МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ВАЩЕНКО СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА
УДК 615.37:615.611.69-002.2-02:579.853
Імунопатогенез, діагностика і нові методи імунокорекції у хворих з
хронічними запальними сечостатевими захворюваннями хламідійної етіології
14.03.08 – імунологія та алергологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
КИЇВ – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті нефрології АМН України
Науковий консультант – доктор медичних наук, професор Дріянська
Вікторія Євгенівна, Інститут нефрології АМН України, заступник директора
з наукової роботи, завідувач лабораторією імунології.
Офіційні опоненти – член-кор. АМН України, доктор медичних наук,
професор Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут фтизіатрії і
пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України, завідувач лабораторією
імунології.
доктор медичних наук, професор Бордонос Володимир Герасимович,
Науково-дослідний лабораторний центр Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця, завідувач лабораторією імунології.
доктор медичних наук Ромащенко Оксана Василівна, Інститут урології АМН
України, головний науковий співробітник відділу сексології та андрології
Провідна установа – Луганський державний медичний університет МОЗ
України.
Захист відбудеться “15 лютого” 2007 р. о 13.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 в Національному медичному
університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України (01023, м. Київ, вул.
Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національному медичному
університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул.
Зоологічна, 1).
Автореферат розісланий “12” січня 2007 року.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук, професор __________________ С.Г.Свирид
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. В останні роки одним з важливих в
медико-соціальному відношенні захворювань “нового покоління”, що
передається статевим шляхом, є урогенітальна інфекція, яку викликає
C.trachomatis [Мавров Г.И., 2006; Шеремета В.В. и соавт., 2003; Everett
K.D.E. et al., 2000; Muсoz G. et al., 2004; Ojcius M. et al., 2005;
Samoff E. et al., 2005]. Частота C.trachomatis серед етіологічних
чинників інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ) складає
14,8–82,2% [Мавров Г.И., 2006; Чинов Г.П., 2005]. За даними 3-го
Європейської наради по хламідіям, щорічно у світі хламідіозом
(сечостатевим, очним, легеневим) страждає 500 млн. хворих [Аковбян В.А.,
1997]. Наприклад, в США щорічно реєструвалось більш ніж 4 млн. нових
випадків сечостатевого хламідіозу (ССХ) [Alexander L.L., 1996], в
останні роки вдалося знизити захворюваність, яка в 2000 году, за данними
Centers for Disease Control and Prevention, складала 702093 випадки. В
Росії захворюваність ССХ підвищилася з 1993 по 1996 р. в 2,9 рази (з
37,1 до 106,1 на 100 тисяч населення) і в 2000 році складала 126,2 на
100 тисяч населення [Мавров Г.И., 2006; Тихонова Л.И., 1997].
В Україні з 1993 по 1998 рр. число інфікованих C.trachomatis чоловіків
зросло на 62%, а жінок – на 107%, за 1999-2001 рр. – відповідно на 12% і
69% (на 100 тисяч в середньому 70 хворих); і в 2001 році було
зареєстровано 34 381 хворих хламідіозом [Мавров Г.И., 2006].
Одним з найбільш складних питань в проблемі сечостатевого хламідіозу
залишаються його діагностика, розповсюдженість, особливості
імунопатогенезу, які призводять до хронізації захворювання, і підходи до
лікування. Дуже важливим залишається питання про частоту монохламідіозу,
про сполучення хламідій з іншими інфекційними агентами, про роль
дисбіозу в підтримці персистенції хламідій.
Відомо, що хламідії відносяться до облігатної внутрішньоклітинної
інфекції, і її присутність в організмі може тривалий час не проявлятися
клінічно [Башмакова М.А. и соавт., 2000; Potts J. M. and Pasqualotto F.
F., 2004; Sukumar P. et al., 2003]. До цього часу не відомо, що є
головними причинами, які призводять до інфікування і наступної
маніфестації хламідіозу. Відповідь на це питання може дати вивчення
можливої ролі імуногенетичних факторів в схильності або резистентності
організму до інфікування та наступного розвитку хламідіозу. Подібних
досліджень при хламідіозі не проводилось.
Наслідки невиявленої та нелікованої хламідійної інфекції наносять
суспільству демографічні і економічні збиткі, що оцінюються
астрономічними сумами [Лебедюк М.М. и соавт., 2001; Мавров Г.И., 2006;
Everett K.D.E. et al., 2000; Krause W. and C. Bohring, 2003; Ojcius M.,
2005]. Поряд з поширеністю та щорічним ростом числа захворівших, ця
інфекція характеризується високою частотою неблагоприємного перебігу, в
тому числі розвитком хронічних форм, загострень і рецидивів. Серед
різноманітних ускладнень урогенітальна інфекція є частой причиною
безпліддя у жінок і найбільш частим пусковим механізмом при реактивних
артритах у чоловіків, а також фактором ризику рака шийкі матки і
простати [Гастон Дж., 2001; Ключарев Г.В. и соавт., 2000; Мавров Г.И.,
2006; Muсoz G., 2004; Skowera A. et al., 2004].
