератури про ендогенний синтез NO в організмі, структуру та
функціонування NO-синтаз. Наведені матеріали про утворення NO
нітритредуктазними системами. Розглянуті механізми транспортування NO в
організмі, утворення лабільних нітрозотіолів та нітрозильних комплексів
з лабільним негемовим залізом. Висвітлено взаємодію NO з різними формами
заліза, залізовміщуючими білками та його вплив на транспорт електронів в
мітохондріях.
Методи експериментальних досліджень. Об’єктом досліджень були зразки
цільної крові, плазми крові, тканини печінки, нирок, серця та легенів,
тимоцити та макрофаги, отримані від щурів. У роботі були використані
такі реактиви та матеріали: нітрит натрію, нітропрусид натрію, вакцина
БЦЖ, азбестове волокно марки А6-46, унітіол, залізо-аскорбат,
діетилдитіокарбомат натрію, залізо сірчанокисле. Дослідження проводили
на статевозрілих щурах лінії Wistar вагою 180-250 г. Раціон складався з
концентрованого гранульованого комбікорму з виключенням овочів для
зменшення надходження в організм щурів нітриту та нітрату.
Нітрит натрію вводили тваринам перорально в дозі 0,1 ЛД50 (12мг/кг маси
тіла) щодня на протязі двох місяців, комплекс унітіолу з
залізо-аскорбатом підшкірно у дозі 0,01 ЛД50 (8мг/кг) щодня на протязі
двох місяців. Нітропрусид натрію вводили перорально в дозі 30 мг/кг маси
тіла, комплекс унітіолу з залізо-аскорбатом тварини отримували
підшкірно у дозі 50мг/кг разово за 15 хвилин до введення нітропрусиду
натрію. Вакцину БЦЖ вводили щурам інтраперитоніально разово в дозі 10
мг/кг маси тіла, препарат “Нітоксидел” перорально у дозі 30 мг/кг
щоденно на протязі 25 діб після вакцинації. Суспензію азбестового
волокна вводили інтратрахеально в дозі 5 мг/кг в 0,2 мл фізіологічного
розчину. Пастку NO вводили наступним чином: розчин діетилдитіокарбомату
натрію (ДТК) в дозі 500 мг/кг в 2,5 мл води внутрішньобрюшино та розчин
цитрату двовалентного заліза (сульфат заліза 37,5 мг/кг + цитрат натрію
187,5 мг/кг) підшкірно за 30 хвилин до декапітації щурів. Отримання
перитоніальних клітин та виділення макрофагів здійснювали з
використанням середовища RPMI 1640, забуференого NaHCO3 до рН 7,3. Для
проведення дослідів in vitro перитоніальні макрофаги та тимоцити
отримували за методиками, що описані у Дж. Клауса, 1990.
ЕПР-спектроскопічні дослідження проводили на радіоспектрометрі “Varian
Е-109” (США) з робочою частотою НВЧ поля 9,6-9,9 ГГц при температурі
рідкого азоту. Абсолютну кількість парамагнітних центрів розраховували
методом подвійного інтегрування сигналу. Оцифровування та математичну
обробку спектрів проводили за допомогою апаратно-програмного комплексу
Multicon (Interactive Signal Processor, v.1.50). Дослідження
спектральних характеристик комплексу унітіолу з залізо-аскорбатом
проводили на спектрофотометрі “Specord M-40” (Німеччина). Статистичну
обробку результатів проводили за допомогою програми “Statistica” та
“Excel”.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
ЕПР-дослідження обміну NO. Субхронічна дія нітриту натрію. Нітрит натрію
(НН) є екзогенним джерелом NO тривалої дії, він відновлюється за
допомогою ферментативних та неферментативних нітритредуктазних реакцій
(Реутов В.П., 1995). Субхронічне навантаження тварин НН дозволяє
дослідити зміни вивчаємих показників при тривалому нітрозативному
стресі. При пів- та двомісячному пероральному введені НН в спектрі ЕПР
зразків крові реєструється підвищення інтенсивності синглетного сигналу
з g=6,0 – високоспинового метгемоглобіну в 2 та 3 рази відповідно
(табл.1). Суттєве збільшення частини гемоглобіну, що вибуває з
кисневотранспортного процесу, спричинено активною участю гемоглобіну в
нітрит-редуктазних реакціях по відновленню нітрит-іону до NO. Утворений
в крові NO взаємодіє з окси- та деоксигемоглобіном, утворюючи
нітрозильний комплекс Нв-NO. В зразках від дослідних тварин реєструється
характерний широкий сигнал Нв-NO (gx=2.07, gz=1.98, Az=17.5 Gs) з
триплетним розщепленням при g=2.01 (рис.1).
