АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА
ТРОФІМОВА ПОЛІНА СТАНІСЛАВІВНА
УДК:616.24002.54/.57:576.852.211.001.5
Удосконалення методів лабораторної діагностики туберкульозу на основі
сучасних уявлень про біологію його збудника
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Київському інституті фтизіатрії і пульмонології
ім. Ф.Г. Яновського АМН України.
Науковий керівник: доктор медичних наук Журило Олександр Анатолійович,
завідувач лабораторії мікробіології туберкульозу Інституту фтизіатрії і
пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, завідувач кафедри
мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного
університету МОЗ України;
доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, завідувач
відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України
Провідна установа: Національна медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л. Шупика МОЗ України
Захист дисертації відбудеться “ 21 ” березня 2007 р. о 11.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 64.618.01 при Інституті
мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.
Харків, вул. Пушкінська, 14-16).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, м. Харків, вул. Пушкінська,
14-16.
Автореферат розісланий “ 15 ” лютого 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат медичних наук
С.В. Бруснік
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нині туберкульоз є однією з найпоширеніших в світі
інфекційних хвороб, яка посідає перше місце за смертністю людей від
інфекційної патології. Вельми актуальна сьогодні проблема туберкульозу й
в Україні (Фещенко Ю.І., Мельник В.М., Кобилянська А.В., 2003; Фещенко
Ю.І., 2005). Інтенсивне поширення туберкульозної інфекції
супроводжується наростанням агресивних властивостей збудника – високої
його життєздатності та медикаментозної стійкості (МС) (Бастиан И.,
Порталс Ф., 2003; Сазыкин В.Л., 2005).
Неабиякий вплив на зростання захворюваності на туберкульоз має
збільшення питомої ваги хіміорезистентних варіантів збудника, що з
одного боку погіршує перебіг хвороби, а з іншого – призводить до
поширення випадків туберкульозу з множинною МС. Встановлено, що на
різних географічних територіях близько 15 – 30% вперше виявлених хворих
на туберкульоз заражаються мікобактеріями туберкульозу (МБТ), стійкими
до антимікобактеріальних препаратів (АМБП) (Марьяндышев А.О. и соавт.,
2005; Балабанова Я.М. и соавт., 2006).
З мікробіологічної точки зору, основними причинами, що призводять до
розвитку хіміорезистентності МБТ, є неоднорідність мікобактеріальної
популяції, варіабельність її складу і ступеня вірулентності, мінливість
біологічних властивостей збудника з одночасною селекцією резистентних
особин у результаті неадекватної хіміотерапії (И.Р. Дорожкова и соавт.,
2005; О.К. Асмолов і спіавт., 2005; В.В. Николаевский и соавт., 2005).
Відомо, що з придбанням M. tuberculosis резистентності хоча б до одного
з медикаментозних препаратів, змінюються його біологічні властивості:
біохімічні (ферментативні), культуральні, вірулентність та патогенність
(Бастиан И., Порталс Ф., 2003; Исакова М.Т. и соавт., 2005).
На сучасному етапі є дуже важливим індикація та ідентифікація саме тих
варіантів M. tuberculosis, які з різних причин вже зазнали змін,
означення їх фенотипічних і генотипічних особливостей, впровадження в
практику охорони здоров’я молекулярних метод(в в поєднанн( з рутинними,
що дозволить оптим(зувати д(агностику збудника в бактеріологічних
лабораторіях ( в(дкри( шлях до фундаментальних досл(джень в галуз(
б(олог(( M. tuberculosis. Науково-дослідна робота дозволить оцінити
місце молекулярно-біологічних методів діагностики МБТ в порівнянні з
традиційними мікробіологічними та визначити показання до їх
застосування.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках планових науково-дослідних робіт лабораторії
мікробіології Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського
АМН України і є частиною наукових тем: “Вивчити частоту виділення та
біологічні особливості L-форм мікобактерій туберкульозу у хворих на
хронічний деструктивний туберкульоз легень”, № держреєстрації
0198U000756; “Вивчення частоти виділення та механізмів виникнення
полірезистентності штамів M.tuberculosis, розповсюджених в даний час в
м. Києві та деяких регіонах України”, № держреєстрації 0100U000806;
“Вивчити мікробіологічні властивості, частоту і профіль медикаментозної
стійкості M. tuberculosis у хворих з вперше виявленим туберкульозом
легень в сучасних умовах” № держреєстрації 0100U000806.