В зв’язку з цим, зрозумілий інтерес клініцистів до розробки нових
ефективних методів терапії даної патології. Насьогодні в терапії ХССХ
виявились деякі протилежні тенденції. Одні автори вважають достатнім
семиденний курс лікування; інші припускають його скорочення до декількох
днів, особливо при використанні азитромиціну і аналогічних нових
препаратів; треті ж вважають за необідне тривалі 1-2 місячні курси зі
зміною антибіотиків, однак невдачі складають до 30% випадків [Айзятулов
Р.Ф., 2003; Башмакова М.А. и соавт., 2000; Глухенький Б.Т. и соавт.,
2002; Горпинченко И.И., Гибнер С.М., 2000]. Аналізуючи різні думки, на
даному етапі багато клініцистів приходять до заключення, що успіх в
лікуванні хламідіозу може бути досягнутий тільки при комбінації
загальної і місцевої терапії з обов’язковим урахуванням імунного статусу
хворих.
Не викликає сумніву, що факторами, які впливають на персистенцію
хламідій, являються особливості взаємовідношень між мікроорганізмом і
імунною системою хазяїна [Бондаренко Г.М. и соавт., 2002; Нагорний О.Є.,
2003; Anttila T. et al., 2000; Potterat J.J. et al., 1999].
Вивчення імунного статусу при хламідіозі, яке проведене деякими
дослідниками, показало, що в ряді випадків у хворих спостерігаються
порушення імунорегуляції зі зниженням рівня Т-хелперів, співвідношення
Тх:Тс, характерні деякі особливості гуморальної ланки [Гомберг М.А.,
Соловьев А.М., 2001; Земсков А. М. и соавт., 1999; Dimitracov J. et
al., 2000; Dohle G. R., 2000; Domeika M., 2002].
В останній час з’явились дані про те, що захист від хламідійної інфекції
може залежати від СD4+-Т-лімфоцитів-хелперів [Su H., Caldwell H.D.,
1995; Skowera A. et al., 2004]. Показано, що Т хелпери 1 типу (Тх1)
відповідають за захист організму від внутрішньоклітинних паразитів, в
той час як для захисту від зовнішньоклітинних необхідна комбінація
цитокінів Тх1 і Тх2 [Ярилин А.А., 1997; Stephens R.S., 1999; Sukumar P.
et al., 2003]. Можна предбачати, що від функціональної активності
хелперів по продукції ними різних медіаторів буде залежати перебіг
сечостатевого хламідіозу.
Експериментальні дані продемонстрували важливу роль такого цитокіну як
гама-інтерферон ((-ІФ) в протихламідійному імунітеті. Показано, що під
впливом хламідій Т-лімфоцити продукують (-ІФ, який, в свою чергу,
володіє здатністю інгібувати ріст хламідій не тільки в мононуклеарних
фагоцитах, але і в фібробластах, епітеліальних клітинах [Roncarolo M.G.,
2001; Samoff E. 2003]. Не тільки лімфоцити, але й епітеліальні клітини,
індуковані хламідіями, здатні до самостійної продукції (-ІФ, що
призводить до виробки NO і ураженню хламідій [Igietseme J.U. et al.,
1997]. Показаний дозозалежний ефект впливу (-ІФ на хламідії: в той час
як високі рівні повністю затримують ріст хламідій, низькі індукують
розвиток морфологічно аномальних внутрішньоклітинних форм [Stephens R.
S. et al., 1998; Yang J. et al., 2003] .
Зрозуміло, що без глибокого вивчення імунної системи з характеристикою
продукції як (-ІФ, так і взаємозв’язку його з комплексом інших
медіаторів (ІЛ-1, -2, -10, -12, ФНП) неможливо формування концепції
імунопатогенезу хламідіозу з розробкою відповідних схем лікування, в
тому числі з обов’язковою імунотерапією, що є необхідним для ефективної
боротьби з хламідіями.
Таким чином, дослідження останніх років демонструють важливість вивчення
механізмів імунної відповіді при хламідіозі для виявлення
імунопатогенезу даної патології і розробки ефективних схем терапії, в
тому числі з використанням імуномодуляторів. Важливе значення при цьому
має вивчення медіаторів міжклітинних взаємодій, продукуємих як клітинами
макрофагального ряду, так і Т-хелперами 1, 2 типів та Т-регуляторними
лімфоцитами. Немалу роль грає генетична схильність як до особливостей
імунітету, так і клінічного перебігу захворювань, обумовлена
HLA-фенотипом. Однак, комплексних досліджень стану імунітету з
характеристикою функціональної активності клітин по продукції
медіаторів та врахуванням антигенів гістосумісності HLA при хламідійній
інфекції в літературі не знайдено.
В зв’язку з вищенаведеним, очевидно, що актуальність досліджень
обумовлена наступними факторами: розповсюдженістю і соціальною
значимістю патології, що часто призводить до розвитку хронічних
запальних захворювань урогенітальної сфери та безпліддю, а також тяжкої
супутньої патології з інвалідізацією хворих; низьким терапевтичним
потенціалом препаратів (в основному, антибіотиків); сучасними
досягненнями в імунології, що дозволяють проводити дослідження
особливостей імунітету на клітинному та субклітинному рівнях; широкими
можливостями, які відкриваються завдяки останнім досягненням в галузі
виробництва імунотропних препаратів.