Рис.1. Сигнал ЕПР нітрозильного комплексу гемоглобіну Hb-NO.
Розрахована концентрація комплексів Нв-NO в крові склала: 4,6 та 4,8 мкМ
для півмісячного та двомісячного досліду відповідно Таким чином, рівень
NO в крові на протязі всього досліду залишається практично незмінним і
визначається надходженням нітрит-іонів до організму, його метаболізацією
та виведенням. В той же час, рівень metHb в двомісячному досліді
збільшується на 50% по відношенню до півмісячного, що свідчить про
недостатню активність метгемредуктазних систем в організмі для підтримки
рівня metHb відповідно рівню NO.
В тканині печінки дослідних тварин реєструються динітрозильні комплекси
негемового заліза з парними SH-групами білків (DNIC, рис.2А) на рівні
1,3 та 1,5 мкмоль/г при пів- та двомісячному навантаженні НН відповідно.
Цитохром Р-450 та мітохондріальні металопротеїни, аналогічно
гемоглобіну, мають нітрит-редуктазну активність, що могло би пояснити
утворення NO в печінці в процесі відновлення нітрит-іону. Однак,
відсутність змін в інтенсивності відповідних сигналів (g: 2,25; 2,00;
1,94) спростовує таку можливість. DNIC утворюється за рахунок
вивільнення NO з комплексу Hb-NO. Враховуючи, що “час життя” NO в DNIC в
десятки разів більше, ніж в Hb-NO, виходить, що коефіцієнт передачі NO з
крові до печінки не більше кількох процентів. Саме гемоглобін крові є
основною мішенню дії НН, екрануючи інші біологічні структури від
токсичної дії останнього.
Рис. 2. Спектр ЕПР тканини печінки щурів при пероральному введені
нітриту натрію. Cинглетний анізотропічний сигнал з gсер=2.03 – DNIC: А-
тварини, яким вводили НН; В –інтактні тварини.
Гостра інтоксикація нітропрусидом натрію (НП). НП є екзогенним джерелом
NO швидкої дії. В організмі НП швидко розпадається з вивільненням NO.
Разове введення розчину НП моделює стан короткочасної гіперпродукції NO
в організмі (Баскаков М.Б. та інш., 2000), що дозволяє дослідити
властивості обміну NO` по релаксації відповідних параметрів.
Вже через 30 хв. після введення НП реєструється максимальна кількість
нітрозильних комплексів в крові – Hb-NO на рівні 38 мкМ, яка в
подальшому стрімко падає: на першу годину – на 37%, на другу – на 85%.
Така динаміка є доказом короткочасного масованого утворення NO з НП в
крові. В той же час кількість DNIC в печінці за 30 хв. та за 60 хв.
залишається незмінною: 7,8 та 7,9 мкмоль/г відповідно, а через 2 години
зменшується всього на 30%. Таке співвідношення двох динамік вказує на
наступну схему перерозподілу NO: НП?Hb-NO?DNIC. Кількість metHb при
введенні НП стрімко зростає, через 30 хв. збільшується в 4 рази і через
60 хв. зростає ще на 10% (табл.1). Динаміка metHb співпадає з DNIC:
коефіцієнт кореляції 0,99 (p
>
@
ae
e
T?H
J
hi§H*
D
H
P
’
Q в зразках плазми крові. В досліді з нітритним навантаженням на протязі
0,5 місяця Fe+3лаб не зареєстровано. Через 2 місяці цей показник
становив 12% від фонду Fe+3тран. Введення НП спричинило значні зміни
сигналу g =4,3, але сам препарат НП є джерелом заліза та дає власний
потужний сигнал в цій частині спектру, тому кількість Fe+3лаб при
введені НП не визначали.