Мета дослідження: удосконалення лабораторних метод(в д(агностики
туберкульозу шляхом вивчення б(олог(чних властивостей збудника та
особливостей формування його резистентност( до антим(кобактер(альних
препарат(в.
Задачі дослідження:
1. Оц(нити р(вень мікробіологічного підтвердження туберкульозу у хворих,
що знаходилися на л(куванн( в (нституті фтизіатрії і пульмонології за
останн( роки, визначити б(олог(чні властивості збудників.
2. Модифікувати метод пропорцій для визначення стійкості штамів
M. tuberculosis, щодо протитуберкульозних засобів різних рядів.
3. Провести аналіз частоти медикаментозної стійкості штамів M.
tuberculosis, виділених від хворих з вперше діагностованим туберкульозом
легень.
4. Вивчити частоту вид(лення L-трансформованих форм M. tuberculosis на
різних етапах антибактеріальної терапії і (х б(олог(чні властивості у
хворих на туберкульоз легень.
5. Означити особливост( б(олог(чного розвитку мікобактер(й на
сконструйованому поживному середовищ( з( стимулятором росту і розробити
прискорений метод індикації M. tuberculosis.
6. Обґрунтувати доцільність використання тест-набору MS-СКРИН для
(ндикації комплексу M. tuberculosis/bovis в пол(меразн(й ланцюгов(й
реакц((.
Об’єкт дослiдження: штами M. tuberculosis від хворих на туберкульоз
легень.
Предмет дослідження: біологічні властивості різних варіантів M.
tuberculosis.
Методи дослідження: мікробіологічні, в тому числі прискорен(: система
BBL MGIT AST SIRE, середовище з( стимулятором росту – для виявлення
мікобактерій туберкульозу та їх змінених варіантів і вивчення
медикаментозної чутливості до рифампіцину; генетичні – для діагностики
туберкульозу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для
прискореної індикації та ідентифікації збудника туберкульозу;
статистичні – для оцінки вірогідності результатів. Дані щодо
резистентності штамів M. tuberculosis, отриманих від хворих з вперше
діагностованим туберкульозом легень (ВДТЛ), накопичувались і статистично
оброблялись створеною нами сумісно з міжнародною організацією PATH
“Електронною системою обліку стійкості до антимікобактеріальних
препаратів у туберкульозі”.
Наукова новизна отриманих результатів. Вивчена розповсюдженість
медикаментозностійких варіантів M. tuberculosis, вид(лених в(д хворих,
що знаходилися на л(куванн( в (нституті фтизіатрії і пульмонології (ІФП)
за останн( роки, означено (х б(олог(чні властивості.
Розроблена модифікація методу пропорцій для визначення медикаментозної
стійкості штамів M. tuberculosis.
Вперше досліджена частота виділення та біологічні особливості L-форм МБТ
у хворих на туберкульоз легень. Доведено співпадання морфологічних,
культуральних, тинкторіальних та ферментативних властивостей
ревертантних культур і типових
М. tuberculosis, виділених у одних і тих самих хворих. Підтверджено, що
ревертантні штами нестабільних L-форм МБТ зберігають притаманну
туберкульозу вірулентність для морських свинок.
Вивчено особливості розвитку M. tuberculosis на сконструйованому
поживному середовищі зі стимулятором росту та розроблено метод
прискореної індикації і ідентифікації M. tuberculosis на його основі.
Вперше обґрунтована і доведена ефективність застосування тест-набору MS
– СКРИН для (ндикац(( комплексу M. tuberculosis/bovis в ПЛР з клінічного
матеріалу хворих на туберкульоз.
Практичне значення результатів дослідження. Виділені й охарактеризовані
медикаментозностійкі штами M. tuberculosis, які циркулюють в даний час
на території України. В останні роки збільшилась кількість штамів з
резистентністю до 4-х, 5-ти, 6-ти і навіть 7-ми препаратів, що,
безсумнівно, є відображенням несприятливої ситуації в Україні стосовно
туберкульозу у пацієнтів з вперше діагностованим захворюванням. Означено
біологічні властивості таких штамів, що дає практичну можливість
прогнозування епідеміологічної ситуації з туберкульозу в окремих
регіонах.