Зв’язок роботи з науковими планами і програмами. Робота виконана в
Інституті урології і нефрології АМН України в рамках тем по планам: МОЗ
і АМН України “Вдосконалити існуючі методи етіотропної імунодіагностики
і імунокорекції хворих з урогенітальними інфекціями, що передаються
статевим шляхом, з урахуванням механізмів розвитку захворювань” (№
держреєстрації 0199U000609); “Вивчити генеративну функцію у чоловіків
при хламідійній урогенітальній інфекції з метою покращення ефективності
діагностики лікування, профілактики неплідності” (№ держреєстрації
0101U000517); в Інституті нефрології АМН України в рамках тем “Визначити
етіозалежні механізми формування інфекцій сечової системи, їх топічну
діагностику, лікування та профілактику” (№ держреєстрації 0104U000341);
“Визначити in vitro вплив нових імунотропних препаратів на функціональну
активність моноцитарно-макрофагальної ланки і Т-хелперів І, ІІ типів та
розробити на цій основі нові підходи до імунотерапії хворих на хронічні
запальні захворювання сечостатевої системи” (№ держреєстрації
0104U002473).
Мета роботи. На основі вивчення імунних механізмів визначити особливості
імунопатогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу і оптимізувати
діагностику, прогнозування і лікування хворих з використанням методів
імунокорекції.
Задачі досліджень.
Дослідити інформативність різних методів діагностики хламідійної
інфекції.
Вивчити частоту розповсюдженості хронічного сечостатевого хламідіозу.
Виявити особливості стану імунної системи у хворих на ХССХ за даними
стандартної імунограми з врахуванням кількості імунокомпетентних клітин,
рівня імуноглобулінів G, A, M, імунних комплексів, фагоцитарного індекса
і числа.
Дослідити функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагальної
системи по продукції медіаторів імунітету – ІЛ-1, ІЛ-12 і ФНП-(.
Вивчити у хворих на ХССХ функціональний стан Т-хелперів 1 типу по
продукції цитокінів – ІЛ-2 і г-ІФ.
Дослідити функціональну активність Т-регуляторних клітин пацієнтів на
основі визначення секреції протизапального медіатора ІЛ-10.
Виявити особливості розподілу HLA-антигенів у хворих для встановлення
факторів схильності до хронічної хламідійної інфекції.
Розробити концепцію імунопатогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу
на основі аналізу отриманих результатів.
Провести експериментальні дослідження для вивчення механізмів дії нового
препарата манакс на функціональну активність імунокомпетентних клітин з
метою встановлення доцільності його використання при хронічному
хламідіозі.
Дослідити в умовах in vitro препарат мікотон для визначення можливостей
його використання при хламідіозі.
Обгрунтувати схему лікування хворих на ХССХ з використанням
імунотерапії.
Оцінити клініко-імунологічні ефекти запропонованої комплексної терапії
у пацієнтів з хронічним сечостатевим хламідіозом і визначити оптимальні
схеми лікування при цій патології.
Об’ект досліджень – механізми імунопатогенезу та засоби лікування хворих
на хронічний сечостатевий хламідіоз.
Предмет досліджень – отримані з крові хворих на ХССХ клітини імунної
системи та цитокіни, що ними продукуються.
Методи досліджень – клінічні, лабораторні, мікробіологічні,
імунологічні.
Наукова новизна отриманих результатів
при порівняльному аналізі різних методів дослідження науково доказаний
комплекс переваг методу ПЛР для діагностики хламідіозу і об’єктивної
динаміки стану на фоні лікування, до яких відносяться: пряме визначення
збудника, висока специфічність та чутливість методу, широкий спектр
об’єктів досліджень і універсальність процедури виявлення різних
збудників, можливість діагностики латентних форм інфекції;
на основі епідеміологічних досліджень в різних регіонах (Київ,
Владивосток) показана значна етіологічна роль хламідій, трихомонад,
мікоплазм і уреаплазм в запальних процесах сечостатевих органів як у
жінок, так і у чоловіків; хламідії при цьому зустічаються в асоціації з
одним збудником в 40,85%, з двома – в 16,46%, з трьома і більше – в
3,65% випадків. Серед асоціантів одно з перших місць займає
U.urealiticum (58,20%), T.vaginalis (14,92%), G.vaginalis (11,94%);
вперше показано достовірне зниження продукції ІЛ-12 при ХССХ, що
розглядається як причина подальших порушень продукції цитокінів
імунокомпетентними клітинами;
формування ХССХ супроводжується високою спонтанною продукцією ІЛ-1 зі
зниженням індукованої;
імунна відповідь на C.trachomatis у хворих на ХССХ характеризується
високою активністю Т-хелперів 2 типа і Т-регуляторних клітин зі
зниженням функціональної активності Т-хелперів 1 типа, що можна
розцінювати як важливий фактор імунопатогенезу хронічного хламідіозу;
ХССХ достовірно частіше зустрічається у осіб, в HLA-фенотипі яких
присутні визначені антигени (А10, В27, В51, DR5,2,7), що корелює з
високою продукцією ІЛ-10 і, відповідно, низькою – г-ІФ; виявлені зв’язки
можуть бути причиною розвитку хронічного хламідіозу і дозволяють
говорити про його генетичну детермінованість;
дані досліджень in vitro продемонстрували, що новий препарат манакс
володіє імунотропною дією, одним из важливих механізмов якої є активація
неспецифічних факторів захисту, підвищення фагоцитарної і протизапальної
активності імунної системы, що послужило основою наукового обгрунтування
для використання його у пацієнтів з ХССХ;
встановлена, на основі досліджень in vitro, доцільність використання при
ХССХ препарата мікотон в зв’язку з його впливом на імунокомпетентні
клітини, який призводить до підвищення кількості фагоцитуючих клітин і
експресії рецепторів на поверхні клітин, посилення проліферативної
активності Т-клітин і продукції ІЛ-1 ;
науково-обгрунтована схема імунотерапії, і на основі отриманих
клініко-лабораторних ефектів, одним з яких була нормалізація балансу
продукції про- та протизапальних цитокінів, доказана доцільність її
використання.