При вакцинації БЦЖ спостерігається монотонне зростання величини сигналу
окисленого заліза (g=4,3), який характеризує сумарний вміст заліза в
трансферині та поза ним. На 13-20 добу концентрація Fe+3сумарне зросла у
двічі. У той же час реєструється зниження концентрації Fe+3тран. На 10
добу, коли відбувається максимальне підвищення рівня NO, вміст заліза в
трансферині падає в 2 рази, що може суттєво вплинути на метаболізм
заліза в організмі. Паралельно зі зменшенням трансферинового фонду
заліза в крові відбувається стрімке зростання кількості Fe+3лаб. На
10-13 добу лабільний фонд був в 2,7-2,8 разів вищим за трансфериновий.
Суттєве вичерпування фонду двовалентного заліза в крові, що є джерелом
для заповнення залізом трансферину, є ще однією з причин пригнічення
транспортування заліза залізотранспортним білком – трансферином. Різні
автори вказують на вичерпування фонду лабільного Fe+2 в макрофагах та
інших клітинах організму при значному підвищенні рівня NO (Bohnke R, et
all, 1995, Cairo G.,et all, 2000, Сooper C.E., 1999, Drapier JC, 1993),
що підтверджує можливість такої гіпотези.
При внутрішньотрахеальному введені азбестового волокна рівень Fe+3лаб
постійно зростає на протязі всього досліду та на 6 і 10 добу складає
більш ніж 70% від кількості заліза в трансферині. В той же час
спостерігається зменшення заліза в трансферині на 35%. Такий
перерозподіл заліза свідчить про можливі зміни в метаболізмі цього
важливого для біосинтезу металу.
Наведені результати експериментально доводять факт утворення пулу
лабільного окисленого заліза поза трансферину крові при підвищенні
рівня NO. Значна концентрація цієї форми заліза в крові (до 270% від
вмісту заліза в трансферині) свідчить про можливість його накопичення в
крові, оскільки Fe+3лаб вибуває із звичайного шляху метаболізму заліза
в плазмі крові. Суттєве зменшення кількості заліза в трансферині при
активації синтезу NO в організмі можна пояснити спустошенням фонду
лабільного Fe+2 в крові, що є основним джерелом заліза для заповнення
трансферину. Отже NO виступає одним з регуляторів обміну заліза в
організмі. Формування фонду Fe+3лаб повинно призвести до активації
утворення високореакційних вільних та гідроксильних радикалів, які
здатні окислювати білки, пошкоджувати ліпіди мембран та ДНК, в
результаті чого реалізується один з механізмів запуску оксидативного
стресу при гіперпродукції NO.
Отримані дані також вказують на те, що концентрація Fe+3лаб в крові є
неспецифічним показником підвищення рівня NO в організмі. В дослідах на
тваринах сигнал Нв-NO є основним ЕПР показником обміну NO. Однак, в
клінічних дослідженнях рівень NO, як правило, не настільки великий, щоб
утворити достатню для реєстрації концентрацію нітрозильних комплексів,
тим більше сигнал Нв-NO накладається на широкий та потужний сигнал ЦП
(g=2.05). Це суттєво обмежує використання методу ЕПР для клінічних
досліджень обміну NO. Аналіз форми сигналу з g=4,3 та визначення
кількості Fe+3лаб є більш чутливим методом оцінки рівня NO в
організмі, особливо при активації його ендогенного синтезу.
Теоретична модель можливості корекції обміну NO в організмі. В умовах
гіперпродукції NO в організмі утворюються низькомолекулярні
динітрозильні комплекси лабільного нмDNIC з тіолвміщуючими лігандами:
цистеїном, глутатіоном, тіосульфатом (Ванин А.Ф., 1998). Такі нмDNIC є
більш стабільними, ніж вільний NO. Якщо час життя NO в біологічному
середовищі обмежено кількома секундами, то нмDNIC стійкий на протязі
хвилин. нмDNIC здатні переміщуватися між внутрішньоклітинними
компартментами та клітинами, виконувати функцію донорів NO. Вважається,
що саме нмDNIC реалізують функції ендотелій залежного фактору релаксації
судин (Kleschyov A, et all, 2002).