Розроблено мікробіологічні основи організації і проведення моніторингу
за медикаментозностійкими штамами M. tuberculosis та сформовано
концепцію створення реєстру хіміорезистентного туберкульозу в Україні.
Встановлена зворотньо-пропорційна залежність між виділенням типових форм
збудника та його L-трансформованими варіантами. Виявлено, що чутливість
до антибактеріальних препаратів у культур-ревертантів співпадає з такою
у типових
М. tuberculosis, виділених від одного і того ж хворого.
На основі нового поживного середовища зі стимулятором росту розроблено
метод індикації та ідентифікації M. tuberculosis, який дозволяє в значно
коротші строки виявити збудника з клінічного матеріалу хворого.
Обґрунтовано застосування тест-набору MS – СКРИН для генетичної
діагностики туберкульозної інфекції. Показана його вища ефективність в
порівнянні з рутинними методами мікробіологічної діагностики
туберкульозу.
Результати дослідження створюють передумови для покращення
мікробіологічної діагностики туберкульозу. Крім того, виявлення
нетипових форм мікобактерій туберкульозу, які під дією тих чи інших
факторів змінили свої біологічні властивості, має клінічне та
епідеміологічне значення для виявлення збудника туберкульозу у тих
випадках, коли виявити збудник при звичайних мікробіологічних
дослідженнях не вдається.
Отримані в процесі роботи дані увійшли до наказу МОЗ України від
06.06.02 р. за № 45 та впроваджені в практику закладів
протитуберкульозної мережі України.
Особистий внесок здобувача. Автором проаналізовано наукову літературу з
даної проблеми, проведено ретроспективний аналіз розповсюдження штамів
M. tuberculosis, самостійно виконано всі мікробіологічні і біологічні
експерименти. Визначено методичні підходи при проведенні
експериментальних досліджень, статистичній обробці даних, аналізі і
порівнянні отриманих результатів та співставлення їх з даними
літератури.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено на
конкурсі науково-технічних проектів “Інтелектуальний потенціал молодих
вчених – місту Києву” (3 премія, Київ, 2001); Республіканському
науково-практичному семінарі для лікарів-бактеріологів
протитуберкульозних закладів України “Прискорена мікробіологічна
діагностика туберкульозу з використанням нового середовища” (Київ,
2002); ІІІ з’їзді фтизіатрів і пульмонологів (Київ, 2003);
науково-практичному семінарі для лікарів-бактеріологів
протитуберкульозних закладів України “Культуральні методи діагностики
туберкульозу та впровадження методу пропорцій для визначення
медикаментозної стійкості M. tuberculosis” (Київ, 2004); XIV з’їзді
мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Полтава, 2004);
науково-практичному семінарі “Мікробіологічні методи дослідження на
туберкульоз та організація системи контролю якості при їх виконанні”
(Київ, 2005); науково-практичному семінарі “Контроль якості
культуральних методів діагностики туберкульозу” (Київ, 2005); ІІІ
Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю
“Біотехнологія. Освіта. Наука. Практика” (Харьков, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових праць, з
них 10 у профільних журналах, визначених ВАК України, 4 методичних
рекомендацій, 3 інформаційних листи, 3 тез, 2 патенти України,
“Інструкція з мікробіологічної діагностики туберкульозної інфекції”,
затверджена Наказом МОЗ України № 45 від 06.02.2002 р.
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 164 сторінках
друкованого тексту, ілюстрована 23 таблицями, 19 рисунками, складається
із вступу, 6 розділів (огляд літератури, 5 розділів власних досліджень),
аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних
рекомендацій та списку 143 використаних джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. В роботі використано характеристики 11890
штамів M. tuberculosis, вилучені із зразків клінічного матеріалу хворих
на туберкульоз легень, що знаходилися на стаціонарному лікуванні в ІФП з
1990 по 2005 роки. Отримано і досліджено 129 культур L-трансформованих
форм збудника туберкульозу, із них 92 культури реверсували в
бактеріальну форму МБТ і віднесені до нестабільних L-форм, а 37 культур
не дали реверсії після 3-х пасажів in vitro і віднесені до
умовно-стабільних L-форм МБТ.
