НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
ЛУЦЕНКО БОГДАН ОЛЕКСІЙОВИЧ
УДК 616.33-002.44-092.9:615.916’175
NО-залежні механізми формування виразки шлунка щурів при хронічній
інтоксикації нітратом натрію
14.03.04 – патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Вищому державному навчальному закладі України
“Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор Костенко Віталій Олександрович, Вищий
державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна
академія”, завідувач кафедри патологічної фізіології
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України, завідуюча відділом по вивченню
гіпоксичних станів
доктор біологічних наук, професор Берегова Тетяна Володимирівна, НДІ
фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідуюча
відділом фармакофізіології
Захист дисертації відбудеться 08.04.2008 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,
4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,
4.
Автореферат розісланий 06.03.2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01
доктор біологічних наук
Сорокіна-Маріна З.О.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Оксид азоту (NО) — важливий фізіологічний регулятор
функцій організму та метаболізму клітин, а також його попередники та
метаболіти — нітрати та нітрити — постійно присутні в шлунково-кишковому
тракті (ШКТ) (Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Кохно Ю.С., 2000; Bjoerne
H. et al., 2004; Wallace J.L., Miller M.J.S., 2000).
Сучасні дослідження показали, що в шлунку експресуються всі ізоформи
NO-синтаз, активно протікають ферментативні й неферментативні реакції
відновлення екзогенних нітратів і нітритів з утворенням великих
кількостей NO (Berg A., Kechagias S., Sjostrand S.E., Ericson A.C.,
2001; Calatayud S., Barrachina D., Esplugues J.V., 2001; Fischer H.,
Becker J.C., Boknik P. et al., 1999; Premaratne S., Xue C., McCarty J.M.
et al., 2001).
Ціла низка публікацій вказує на участь NО, як патогенетичного фактора, у
розвитку хвороб органів ШКТ, у тому числі в процесі розвитку виразкових
уражень слизової оболонки шлунка (Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Кохно
Ю.С., 2000; Маленюк Е.Б., Аймашева Н.П., Манухина Е.Б. и др., 1998;
Малышев И.Ю., 1997).
Виявлено зміни активності NO-синтаз при гострому виразковому процесі:
збільшення на тлі гіперсекреції і зменшення у всіх структурних елементах
шлунка у фазі рубцювання виразки (Гоженко А.И., Насибуллин Б.А., Кохно
Ю.С., 2000).
У той же час недостатньо досліджено NO-залежні механізми ульцерогенезу,
зокрема пов’язані зі змінами окиснювальних та репаративних процесів у
слизовій оболонці шлунка, при надлишковому утворенні оксиду азоту з
екзогенних попередників (нітратів та нітритів).
Відомо, що саме з біотрансформацією нітрат- і нітрит-іонів до оксиду
азоту пов’язана головна ланка патогенезу хронічних інтоксикацій цими
сполуками (Ажипа Я.И., Реутов В.П., Каюшин Л.П., 1990; Денисенко С.В.,
Костенко В.А., 2003).
Нез’ясованим залишається конкретний внесок у розвиток пептичних виразок
за цих умов продукції оксиду азоту NO-синтазами та шляхом
ферментативного і неферментативного відновлення нітрат- і нітрит-іонів.
Актуальність досліджень у напрямку розкриття особливостей перебігу тих
чи інших патологічних процесів в умовах надлишкового надходження
останніх в організм ссавців також пов’язана з тим, що навантаження на
організм нітросполуками в останні роки не тільки не знизилося, а й
істотно підвищилося (Гоженко А.И., Доренский В.С., Рудина Е.И. и др.,
1996; Fewtrell L., 2004), особливо в сільській місцевості, де
використовуються місцеві джерела водопостачання (шахтні колодязі).
У Полтавській області за період з 1995 по 2005 р.р. концентрація
нітратів, у джерелах місцевого водопостачання, зросла у 2 рази.
Підвищеному навантаженню нітратами підлягає близько 300 тисяч людей.
Насамперед непокоїть становище в Карлівському, Семенівському,
Козельщинському, Оржицькому, Глобинському та деяких інших районах, де
питна вода шахтних колодязів містить рівень нітратів, який перевищує
середньонормативний показник у 5-15, а в деяких навіть в 30-40 разів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана як самостійний фрагмент планової наукової роботи ВДНЗУ
“Українська медична стоматологічна академія” “NO-залежні механізми
розвитку патологічних процесів та їх корекція фізіологічно активними
речовинами” (дисертант – виконавець, № держреєстрації №0104U000746).