NO-синтезуючі системи та мішені дії NO розділені у просторі. Розподіл NO
між ними можна апроксимувати експонентою, оскільки процес
транспортування NO буде включати дифузійні та дрейфові компоненти (Kayne
M., 2003): n(x)=N0exp(-x/л), де л- усереднена ефективна довжина
дії NO (рис.7). Припускаємо, що в організмі існує система регуляції
циклу NO, яка підтримує таку активність NO-синтезуючих систем, щоб
забезпечити необхідний рівень NO на мішені дії (Nдії). За рахунок
нерівномірного розподілу утворюються зони з високою концентрацією NO, де
найбільш імовірні прояви токсичної дії NO. Гіперпродукція NO та
нерівномірний розподіл у просторі призводять до створення системи
негативного зворотного зв’язку, що обмежує та контролює активність
NO-синтезуючих систем. Наприклад, синтезований в макрофагах NO спричиняє
як регуляторний, так і токсичний вплив не тільки на мішені дії NO, але і
на макрофагів, що продукують це NO (Miranda KM, 2000). NO синтезується
набагато більше, ніж використовується за призначенням.
Рис.7. Теоретична модель розподілу оксиду азоту у просторі від місця
його синтезу до мішені дії.
Ефективність NO-синтезуючих систем визначається градієнтом концентрації
NO на відстані від місця синтезу до мішені дії. Зниження кількості NO в
місці його утворення при збереженні необхідної кількості NO на мішені
дії можливе за рахунок збільшення ефективної довжини переносу NO (л).
Ендогенні акцептори NO: нмDNIC, гемоглобін – здатні зв’язувати,
транспортувати та при певних умовах вивільнювати NO. Час життя та
рухомість цих нітрозильних комплексів визначають параметр л. Для
збільшення параметру необхідно ввести в біологічну систему екзогенний
акцептор NO з аналогічними властивостями, але з більшим часом життя
комплексу акцептор?-NO. Токсичний вплив NO залежить від імовірності та
швидкості реакції з мішенню. Наявність додаткового акцептора NO, який
був би здатний конкурувати за зв’язування NO з ендогенними мішенями,
може зменшити токсичну дію NO та за рахунок послаблення негативного
зворотнього зв’язку покращити функціонування NO-синтазних систем. Такий
акцептор також може забезпечити більш рівномірний розподіл NO у
просторі.
Властивості препарату “Нітоксидел”. Розроблено новий препарат
“Нітоксидел”, що представляє собою стабільний залізо-сірчаний комплекс
(UFeA) унітіолу (C3H7S3O3Na) та залізо-аскорбату
((C6H8O6·FeO)·1/2FeSO4·H2O). Комплекс UFeA має малиновий колір з трьома
максимумами у спектрі електронного поглинання: 265, 355 та 540 нм.
Процес формування UFeA можна контролювати за оптичними спектрами.
Залізо-аскорбат має пік поглинання на 620 нм. При додаванні до нього
розчину унітіолу смуга поглинання на 620 нм зменшується, натомість
з’являється на 540 нм. По перерозподілу оптичної густини між 620 нм та
540 нм можна судити про оптимальне молярне співвідношення вихідних
компонентів. Аналіз оптичних спектрів показав, що UFeA утворюється
еквімолярно до унітіолу та залізо-аскорбату. В ЕПР-спектрі UFeA є два
синглетних сигнали: g=2.00 – симетричний сигнал аскорбінового радикалу,
g=4,3 – широкий анізотропічний сигнал тривалентного заліза. Подальший
аналіз з використанням розчину ДТК показав, що це залізо не входить у
структуру залізо-сірчаного комплексу та присутнє як пасивна домішка. При
взаємодії UFeA з NO утворюється динітрозильний комплекс UFeA-NO, при
цьому відбувається перерозподіл оптичної густини поглинання в більш
короткохвильову ультрафіолетову частину спектру. Комплекс UFeA-NO
парамагнітний – в спектрі ЕПР він має характерний для DNIC синглетний
анізотропічний сигнал з gсер=2,03 та шириною пік-пік 20 мТл.
Стабільність UFeA-NO в біологічному середовищі досліджено in vitro.
Через UFeA продули газову суміш, що містила NO (1% NO, 99% N2).