Практичне значення отриманих результатів. Розроблені на основі великої
кількості клініко-лабораторних спостереджень найбільш ефективні
методичні підходи до виявлення C.trachomatis і діагностики хронічного
сечостатевого хламідіоза у хворих. Для практичного лікаря рекомендується
пам’ятати, що вибір методу для діагностики хламідіозу в суттєвому
ступені залежить від клінічної форми захворювання: характера перебігу
запалення (гостре, підгостре, хронічне), топічного діагнозу, ступеня
розповсюдженості запального процесу, а також мети обстеження
(лабораторне підтвердження діагнозу або масове скринінгове обстеження
груп ризику). Показано, що використання агару з визначеними
характеристиками для детекції продуктів ампліфікації дає можливість
поширити об’єм досліджень методом ПЛР.
Аналіз великої кількості дослідженних зразків матеріалу, отриманого у
хворих з запальними захворюваннями сечостатевих органів, продемонстрував
глибину ураження, етіологічним фактором якого являються хламідії,
трихомонади. Присутність умовно-патогенної флори класу Mollicutes
(M.hominis и U.urealyticum) в урогенітальному тракті у всіх пацієнтів
розцінено як етіологічний фактор, що приймає участь в розвитку
запалення, ускладнює діагностику і ефективність лікування.
Проведена комплексна оцінка стану імунної системи у хворих на ХССХ та
визначені ланки, що потребують імунокорекції. Активація гуморальної
ланки імунітету з високими показниками ІК в сироватці крові дозволили
рекомендувати використання сорбентів, а саме, сучасного препарата
мікотон, при ХССХ.
Встановлення зниження кількісних (рівня СD4+-клітин і імунорегуляторного
індекса) та функціональних (продукції г-ІФ) показників Т-клітинної
ланки імунітету дозволило зробити висновок про доцільність використання
препаратів тимусу і рекомендувати використання тималіну.
Відмічене зниження спонтанної і стимульованої продукції г-ІФ у пацієнтів
свідчило про необхідність використання препаратів екзогенного
інтерферона для боротьби з хронічною хламідійною інфекцією, що побудило
включити в схему лікування пацієнтів лаферон (рекомбінантний (-2(
інтерферон), створений співробітниками Інститута молекулярної біології і
генетики НАН України на основі фагозалежної генноінженерної
біотехнології.
Проведені в умовах in vitro дослідження дозволили встановити, що
препарати манакс і мікотон володіють вираженим імунотропним ефектом з
впливом на показники фагоцитоза і цитокіновый профіль, що дозволило
визначити спектр їх впливу при використанні терапевтичних доз і включити
в схему імунотропної терапії у хворих на ХССХ.
На основі клініко-лабораторних і сучасних імунологічних досліджень була
розроблена науково-обгрунтована схема лікування хворих на ХССХ.
Продемонстровані позитивні клініко-імунологічні ефекти використання
запропонованої схеми терапії з участю імунотропних препаратів, які
достовірно відрізняються від стандартних підходів, що дозволяє
рекомендувати її використання для підвищення ефективності лікування
хворих з хронічним хламідіозом.
Схема комплексного лікування використовується в клініці Інститутів
урології і нефрології АМН України, урологічних клініках Владивостока
(Російська Федерація), Київському міському дермато-венерологічному
диспансері, на кафедрі клінічної імунології та алергології Національного
медичного університету ім. О.О.Богомольця. Рекомендується її
впровадження в спеціалізованих клініках і при амбулаторному лікуванні
спеціалістами відповідного профілю – урологами, гінекологами,
дермато-венерологами. Методичні підходи до діагностики дозволяють
рекомендувати їх для використання також лікарями-лаборантами,
мікробіологами, інфекціоністами, педіатрами. Для цього опубліковані,
крім статей, методичні рекомендації, інформаційний лист, посібник для
лікарів, патент.
Особистий вклад пошукача. Ідея дисертаційної роботи запропонована
провідними спеціалістами – доктором медичних наук, професором
Г.М.Дранніком; доктором медичних наук, професором І.І.Горпинченко;
доктором медичних наук, професором А.В.Руденко. Автором проведені
відбір, обстеження, лікування хворих на ХССХ зі спостереженням в
динаміці. Терапія проводилась за допомогою як традиційних, так і
запропонованих науково-обгрунтованих внаслідок проведених дисертантом
досліджень схем лікування з використанням імунотропних препаратів.