Мета дослідження: Метою цієї роботи було дослідження впливу утворення
надлишкової кількості оксиду азоту з екзогенного попередника (модель
хронічної інтоксикації нітратом натрію) на структурно-метаболічні зміни
в слизовій оболонці шлунка (у тому числі залежні від функціональної
активності NO-синтазних систем) за умов відтворення пептичної виразки.
Завдання дослідження:
Дослідити стан окиснювального метаболізму (продукцію активних форм
кисню, пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи, вмісту
та співвідношення аденіннуклеотидів) у слизовій оболонці шлунка білих
щурів у динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію.
Дослідити біохімічний стан сполучної тканини та морфологічні зміни в
слизовій оболонці шлунка білих щурів у динаміці хронічної інтоксикації
нітратом натрію.
Дослідити стан окиснювального метаболізму (продукцію активних форм
кисню, пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи, вмісту
та співвідношення аденіннуклеотидів) у слизовій оболонці шлунка білих
щурів при відтворенні експериментальної пептичної виразки за умов
90-денної хронічної інтоксикації нітратом натрію.
Дослідити біохімічний стан сполучної тканини та морфологічні зміни в
слизовій оболонці шлунка білих щурів при відтворенні експериментальної
пептичної виразки за умов 90-денної хронічної інтоксикації нітратом
натрію.
Дослідити репаративні процеси в слизовій оболонці шлунка білих щурів у
динаміці загоєння експериментальної ацетатної виразки за умов хронічної
інтоксикації нітратом натрію.
З’ясувати роль зміни продукції оксиду азоту NO-синтазними системами (при
введенні їхніх інгібіторів та субстрату – L-аргініну) на
структурно-метаболічні зміни в слизовій оболонці шлунка при відтворенні
експериментальної пептичної виразки за умов 90-денної хронічної
інтоксикації нітратом натрію.
Об’єкт дослідження: механізми патогенної дії NO на організм людини та
теплокровних тварин.
Предмет дослідження: кисень- та NO- залежні механізми ульцерогенезу в
шлунку за умов хронічної інтоксикації нітратом натрію
Методи дослідження: поставлена мета досягнута шляхом використання
експериментальних, біохімічних та морфологічних методів дослідження
шлунка лабораторних тварин.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено, що при хронічній
нітратній інтоксикації збільшується продукція супероксидного
аніон-радикалу мітохондріальним та мікросомальним
електронно-транспортним ланцюгами, знижується його вироблення
NADPH-оксидазою (нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений)
лейкоцитів, активуються процеси пероксидного окиснення ліпідів,
знижується антиоксидантний потенціал, пригнічується ресинтез АТР
(аденозинтрифосфат), підвищується загальна протеолітична активність,
дезорганізація сполучнотканинних структур у слизовій оболонці шлунка
білих щурів, що позначається на структурних змінах у шлунку – розвитку
ерозивно-виразкових уражень і дизрегенераторних процесів у вигляді
атрофії та гіперплазії.
Вперше виявлено, що розвиток пептичної виразки на тлі хронічної
інтоксикації нітратом натрію супроводжується посиленням біоенергетичної
недостатності, підвищенням продукції супероксидного аніон-радикалу
мікросомальним і мітохондріальним електронно-транспортними ланцюгами
клітин слизової оболонки шлунка, активацією процесів пероксидного
окиснення ліпідів, зниженням активності антиоксидантних ферментів (SOD
(супероксиддисмутаза), каталази), підвищенням дезорганізації
сполучнотканинних структур слизової оболонки шлунка білих щурів, що
супроводжується збільшенням множинності пептичних виразок, виразкового
індексу, порушенням репарації виразкового дефекту.
Вперше виявлено, що зменшення утворення оксиду азоту NO-синтазними
системами за умов відтворення пептичної виразки на тлі хронічної
нітратної інтоксикації обмежує падіння енергетичного потенціалу та
продукцію супероксидного аніон-радикалу мікросомальним
електронно-транспортним ланцюгом у клітинах слизової оболонки шлунка а
також NADPH-оксидазою лейкоцитів. З’ясовано, що активність пероксидного
окиснення ліпідів у тканинах слизової оболонки шлунка за умов
моделювання пептичної виразки на тлі хронічної інтоксикації нітратом
натрію (90 діб) залежить від функціональної активності NO-синтаз. При
цьому селективне пригнічення індуцибельної NO-синтази призводить до
обмеження ліпопероксидації, у той час як сукупне інгібування NO-синтаз
(у т.ч. конституційної) сприяє активації цього процесу.