Вивчено біологічні властивості (морфологічні, культуральні,
тинкторіальні, ферментативні, чутливість до антимікобактеріальних
препаратів) у 87 штам(в МБТ, отриманих після реверсії нестабільних
L-форм. Досл(джено в(рулентн(сть для морських свинок 12 ревертантних
культур МБТ, які отримані із нестаб(льних L-форм збудника туберкульозу.
Для ідентифікації виділених штамів використано культурально-біохімічні
тести: н(ациновий тест (наявність здатності продукувати нікотинову
кислоту), нітратредуктазний тест, визначення окисно-відновних ферментів,
визначення термостаб(льност( каталази, реакцію гідролізу твіну-80
визначали за допомогою тест-наборів фірми “TULIP” (Індія), спроможність
росту кл(н(чних ізолятів м(кобактер(й оцінювали на середовищ( з
сал(циловокислим натр(єм та паранітробензойною кислотою.
Гістологічні препарати готували з різних ділянок уражених органів тварин
(селезінка, нирка, печінка, легені). Усього приготовлено, досліджено та
задокументовано в оптичному світловому мікроскопі Olympus BX 51 з
цифровою камерою С 5050 ZOOM 432 препарати з 144 блоків (лабораторія
патоморфології ІФП).
Для ПЛР-д(агностики використано тест-набір MS-СКРИН для (ндикац((
комплексу M. tuberculosis/bovis з клінічного матеріалу.
Для відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозної
інфекції і отримання від тварин не змінених морфологічно штамів M.
tuberculosis використано 37 морських свинок.
Посів на нове поживне середовище здійснювали наступним чином: тритижневі
культури M. tuberculosis, вирощені на середовищі Левенштейна-Єнсена,
знімали тампоном і змішували зі стимулятором росту до одержання
гомогенної суспензії із розрахунку 1 – 2 млн. мікробних тіл у 1,0 мл
суспензії. Склад стимулятора росту: рідин – 0,04 г, сахароза – 0,3 г,
натрій двовуглекислий – 0,01 г, вода дистильована – до 100 мл, в основі
якого міститься поверхнево-активна речовина, яка сприяє зниженню рівня
восків в клітині бактерій, що призводило до різкої зміни швидкості
росту.
Суспензію в об’ємі 1,5 мл витримували при 37 0С протягом 24 – 48 годин,
після чого пересівали на чашки Петрі із свіжоприготованим агаровим
поживним середовищем, рівномірно розподіляли по всій поверхні
середовища, потім чашки Петрі не перевертаючи герметично закривали
клейкою стрічкою (скотчем). Посіви переглядали щодня та інкубували 10
діб. З появою візуального росту культури відзначали початок росту,
готували два мазки, один з яких забарвлювали за Цилем-Нільсеном, другий
( водно-спиртовим розчином метиленового синього.
З метою виділення L-форм МБТ досліджувалося свіжо зібране харкотиння від
хворих. В роботі керувалися методичними рекомендаціями під редакцією
І.Р. Дорожкової і співавт., 1984.
Методи статистичної обробки отриманих результатів. Отримані результати
статистично оброблено за загальноприйнятими методами варіаційної і
кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної
(М), помилки середньої арифметичної (m), критерію Ст’юдента, рівня
значущості (р).
Результати власних досліджень та їх обговорення. Проведено
ретроспективний аналіз 11890 штамів M. tuberculosis, виділених від
хворих протягом 13 років. Виявлено динаміку виділення чутливих і
резистентних штамів МБТ до АМБП по роках (рис. 1).
Рис. 1. Динаміка чутливості до АМБП штамів МБТ, виділених за період 1990
– 2002 рр.
Ретроспективний аналіз даних показав, що в 1990 р. M. tuberculosis,
чутливі до АМБП, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, в 2002
р. їх кількість не перевищувала 24,3 %, тобто за даний період часу цей
показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ
зросла в 1,6 разів – з 46,5 % до 75,5 %.
Аналіз структури МС МБТ у стаціонарі ІФП за 1990 – 2002 рр. відображають
дані табл. 1.
Таблиця 1
Структура медикаментозної стійкості до АМБП штамів МБТ, виділених за
період 1990 – 2002 рр.
Хіміорезистентні штами МБТ
Роки мультирезистентні полірезистентні монорезистентні
абс % ст. % заг. абс % ст. % заг. абс % ст. % заг.