Автором проведений співставлюваний аналіз різних методів етіологічної
діагностики запальних сечостатевих захворювань і розроблений
оптимальний алгоритм; розроблена концепція імунопатогенезу хронічного
сечостатевого хламідіозу. Імунологічні, бактеріологічні, а також
інструментальні обстеження хворих проведені спільно з спеціалістами
відповідного профілю: імунологічні дослідження – зі співробітниками
лабораторії імунології, мікробіологічні – лабораторій мікробіології
Інститутів урології та нефрології АМН України (зав. – проф.
А.В.Руденко). Розробка головних напрямків досліджень, визначення мети,
задач роботи, а також аналіз отриманих результатів, положень і висновків
проведені автором спільно з науковим консультантом – доктором медичних
наук, професором В.Є.Дріянською.
Апробація результатів роботи: Основні положення дисертації докладалися
та обговорювалися на конференціях і симпозіумах: на 4 Всеукраїнській
науково-практичній конференції по актуальним питанням алергології,
клінічній і лабораторній імунології (Київ, 1999); симпозиумі
“Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу”
(Київ, 2000); III Національному Конгресі патофізіологів України (Одеса,
2000); 3 Всеросійській науково-практичній конференції (Москва, 2000);
II Міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія,
імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу” (Київ, 2001); III
Міжнародній конференції “Медицинские последствия Чернобыльской
катастрофы: итоги 15-летних исследований” (Київ, 2001);
науково-практичних конференціях “Епідеміологія, імунопатогенез,
діагностика та лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій” (Київ,
2002-2005рр.); VI звітно-виборчій і науково-практичній конференції
Українського товариства спеціалістів по імунології, алергології і
імунореабілітації (УТІАІ) (Київ, 2002); I Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Аутоімунні захворювання: імунопатогенез,
імунодіагностика, імунотерапія” (Киів, 2003); 1 Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Імунотропні препарати в клінічній
практиці” (Київ, 2004); Першому з’їзді сексологів і андрологів України
(Київ, 2004); VIII Українській науково-практичній конференції з
актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та
імунореабілітації (Київ, 2006).
На міжнародних симпозіумах і конгресах: The Annual Meeting of the
European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Brussels,
Belgium, 1999), XIX Congr. of the European Academy of Allergology and
Clinical Immunology (Lisbon, Portugal, 2000); 56 An. Meeting AAAAI (San
Diego, California, 2000); 3 Intern. Conference “Health effects of the
Chernobyl Accident: Results of 15-year follow-up studies” (Kiev,
Ukraine, 2001); The Joint Meeting of the European Academy of Allergology
and Clinical Immunology, the Romanian society of Allergology and
Clinical Immunology (Romania, 2002); XXI EAACI Congress (Naples, Italy.
– 2002); Proc. II World Congr. of Immunopathol. & Respiratory Allergy
(Moskow, Russia, 2004); 5th Annual Meeting FOCIS (USA, 2005).
Публікації. Результати досліджень опубліковані у 24 статтях у фахових
виданнях, затверджених ВАК України (в тому числі 1 – англійською мовою),
опубліковано посібник для лікарів, 15 тез доповідей, 1 патент, 1
інформаційний лист, 1 методичні рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Загальний обсяг дисертації складає 294
сторінки, робота включає вступ, огляд літератури, 9 розділів власних
досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновків та
практичних рекомендацій. Список використаних джерел складають 265 робіт
кирилицею та 208 латиницею. Матеріали дисертації ілюстровано 23
таблицями та 53 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Були обстежені 1890 пацієнтів (876
чоловіків та 1014 жінок). Досліджені 2746 зразків патологічного
матеріалу – зішкрябів зі слизової уретри, цервікального каналу, піхви, а
також секрет передміхурової залози, еякулят і сеча. В м.Києві був
проаналізований 951 зразок матеріалу (з них взято у чоловіків – 495), а
в м. Владивосток – 1795 зразків (з них у чоловіків – 914).
Для етіологічної діагностики використовували методи бактеріоскопії,
прямої імунофлуоресценції (ПІФ), імуноферментного анализу (ІФА),
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Досліджували сироватку крові на
присутність антитіл класів IgA, IgM, IgG до антигенів C.trachomatis
діагностичною імуноферментною тест-системою “Хлами-Бест C.trachomatis”,
яка представляє собою набор, головним реагентом якого є очищений
білковий антиген C.trachomatis. Досліджували епітеліальні зішкряби
уретри, цервікального каналу, секрету передміхурової залози і еякулят на
присутність в них ДНК C.trachomatis методом ПЛР з використанням
видоспецифічних праймерів C.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum,
G.vaginalis (реактиви і обладнання фірми “ДНК-Технологія”, Москва,
Росія).
Визначено 225 пацієнтів, у яких в зразках виявлена C.trachomatis, з них
106 чоловіків і 119 жінок. 80% пацієнтів було зі змішаною інфекцією,
коли поряд з хламідями в дослідженому матеріалі виявлялись гарднерели
і/або уреаплазма, мікоплазма та ін.
Клінічно майже всі 225 пацієнтів з підтвердженим хламідіозом скаржилися
на слабкість, швидку втомлюваність; 40% – на болі внизу живота; 60% – на
болі, різі при сечовипусканні; 50% – на виділення слизу з уретри.