Вперше виявлено, що зменшення утворення оксиду азоту індуцибельною
NO-синтазою обмежує дезорганізацію сполучнотканинних структур слизової
оболонки шлунка білих щурів за умов ульцерогенезу на тлі хронічної
інтоксикації нітратом натрію, що супроводжується зменшенням показника
числа виразок на 1-го щура. Виявлено, що введення L-аргініну перед
моделюванням пептичної виразки в умовах надлишкового утворення NO при
надходженні до організму нітрату натрію не позначається на тяжкості
виразкового процесу в слизовій оболонці шлунка.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть
використовуватися як експериментальна база для розробки патогенетично
обґрунтованих методів корекції ульцерогенних порушень СОШ (слизова
оболонка шлунка) за умов надлишкового надходження неорганічних
нітросполук до організму людини та теплокровних тварин.
Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах
патологічної фізіології, нормальної фізіології, біохімії, загальної
гігієни та екології, госпітальної терапії, післядипломної освіти
лікарів-терапевтів ВДНЗУ “Українська медична стоматологічна академія”.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено програму
досліджень, визначено мету і задачі дослідження, методичні підходи,
виконано експериментальні дослідження. Автором особисто проведено аналіз
і узагальнення матеріалу, формування комп’ютерної бази даних,
статистичну обробку результатів експериментів, підготовку статей,
формулювання висновків.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації
доповідалися на II з’їзді токсикологів України (Київ, 2004),
Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні питання
профілактики ранньої інвалідизації дітей на сучасному етапі розвитку
медицини” (Полтава, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції
“Проблеми і перспективи формування студентських колективів та екологічне
виховання студентів” (Полтава, 2005), IV читаннях ім. В.В. Підвисоцького
(Одеса, 2005), підсумкових науково-практичних конференціях молодих
учених “Медична наука – 2005” та “Медична наука – 2006” (Полтава,
2005-2006), XI конгресі Світової федерації українських лікарських
товариств (Полтава, 2006), науковій конференції “Актуальні питання
патофізіології” (Ялта, 2006), ІІІ Національному з’їзді фармакологів
України (Одеса, 2006), засіданні апробаційної ради №1 ВДНЗУ “Українська
медична стоматологічна академія” (Полтава, 2007), засіданні сектору
вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
(Київ, 2007), Всеукраїнській науковій конференції молодих учених
“Медична наука – 2007” (Полтава, 2007).
Публікації. Результати дисертації опубліковано в 6 статтях (без
співавторів – 3), 10 робіт опубліковано в матеріалах і тезах конференцій
і конгресів.
Структура та обсяг дисертації. Повний обсяг дисертації становить 158
сторінок. Основний текст викладено на 125 сторінках. До складу
дисертації входять вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів
дослідження, 3 розділи власних досліджень, аналіз і узагальнення
результатів дослідження, висновки, список використаних джерел.
Дисертаційна робота ілюстрована 21 таблицею та 13 рисунками (з них 11
фотографій та 2 графіки). Список використаних джерел містить 295
наукових робіт, з них кирилицею – 127, латиною – 168.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Експерименти виконані на 115 білих щурах
лінії Вістар масою 130-160 г. Тварин утримували в умовах акредитованого
віварію згідно зі “Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню
та утриманню експериментальних біологічних клінік (віваріїв)”. Комісією
з питань біоетики Вищого державного навчального закладу України
“Українська медична стоматологічна академія” (протокол № 46 від
20.02.2007 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні
науково-дослідної роботи не виявлено.
Проведено одинадцять серій дослідів:
– перша серія – інтактні тварини;
– друга, третя та четверта серії – введення нітрату натрію протягом
відповідно 14, 30 та 90 діб;
– з п’ятої по дев’яту серії відтворювали пептичну виразку за
Л.М.Тарасенко зі співавторами, причому тварини з шостої по дев’яту серії
знаходилися в стані хронічної нітратної інтоксикації, а сьома, восьма та
дев’ята серії отримували неселективний інгібітор NO-синтази – L-NAME
(метиловий ефір нітро-L-аргініну), селективний інгібітор індуцибельної
NO-синтази – аміногуанідин та субстрат NO-синтазної реакції – L-аргінін
відповідно.