1990 141 40,5±3,2 18,9±2,0 75 21,6±2,3 10,0±1,2 132 37,9±3,2 17,6±1,9
1991 162 42,6±3,1 20,3±2,0 87 22,9±2,2 10,9±1,2 131 34,5±2,8 16,4±1,7
1992 179 44,5±2,9 21,4±2,0 92 22,9±2,1 10,9±1,1 131 32,6±2,6 15,6±1,6
1993 236 45,7±2,4 22,5±1,7 124 23,9±1,7 11,8±0,9 157 30,4±2,0 14,9±1,2
1994 176 46,9±3,3* 23,1±2,3 92 24,6±2,4 12,1±1,4 107 28,5±2,7 14,0±1,6
1995 219 52,1±3,1** 26,9±2,4** 97 23,0±2,2 11,9±1,3 105 24,9±2,3
12,9±1,4
1996 200 52,9±3,4 26,9±2,6 88 23,3±2,4 11,8±1,4 90 23,8±2,4 12,1±1,4
1997 212 56,9±3,4 29,0±2,8 78 20,9±2,3 10,7±1,3 82 22,2±2,4 11,2±1,3
1998 305 8,1±2,5 31,9±2,3 112 21,3±1,8 11,7±1,1 108 0,6±1,7
11,3±1,0
1999 382 64,9±2,4* 9,7±2,5* 118 20,0±1,7 12,3±1,1 89 15,1±1,3
9,3±0,9
2000 323 51,3±2,0 32,5±1,5 176 27,9±1,8** 17,7±1,2** 130 20,7±1,6
13,1±1,1
2001 494 63,9±2,2( 42,5±1,8( 171 22,1±1,8 14,7±1,2 108 13,9±1,7
9,3±1,1
2002 687 68,1±1,5( 51,6±1,4( 163 16,2±1,2( 12,2±0,9 158 15,7±1,1(
11,9±0,9(
Примітки: % ст. – відсоток від числа стійких штамів МБТ; % заг. –
відсоток від загального числа виділених штамів МБТ; * – р
*
,
2
4
&Jv°c
E
0
4
`
&
c
E
&
????th?¤????
?????
????th?$??
?????
?????
?????
?
‘ ‘
???????th?¤??????
?????
??
Lу розвитку бактерій, окремі стадії якого можуть мати різне значення при
інфекції. При цьому ми враховували особливості хімічного складу клітини
M. tuberculosis – в клітині міститься 10,0 – 40,0 % ліпідів. Вони
складаються з трьох фракцій: фосфатидна (та, що розчиняється в ефірі й
не розчиняється в ацетоні), жирова (та, що розчиняється в ефірі та
ацетоні) і воскова (та, що розчиняється у хлороформі та ефірі, але не
розчиняється в алкоголі, ефірі, ацетоні, метиловому алкоголі). Саме
остання фракція, на наш погляд, є основним фактором, який затримує
швидкість росту мікобактерій, шляхом утруднення надходження поживних
речовин до цитоплазматичної мембрани та в клітину бактерій, являючи
собою полісахарид, який пов’язаний з міколовими кислотами та пептидами
(пептидогліколіпід). Віск відіграє значну роль у стримані процесів
обміну в життєдіяльності клітини M. tuberculosis.
При використанні попередньої обробки M. tuberculosis спеціальним складом
– “стимулятором росту”, який сприяє зниженню рівня восків в клітині
бактерій, а також нового агаризованого середовища, було виявлено, що
поряд зі зміною швидкості росту мікобактерій, спостерігається виражений
їх поліморфізм. На агаровому середовищі після добової експозиції в
“стимуляторі росту” штами мікобактерій давали візуальний ріст, починаючи
з 3-ї доби, рясний газонний ріст культур фіксували на 4 ( 5 добу. При
збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу (до 48 годин) було
виявлено підсилення інтенсивності росту M. tuberculosis ( незначний ріст
визначали візуально, починаючи з 2-ої доби інкубації, газонний ріст
культур ( на 3-ю добу спостереження. M. tuberculosis на агаровому
середовищі мали характерні культуральні властивості: колонії соковиті,
трохи матові з жовтуватим відтінком, по консистенції (
восково-маслянисті, легко відокремлюються від агару. За допомогою
мікроскопії було виявлено наступні морфологічні варіанти мікобактерій
туберкульозу ( коковидні і овоїдні клітини, що переходили з часом у
диплококові і паличковидні форми, які в свою чергу поступово переходять
у колбовидні клітини. Ми намагалися одержати ревертантні культури, які
або частково, або цілком відновили б властивість кислотостійкості, а
морфологію ( цілком. Це вдалося за допомогою пересіву культур з
агарового середовища на традиційне поживне середовище
Левенштейна-Єнсена, але без додавання малахітового зеленого.