20% пациієнтів звернулись за медичною допомогою з приводу сечостатевого
хламідіозу вперше, 80% хворих лікувались з приводу даного захворювання
раніше, попередні методи лікування були неефективні. В анамнезі жінки в
більшості випадків були на спостереженні декілька років у гінеколога з
приводу хронічних запальних захворювань, У 76 жінок були роди, з них у
27 спостерігалися спонтанні аборти; 33 жінки (28%) лікувалися від
безпліддя, при цьому у 11 з них були в минулому зриви вагітності.
У чоловіків зареєстровано 29 випадків безплідних шлюбів,
спостергігаються у уролога на протязі останніх років. Клінічно у
чоловіків визначався гострий уретрит (12), хронічний уретрит, простатит
(81); у жінок – хронічний ендоцервіцит, кольпіт (44), хронічний
аднексит (39), ерозія шійки матки (13), генітальний герпес (8). З
супутніх захворювань у пацієнтів реєструвались: вегето-судинна дистонія
(29), хронічний холецистіт (27), виразкова хвороба 12-палої кишки в
стадії ремісії (11), хронічний пієлонефрит в стадії ремісії (8),
сечокам(яна хвороба (6). Артралгії відмічені у 17 хворих, у 7 в минулому
діагностували кон’юнктивіти.
Таким чином, діагноз “хронічний сечостатевий хламідіоз” був
веріфікований на основі скарг, анамнезу життя і хвороби, клінічного
стану, а також лабораторних методів дослідження.
В динаміці лікування під наглядом знаходилось 59 хворих на ХССХ, при
цьому 39 хворих 1 групи (17 чоловіків і 22 жінки, з них 13 одружених
пар) використовували запропоновану нами схему терапії з включенням
імунотропних препаратів. В другу (2), контрольну, групу увійшло 20
хворих, які використовували стандартні методи терапії.
При порівнянні груп з використанням критерію хі-квадрат групи не
відрізнялись за віком (в середньому – 25-35 років), статтю, клінічними
проявами і тривалістю інфекції (p2,0 [Зарецкая Ю.М., 1983].
Етіологічну фракцію (атрибутивний ризик, () рахували по формулі: ( = х
– у/1 – у, де х – частота антигену у хворих, а у – частота у здорових.
Даний показник дає можливість об’єктивно оцінити причинну роль в
етіопатогенезі захворювання одного з декількох антигенів-провокаторів,
для яких RR складав >2,0. Достовірним вважали показник ( більше 0,1.
Імуноферментний метод дослідження
а) Одержання супернатантів. Виділені на стандартному градієнті
фікол-верографіну (1,076-1,078) мононуклеарні клітини периферичної крові
відмивали тричі в середовищі 199 і ресуспензували в культуральному
середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 40
мкг/мл гентаміцину, 5х10 М 2-меркаптоетанолу та 3% L-глютаміну. Клітинну
суспензію в концентрації 1,5х106 кл/мл інкубували 24 години в
СО2-інкубаторі при t=37(С без стимулюючого агента або додавали мітогени.
По закінченні строку інкубації клітини осаджували центріфугуванням при
1600 об/хв протягом 10 хвилин, збирали супернатанти і зберігали до
тестування при t= -20( С.
Вміст цитокінів у супернатантах визначали за допомогою імуноферментного
методу. Для визначення вмісту цитокінів використовували тест системи
“DIACLON” (Франція), “IMMUNOTECH” (Франція) та “Протеїновий контур”
(Санкт-Петербург, Росія). Тестування проводилось за допомогою
імуноферментного методу на приладі Stat Fax 303 Plus.
b) Визначення вмісту цитокінів у супернатантах. До 96-лункових планшет
додавали: по 100 мкл стандартів у відповідні лунки для побудови
калібровочної кривої. В інші лунки вносили по 100 мкл супернатанту, що
досліджувався. В усі лунки додавали по 50 мкл відповідних
антицитокінових антитіл. Планшети інкубували при кімнатній температурі
протягом 2 годин, потім лунки 5 разів ретельно промивали буфером і
видаляли залишки рідини.
Далі в кожну лунку вносили по 100 мкл кон’югату
(стрептовідін-пероксидазу), включаючи “нульову” пробу. Після цього
проби інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.
Повторювали промивку планшети 5 разів та вносили до всіх лунок по 100
мкл TMB-субстрату (хромогену) агента, що утворює кольори. Після
інкубації протягом 12-15 хвилин зупиняли ферментативно-субстратну
реакцію, додаючи в кожну лунку по 100 мкл H2SO4. Далі проводили
визначення оптичної щільності стандартів та зразків супернатантів при
довжині хвилі 450 нанометрів.
Для вірогідної оцінки результатів калібрована стандартна крива при
побудові повинна бути лінійною і вказувати на прямо пропорційний
характер між рівнем концентрації цитокіну в супернатанті та оптичною
щільністю. Дані аналізу проб щодо рівня синтезу цитокінів визначали
шляхом їх інтерполяції з отриманою кривою.
Межі нормальних значень вказаних імунологічних параметрів були отримані
на основі результатів дослідження 25 умовно здорових осіб відповідно до
групи обстежених на ХССХ.
Супернатанти, отримані вищевказанною методикою, використовувалися для
тестування продукції цитокінів.