Формування UFeA-NO контролювали за спектрами ЕПР. Створений таким чином
насичений комплекс UFeA-NO інкубували в середовищі гепаринезованої
цільної крові. В спектрі ЕПР спостерігалося поступове зменшення
“вузького” сигналу UFeA-NO та зростання “широкого” сигналу Hb-NO з
характерним триплетним розчепленням. Такий перерозподіл спектральної
густини ЕПР поглинання доводить про можливість передачі NO з UFeA-NO на
гемоглобін. В результаті дослідження встановлено:
Час життя UFeA-NO (час, за який концентрація зменшується в 2,7 разів) в
середовищі цільної крові становить приблизно 45 хвилин.
Комплекс UFeA-NO здатен частково передавати NO на гемоглобін з
утворенням Нв-NO. Коефіцієнт передачі розраховано за наведеною формулою:
де ф – час життя відповідного комплексу, S – динаміка сигналу
відповідного комплексу.
Розрахунки дали значення коефіцієнту передачі: Кпер=0,08. При розпаді
комплексу UFeA-NO до 8% NO передається на гемоглобін.
Комплекс UFeA здатен конкурувати за зв’язування NO з гемоглобіном. При
продувці через рівномолярний розчин UFeA та Нв (лізат еритроцитів)
газової суміші (1%NO, 99%N2) в спектрі ЕПР реєструються сигнали UFeA-NO
та Hb-NO у співвідношенні концентрацій 64 та 36%.
Здатність UFeA екранувати біологічні структури від токсичної дії NO
досліджено in vitro на тимоцитах щурів. При інкубації тимоцитів в
середовищі з вмістом 0,1 мМ НП відбувається суттєве збільшення кількості
загиблих клітин в процесі інкубації. Так, за 7 годин інкубації кількість
мертвих клітин зросло з 7 % без НП до 45% в присутності НП. Цитотоксичні
властивості НП обумовлені його здатністю вивільнювати NO, який спричиняє
загибель клітин. Додавання до інкубаційного середовища 1 мМ комплексу
UFeA призвело до зменшення кількості загиблих клітин за 7 годин
інкубації до 24%. Такий результат однозначно пояснюється спроможністю
комплексу UFeA зв’язувати NO та екранувати клітини від його токсичного
впливу. Таким чином, UFeA проявляє цитопротекторні властивості при дії
донорів NO.
Вплив комплексу унітіолу з залізо-аскорбатом на ЕПР показники при
гіперпродукції оксиду азоту в організмі. При нітритній інтоксикації
гемоглобін крові виступає основною мішенню дії NO. Додаткове введеня
щурам його акцептора UFeA призвело до зменшення кількості нітрозильних
комплексів в крові Hb-NO в 1,8 разів та в печінці DNIC- в 2,5 разів
(табл.1). Комплекс Hb-NO утворюється в процесі нітритредуктазних реакцій
на гемоглобіні та за рахунок вивільнення NO з ендогенних депо. Акцептор
UFeA не здатен вплинути на перший процес формування Hb-NO, але за
рахунок екранування Нв суттєво послаблює інтенсивність другого процесу.
Зменшення кількості комплексів Hb-NO, з одного боку, характеризує
ефективність акцептора UFeA, з іншого боку, свідчить про інтенсивність
обміну NO між нітрозильними комплексами в крові та печінці. На нітритній
моделі DNIC в печінці формується, в основному, за рахунок вивільнення NO
з Hb-NO. Тому акцептор UFeA здатен суттєво зменшити кількість
депонованого NO. Як наслідок, відбувається послаблення токсичного
навантаження на гемоглобін – концентрація metHb зменшилась в 1,4-1,6
разів.
При гострій інтоксикації НП введення акцептору UFeA призводить до
зниження всіх показників, що пов’язані з утворенням нітрозильних
комплексів та дією NO. Як видно з даних, представлених в табл. 1,
зменшення кількості нітрозильних комплексів в крові та печінці відбулося
майже однаково – в 1,8 разів. Зниження рівня NO в організмі призводить
до послаблення його токсичного впливу – рівень metHb знизився в 1,9
разів.