Приготовлені мазки культур у початковий період росту на такому
середовищі дозволяли знайти велику кількість дрібних і великих
коковидних форм, іноді таких, що галузяться. Подальший розвиток
призводив до утворення ниткоподібних форм, які деструктуризувалися і
розпадалися з утворенням паличковидних форм ( характерних для M.
tuberculosis (палички Коха) ( тонких, паличковидних клітин з характерною
кислотостійкістю.
Відбирано культури M. tuberculosis, що виростали на агаровому середовищі
після попередньої обробки стимулятором росту та на поживному середовищі
Левенштейна-Єнсена без малахітового зеленого, що виростали в результаті
пересіву з агарового середовища, які потім змивали ізотонічним розчином
хлориду натрію.
Отримані суспензії ділили на частини. З першої порції суспензії готували
мікроскопічні препарати і досліджували під мікроскопом, другу порцію
засівали на рідке поживне середовище Школьнікової, третю порцію
використовували для біологічної проби – зараження лабораторних тварин, а
саме морських свинок, з метою відтворення специфічного патологічного
процесу туберкульозу в макроорганізмі.
Для підтвердження належності культур до виду M. tuberculosis
використовували експрес-тести для ідентифікації Microxpress
(виробництва фірми Tulip Diagnostics (p) LTD, Індія). Використання
ніацинового, нітратредуктазного, каталазного тестів дозволило віднести
культури, що виросли, до виду M. tuberculosis.
Таким чином, нами виявлено, що розмноження M. tuberculosis після
попередньої обробки стимулятором росту на агаровому поживному середовищі
має свої особливості. І це явище характерно для всіх культур M.
tuberculosis.
При посіві другої порції суспензії, отриманої з культури, що виростала
на агаровому середовищі та яєчному середовищі Левенштейна-Єнсена без
малахітового зеленого, на рідке поживне середовище Школьнікової, через 5
– 8 діб спостерігалося формування на поверхні вказаного середовища
тонкої плівки, що характерно для L-форм M. tuberculosis. При мікроскопії
мазків з цієї плівки виявлялися ниткоподібні утворення. Вони мали різну
будову: розгалужену, нерозгалужену або у вигляді порожніх трубочок,
схожих на тендітну сітку або каркас. На їх поверхні в більшості випадків
відмічено потовщення.
Третя частина суспензії використовувалася для зараження морських свинок
з метою відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозу в
макроорганізмі. Введення різних за морфологією клітин M.tuberculosis в
організм морських свинок призводило до розвитку у тварин патологічного
процесу, специфічного для туберкульозу. Зроблені нами висновки про те,
що видозмінені клітини, які відрізнялися морфологічно від клітин виду
M.tuberculosis, належать саме до цього виду, підтвердилися даними
гістологічного дослідження органів і тканин морських свинок.
Після підшкірного зараження морських свинок загибель від
генералізованого туберкульозного процесу наставала у середньому через 45
– 50 діб в усіх експериментальних групах. Слід відмітити, що ми не
акцентували увагу коли наступала загибель в дослідних групах. Важливо
було дослідити експериментальний туберкульоз, довести це симптоматикою,
специфічною зміною органів тварин, морфологічними дослідженнями і,
безумовно, верифікувати діагноз, виділив типову туберкульозну паличку,
яка б володіла усім комплексом морфологічних, тінкториальних,
культуральних і біохімічних властивостей. Це основні постулати-критерії
Р. Коха, які викладені 24 березня 1882 р. на засіданні Берлінської
фізіологічної спілки, які є обов’язковими для оцінки патогенності
будь-якого мікроорганізму.