Отримані дані оброблені статистично на персональному комп’ютері за
допомогою пакета програм “SPSS for Windows. Версія 11” та “MedStat”.
Математична обробка одержаних результатів проводилася з урахуванням
перевірки показників на нормальний розподіл та порівняння груп за
ознаками статі та віку з використанням тесту Колмогорова-Смірнова та
критерію хі-квадрат. Для статистичної обробки використовувались
параметричні критерії статистики – тест Ст’юдента і метод Шеффе або
непараметричні – критерій Уілкоксона, аналіз Крускала-Уолліса.
Достовірною вважали різницю при р0,05).
Індивідуальний аналіз дозволив відмітити, що за спонтанною продукцією
ФНП-( пацієнтів можна поділити на дві групи – з високим і низьким рівнем
секреції цитокіну. Висока продукція характерна для хворих зі змішаною
урогенітальною інфекцією, коли наряду з хламідіями виявлялись гарднерели
і/або уреаплазма, мікоплазма. Вміст ФНП-( в супернатантах таких
пацієнтів в декілька разів перевищував показники у здорових і складав в
середньому 32,21±2,61 пкг/мл, що перевищувало стимульовану продукцію в
нормі (p0,05) і була значно нижче, ніж в нормі у здорових – 548,8(36,4 пкг/мл
(р †??
8
d
a$
d
d
d
@
B
D
F
O
?
d
a?cfe~i8i|i?ooooeeeaUUaIIUIA???II
dh`„”
dh`„A
$a$
Iфекції, резервні ж можливості цієї секреції нижче, ніж у здорових
донорів.
Таким чином, представлені нами дані по вивченню ролі продукції цитокінів
в патогенезі хронічного хламідіозу дозволяють відмітити підвищену
активність клітин моноцитарно-макрофагальної системи по продукції такого
важливого індуктора імунної відповіді на інфекцію як ІЛ-1. Крім того,
отримані результати показали, що для хворих на ХССХ характерно зниження
функціональної активності Т-лімфоцитів хелперів 1 типу. Найбільш суттєво
пригнічується секреція ?-ІФ, тому що і спонтанна і стимульована майже
в 2 рази нижче норми, тоді як зниження спонтанної продукції ІЛ-2
виражено не так суттєво.
Отримані дані свідчать також про високий рівень продукції ІЛ-10 при
хламідійній інфекції, тобто про активацію Т-регуляторних лімфоцитів зі
зниженням їх резервних можливостей. Виявлені особливості свідчать про
важливу роль дисбалансу функціональної активності Т-хелперів в
імунопатогенезі ХССХ.
Відомо, що регуляція імунної відповіді являється однією з головних
фізиологічних функцій організма, і велика роль в виконанні цих функцій
належить генам главного комплексу гістосумісності. Молекули антигенів
HLA забезпечують презентацію, тобто представлення імунодомінантних
пептидів, які являються продуктом внутрішньоклітинного протеолізу
чужорідних антигенів, проти яких і буде індукована імунна відповідь.
Серед теорій, пояснюючих схильність до захворювання в залежності від
носійства того чи іншого антигену гістосумісності, у випадку інфікування
хламідіями і генерализації процесу, привертає увагу теорія мімікрії
антигенів. Згідно з цензорною роллю HLA I класу в збереженні гомеостазу,
ця теорія передбачає факт нерозпізнавання клітинами СD8+ ендогенного
пептиду: інформація про змінені (внаслідок персистенції хламідій в
епітелії слизових) цитозольні білки не сприймається антигенрозпізнаючим
рецептором СD8+-Т-лімфоцитів. Це обумовлено тим, що змінені під впливом
хламідій цитозольні білки недостатньо відрізняються від нормального
пептиду і тому мають низьку імуногенність. Таким чином, внаслідок
недостатної стимуляції чужерідними антигенами клон сенсібілізованих
Т-кілерів не формується і хламідія не стає об’ектом для усунення. Можна
передбачати, що при деяких HLA-А, В, С антигенах індивідуума феномен
мімікрії проявляється повною мірою, це призводить до вільного
розповсюдження мікроорганізмів з недостатньою імуногенністю специфічних
антигенів. В зв”язку з цим, представлялось важливим дослідити схильність
пацієнтів до хронічного сечостатевого хламідіозу в залежності від
HLA-фенотипа за локусами А, В і DR.
Результати дослідження HLA-фенотипів 78 хворих в порівнянні з даними 350
здорових донорів свідчать, що за локусом А відносний ризик інфікування
був достовірно вище у носіїв А10 (RR 2,6), A26 (RR 2,7) і A33 (RR 11,9)
(табл. 1). Однак, етіологічну фракцію складав антиген А10 (( 0,61);
антиген А26, який фактично також входить до етіологічної фракції ((
0,1), являється “сплітом” А10. Таким чином, А10 можна вважати головним
провокатором хронізації хламідіозу за локусом HLA-А. Протективну функцію
в даній виборці хворих проявив антиген А24.