Ступінь NO-інтоксикації при вакцинації БЦЖ характеризують рівень metHb
в крові та величини сигналів мітохондріальних центрів. Додаткове
введення акцептору UFeA призводить на 10 добу до зменшення кількості
нітрозильних комплексів в крові і печінці в 1,7 разів. Таким чином, як і
у випадку з гіперпродукцією NО під дією екзогенних донорів, при
активації ендогенного синтезу комплекс UFeA під час максимальної
продукції NO ефективно знижую його рівень в організмі, за рахунок чого
відбувається зменшення інтоксикації: рівень metHb на 10 добу знижується
в 1,5 рази.
Близьке розташування мітохондріальної NO-синтази (mNOS) до учасників
електронтранспортного ланцюгу забезпечує пряму дію синтезованого NO на
дихання мітохондрій (Bringold U., 2000). При введенні UFeA
спостерігається зменшення спаду величин сигналів мітохондріальних
залізо-сірчаних центрів та вільних радикалів, що свідчить про
доступність UFeA до внутрішньоклітинних структур мітохондрій та його
NO-екрануючу дію.
На 20-25 добу після вакцинації БЦЖ рівень нітрозильних комплексів
нормалізується: сигнал Hb-NO зникає зі спектру зразків крові, DNIC
реєструються на низькому рівні – (1,6-0,8) мкмоль/г. Введення комплексу
UFeA забезпечує збереження підвищених рівнів нітрозильних комплексів в
цей проміжок часу, тобто 20-25 діб: Hb-NO відповідно 3,2 та 1,4 мкМ;
DNIC – 1,8 та 1,6 мкмоль/г. На 25 добу кількість DNIC під впливом UFeA
збільшилася в 2 рази. Таким чином, отримані результати вказують на
пролонгування активності NO-синтазних систем в організмі при введенні
екзогенного NO-акцептору UFeA. Поясненням цього факту може бути
спроможність UFeA зменшувати токсичний вплив на саму NO-синтезуючу
систему через екранування її від ушкоджуючої дії NO, а також через
покращення транспортування NO.
На основі отриманих результатів запропоновано дві схеми корекції
порушень обміну NO:
При гіперпродукції NO: вводиться екзогенний акцептор NO – комплекс
унітіолу з двовалентним залізом, що повинно призвести до зменшення
проявів нітрозативного стресу.
При гіпопродукції NO: вводиться індуктор NO-синтази, наприклад,
ліпополісахарид (в клінічних умовах можливе застосування
фармакологічного препарату – пірогеналу) та комплексу унітіолу з
двовалентним залізом. Використання останнього забезпечить пролонгування
інтенсифікації обміну NO та послабить його токсичну дію.
Схема корекції обміну NO при його гіпопродукції була використана для
розробки ефективної фармакологічної програми лікування еректильної
дисфункції (И.И.Горпинченко та інші, 2001).
ВИСНОВКИ
За допомогою методу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) виявлені
раніше невідомі особливості обміну NO в організмі в умовах його
гіперпродукції, встановлені нові шляхи регуляції обміну заліза в плазмі
крові і розроблені методи корекції порушень обміну NO, а саме:
1.Гіперпродукція NO за рахунок екзогенних джерел (разове введення щурам
нітропрусиду натрію (30мг/кг) та субхронічне введення нітриту натрію
(12 мг/кг)) призводить до появи нітрозильного комплексу гемоглобіну
Hb-NO (38 мкМ і 4,6 мкМ відповідно) та зростання кількості
метгемоглобіну (в 4,6 і 3,6 разів) в крові, утворення динітрозильних
комплексів негемового заліза DNIC (7,9 мкМ і 3,4 мкМ) в тканині печінки.
Нормалізація цих змін у часі збільшується в такій послідовності: Hb-NO,
DNIC, metHb.
2.Введення щурам вакцини БЦЖ перитоніально і азбестового волокна
інтратрахеально призводить до збільшення кількості NO в різних тканинах
організму, появі DNIC в печінці та макрофагах, Hb-NO в крові та
збільшення metHb. Під впливом обох чинників зміни вказаних показників
мають схожу динаміку і тісно корелюють між собою. Максимальне їх
збільшення відбувається на 10-тий день, а коефіцієнт кореляції між DNIC
та metHb становить 0,95-0,97 (pАНОТАЦІЯ
Шандренко С.Г. Зміни обміну оксиду азоту в організмі щурів при його
гіперпродукції та можливості їхньої корекції (ЕПР спектроскопічні
дослідження). –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України. Київ, 2006.