На розтині загиблих морських свинок спостерігалася картина
генералізованого туберкульозу. Експериментальні дані щодо симптоматики,
специфічних змін органів тварин та результатів морфологічних досліджень
викладено в главі 5. Головний висновок – видозмінені клітини, які
відрізнялися морфологічно від клітин виду M.tuberculosis, належать саме
до цього виду, що підтвердилося даними морфологічного дослідження
органів і тканин морських свинок. З патоморфологічного матеріалу всіх
загиблих тварин, що знаходилися в експерименті, вилучено типову
туберкульозну паличку.
Проведена робота з морфологічно зміненими клітинами M. tuberculosis
переконала нас, що мікобактерії мають свій, характерний лише для них
цикл розвитку, який до теперішнього часу ще остаточно не означено.
Отримані експериментальні дані росту M. tuberculosis на агаровому
середовищі після їх попередньої обробки стимулятором росту підштовхнули
нас провести додаткові дослідження й відпрацювати методику прискореного
методу індикації та ідентифікації M. tuberculosis. На основі проведених
досліджень отримано патент на “Спосіб виділення мікобактерій
туберкульозу з патологічного матеріалу хворих” та розроблено корисну
модель “Спосіб визначення стійких до рифампіцину
M. tuberculosis”.
В розділі 6 власних досліджень з метою реал(зац(( генетичних п(дход(в до
д(агностики туберкульозно( (нфекц(( обгрунтовано доцільність
використання тест-набору для індикації комплексу M. tuberculosis/bovis в
ПЛР за допомогою “Набору реактивів для виявлення дезоксирибонуклеїнової
кислоти M. tuberculosis, М. bovis (“MYC – ТЕSТ”), що складається з трьох
комплектів: № 1 – для виділення ДНК із клінічного матеріалу, № 2 – для
ампліфікації ДНК M. tuberculosis, М. bovis, № 3 – для поділу ДНК
методом електрофорезу в гелі агарози. Набір MYC – ТЕSТ забезпечує
ампліфікацію фрагменту інсерційного елемента IS6110 хромосоми M.
tuberculosis, М. bovis і дозволяє знайти мікобактерій при їх мінімальній
кількості до 50 клітин.
Нами було порівняно дані посівів на рідке середовище BBL MGIT з
наступним виявленням ДНК методом ПЛР і посівів на нове агаризоване
середовище зі стимулятором росту також з наступним виявленням ДНК
методом ПЛР. Посів мокротиння на рідке живильне середовище BBL MGIT
з наступною детекцією ДНК методом ПЛР дозволив виявити мікобактерії в
досить короткий термін (3 – 18 діб) у хворих, що дали негативний
результат у 1-у добу дослідження методом ПЛР. Аналогічні результати
отримано при використанні агаризованого поживного середовища зі
стимулятором росту з наступною детекцією ДНК методом ПЛР, але в ще більш
ранні терміни – на 5 – 6 добу.
Отже, як показали дослідження, перспективним є впровадження в
лабораторну д(агностику туберкульозу молекулярно-генетичного методу
(ндикац(( комплексу M. tuberculosis/bovis з використанням тест-набору
MS-СКРИН, що дозволя( скоротити термін визначення наявності м(кобактер(й
у хворого. В порівнянні з традиційними мікробіологічними методами
(бактеріоскопія, люмінесцентна мікроскопія, бактеріологічний метод)
пропонований метод є більш чутливим.
ВИСНОВКИ
В роботі вирішено актуальну наукову задачу – удосконалено існуючі
методи індикації та ідентифікації збудника туберкульозу та розроблено
нові прискорені методи для покращення мікробіологічної діагностики
туберкульозу. Обґрунтовано мікробіологічні підходи проведення
моніторингових досліджень за медикаментозною стійкістю в країні, що
створює перспективи інтеграції у світову моніторингову мережу
спостереження за резистентністю збудників туберкульозу.
1. За період 1990 – 2002 рр. виявлено збільшення частоти виділення
медикаментозностійких штамів МБТ та появу варіантів M. tuberculosis,
стійких до 6-ти і більше антимікобактеріальних препаратів, що свідчить
про погіршення епідемічної ситуації з туберкульозу в країні,
відображенням якої є епідемія хіміорезистентного туберкульозу в Україні.
Так, якщо в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до антимікобактеріальних
препаратів, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, то в 2002 р.
їх кількість не перевищувала 24,3 % (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