Таблиця 1
Розподіл HLA-антигенів (%) у хворих на ХССХ в порівнянні з здоровими
донорами
HLA-А Частота Аг у здоро-вих
n=350 Часто-та Аг у хворих
n=78 RR ( HLA-B Частота Аг у здоро-вих
n=350 Частота Аг у хво-рих
n =78 RR (
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 28 15,4* 0,46
5 16,0 12,3
2 49,4 29,5* 0,43
7 20,8 17,9
3 17,1 19,2
8 13,4 3,8* 0,25
9 20,0 15,4
12 20,8 10,25* 0,43
Продовження таблиці 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
10 17,1 34,6* 2,6 0,65* 13 17,4 8,97
11 16,3 16,7
14 7,1 7,69
19 4,8 5,1
15 9,7 6,4
23 2,3 6,4
16 9,4 1,3* 0,12
24 6,3 1,3* 0,2
17 14,3 15,4
25 9,1 10,25
18 8,3 10,25
26 6,3 15,4* 2,7 0,1* 21 5,7 6,4
28 8,0 8,97
22 5,1 5,1
29 0,3 3,8
27 8,3 17,9* 2,42 0,1*
30 0,6 0
35 17,1 17,9
31 0 0
38 0,8 2,5
32 2,6 0
39 0,3 0
33 0,6 6,4* 11,9* 0,06 40 10,3 8,97
34 1,7 1,3
41 0,8 8,97* 11,4 0,08
36 0 0
44 0,3 0
45 0,3 6,4 23,9 0,06
47 0 1,3
49 0,3 1,3
50 0,3 2,5
51 1,4 20,5* 17,8 0,2*
52 0,6 0
53 0,3 0
56 0 2,5
62 0,3 0
Примітка: * – різниця статистично достовірна
Дослідження антигенів гістосумісності II класу показали суттєве
підвищення відносного ризику інфікування у носіїв антигенів В27, 41, 45,
51 (табл. 1). Однак, атрибутивний ризик обумовлений тільки В27 и В51,
оскільки етіологічна фракція зв’язана тільки з ними. Це не дивно, тому
що частота інших антигенів (HLA-В 41,45) у здорових складає меньше 1%.
HLA-В51 також у здорових зустрічається рідко (1,4%), однак, те, що він
входить до етіологічної фракції, підтверджує його провокаційну роль.
Особливе значення має факт достовірного підвищення у обстежених
пацієнтів частоти HLA-В27, що співпадає з даними Якубовича А.И. и соав.
(2000), які обстежували мешканців Іркутська з хронічною хламідійною
інфекцією, а також Lange U. et al. (1999). Антиген В27 відомий найбільш
високими асоціаціями зі схильністю до розвитку таких тяжких патологій як
хвороба Бехтерєва (анкілозуючий спонділоартрит; частота В27 достигает
90-95%), болезнь Рейтера (триада – іридоцикліт, ірит або увеїт, уретрит
і/або простатит, синовіїт; частота В27 досягає 60-80%) (Lechler R.,
1994). При цьому найбільш важливим мoментом являється схильність таких
хворих до інфікування хламідіями, які в більшості випадків реалізують
етіопатогенез цих захворювань.
Результати досліджень показали, що у хворих на сечостатевий хламідіоз
HLA-В8 являється антигеном-протектором (табл. 1), що співпадає з даними
Кошкина С.В. і Зайцева Г.А. (1998).
Аналіз розподілу HLA-DR продемонстрував, що у хворих на хронічний
сечостатевий хламідіоз частіше зустічаються DR5 (23,8%), DR 2 (21,4%) і
DR7 (21,4%) (табл. 1). Інші антигени цього сублокуса (DR 52, 1, 6, 4),
виявлялись значно рідше. Проміжне становище у HLA-DR3, частота якого
складає 11,9% (табл. 1).
З метою пошуку взаємозв’язку між здатністью до синтезу г-ІФ і
HLA-фенотипом хворі були розподілені на 2 групи: в 1-й концентрація
цитокіна була вище 12 пкг/мл, в 2-й – рівень (-ІФ був нижче 12 пг/мл.
Аналіз HLA-фенотипів свідчить, що в 1-й групі носіями антигенів ризику
хламідіоза являлись 38,46%, а в 2-й 50% (р>0,05). Оскільки ця різниця
недостовірна, а зниження синтезу цитокіна відмічалось абсолютно у всіх
обстежених, важко передбачати, що особливості HLA-фенотипа можуть
впливати на інтенсивність синтезу г-ІФ при хламідіозі. З метою аналізу
взаємозв’язку між активністю синтезу ІЛ-10 і фенотипом HLA хворі були
розподілені на 2 групи: в 1-й концентрація ІЛ-10 досягала 300 пг/мл і
більше, в 2-й – з більш низькою концентрацією. Індивідуальний аналіз
показав, що у 83,33% хворих 1 групи в HLA-фенотипі представлені
антигені ризику хламідіозу, у хворих з помірним або незначним
підвищенням рівня синтезу ІЛ-10 тільки у 12,5% виявлений “ризиковий”
антиген А10 (р0,05).
Клініко-лабораторні дослідження проводились на початку лікування і через
1,5 місяці після закінчення курсу лікування. Такі строки враховували той
факт, що середній строк елімінації “уламків” хламідій з клітин і тканин
складає 4-6 тижнів.
Аналіз клінічного стану через 1,5 місяці після проведеного лікування
показав, що клінічне одужання при задовільному загальному стані з
елімінацією збудника відмічене у 90±4,5% хворих, в той час в контрольній
групі – у 65±10,7 % (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