Дисертацію присвячено дослідженню змін обміну оксиду азоту (NO) в
організмі щурів на моделях гіперпродукції NO із застосуванням методу
електронного парамагнітного резонансу (ЕПР).
Досліджено динаміку утворення нітрозильних комплексів гемового та
негемового заліза, а також параметри ЕПР, що характеризують токсичний
вплив NO, на таких моделях: гостра інтоксикація нітропрусидом натрію,
субхронічна дія нітриту натрію, вакцинація БЦЖ та інтратрахеальне
введення азбестового волокна. Експериментально доведено, що
гіперпродукція NO супроводжується накопиченням в плазмі крові
лабільного окисленого заліза, для визначення вмісту якого розроблено
новий метод ЕПР.
Розглянута теоретична модель можливості корекції порушень обміну NO в
організмі шляхом введення екзогенного акцептора NO. Розроблено препарат
“Нітоксидел” - залізосірчаний комплекс залізо-аскорбату з унітіолом.
Показано, що цей комплекс здатен зв'язувати NO з утворенням
динітрозильного комплексу, транспортувати та частково вивільнювати NO в
біологічному середовищі. Розроблено спосіб зменшення кількості та
токсичного впливу NO при його гіперпродукції в організмі, а також спосіб
інтенсифікації ендогенного синтезу NO.
Ключові слова: оксид азоту, нітрозильні комплекси, екзогенний акцептор
NO, лабільне окислене залізо.
АННОТАЦИЯ
Шандренко С.Г. Изменения обмена оксида азота в организме крыс при его
гиперпродукции и возможности их коррекции (ЭПР спектроскопические
исследования). - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. А.В.Палладина
НАН Украины, Киев, 2007.
Диссертация посвящена изучению изменений обмена оксида азота (NO) в
организме крыс на моделях гиперпродукции NO c использованием метода
электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
Исследована динамика образования нитрозильных комплексов гемового и
негемового железа, а также параметры ЭПР, отражающие токсическое
действие NO, на разных моделях повышения уровня NO в организме.
Aeia?i?iaeoeoeey NO за счет екзогенных источников (разовое введение
нитропруссида натрия (30 мг/кг) и субхроническое введение нитрита натрия
(12 мг/кг)) приводит к образованию нитрозильного комплекса гемоглобина
Hb-NO (38 ieI ? 4,6 ieI niioaaonoaaiii) e e oaaee/aieth eiee/anoaa
iaoaaiiaeiaeia (a 4,6 e 3,6 ?ac) a e?iae, ia?aciaaieth aeeieo?iceeueiuo
eiiieaenia iaaaiiaiai aeaeaca DNIC (7,9 ieI e 3,4 ieI) a oeaie ia/aie.
A?aiy ii?iaeecaoeee yoeo eciaiaiee oaaee/eaaaony a oaeie
iineaaeiaaoaeueiinoe: Hb-NO, DNIC, metHb.
Aaaaeaiea e?unai aaeoeeiu AOeAE ia?eoiieaeueii e acaanoiaiai aieieia
eio?ao?aoaaeueii i?eaiaeeo e oaaee/aieth eiee/anoaa NO a ?aciuo oeaiyo
i?aaiecia, iiyaeaieth DNIC a ia/aie e iae?ioaaao, Hb-NO a e?iae,
oaaee/aieth iaoaaiiaeiaeia e niaaeo neaiaeia ieoioiiae?eaeueiuo oeaio?ia
a ia/aie. Iiae aeeyieai iaieo yooaeoi?ia yoe iieacaoaee eiatho
iaeeiaeiaoth aeeiaieeo e oanii ei??aee?otho iaaeaeo niaie. Iaeneiaeueiia
eo eciaiaiea i?ienoiaeeo ia 10-e aeaiue, a eiyooeoeeaio ei??aeyoeee
iaaeaeo DNIC e metHb ninoaaeyao 0,95-0,97 (p
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