– в десятій та одинадцятій серіях відтворювали пептичну виразку за
модифікованою методикою Okabe причому в одинадцятій серії на тлі
хронічної інтоксикації нітратом натрію.
Евтаназію білих щурів проводили шляхом декапітації під ефірним наркозом.
Нами були використані дві методики відтворення експериментальної ПВ
шлунка: за Л.М. Тарасенко, К.С. Непорадою, І.М. Скрипником із деякими
змінами (взяття матеріалу проводили на 14, 30, 90 добу) та за
модифікованою методикою S. Okabe et al. (взяття матеріалу проводили на
5-у, 7-у, 15-у та 21-у добу після операції). Перша модель відбиває
провідні патогенетичні механізми розвитку ПВ у людини (хронічний
психоемоційний стрес, цитотоксичний вплив жовчі на СОШ внаслідок
дуоденального рефлюксу, зміни режиму харчування). Характерною рисою
другої методики є можливість одержання ПВ у певному відділі
шлунково-кишкового тракту, висока стабільність відтворення, простота і
значний ступінь однорідності морфогенезу.
Хронічну інтоксикацію відтворювали шляхом введення нітрату натрію у дозі
200 мг/кг маси тіла у вигляді водного розчину інтрагастрально за
допомогою спеціального зонду щоденно протягом 14, 30 та 90 діб. Для
зміни режимів функціонування NO-синтаз використовували препарати
виробництва “Sigma” (США): неселективний інгібітор NO-синтаз – L-NAME –
вводили внутрішньоочеревинно в дозі 20 мг/кг двічі за 48 та 24 години
перед початком відтворення ПВ (пептична виразка) за методом Л.М.
Тарасенко зі співавторами; селективний інгібітор індуцибельної
NO-синтази – аміногуанідин (Aminoguanidine) – вводили
внутрішньоочеревинно в дозі 25 мг/кг двічі за 48 та 24 години перед
початком відтворення ПВ за методом Л.М. Тарасенко зі співавторами;
субстрат NO-синтазної реакції – L-аргінін – вводили в дозі 100 мг/кг
маси інтрагастрально за три дні до початку відтворення ПВ за методом
Л.М. Тарасенко зі співавторами.
в гомогенаті тканин СОШ з індукторами у вигляді NADH, NADPH і
пірогеналом. Принцип методу визначення концентрації ТБК-реактантів
(Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) базується на здатності
2-тіобарбітурової кислоти (ТБК) утворювати стійкий забарвлений комплекс
із малоновим діальдегідом та іншими проміжними оксопродуктами ПОЛ
(пероксидне окиснення ліпідів). Приріст концентрації ТБК-реактантів при
1,5-годинній інкубації тканин дає інформацію про стан антиоксидантної
системи. Принцип методу визначення активності супероксиддисмутази
(Брусов О.С. и соавт., 1976) полягає в тому, що SOD інгібує
аутоокислення адреналіну. За різницею швидкості реакції без додавання
біологічного матеріалу та з його додаванням обчислюють активність
ферменту. Визначення активності каталази (Архипова О.Г., 1980)
ґрунтується на її здатності розкладати пероксид водню. Кількість
останнього, що залишився в пробі, визначають титруванням 0,1 н розчином
калію перманганату. Вміст аденозинтрифосфату (Beutler E. et al., 1975)
визначали за допомогою вимірювання оптичної густини реагуючих речовин,
яка пропорційна вмісту ATP у пробі. Вміст аденозинди- та монофосфату
(ADP і AMP) (Jaworek D. et al., 1974) визначали в одній пробі за
допомогою сполучених реакцій. Метод ґрунтується на тому, що AMP у
присутності ATP перефосфорилюється ферментом міокіназою з утворенням
двох молекул ADP. Молекули ADP фосфорилюються піруваткіназою за рахунок
фосфоенолпірувату, який при цьому перетворюється на піруват, котрий
можна визначити за допомогою індикаторної реакції з NADH
(нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений) та ЛДГ. На основі одержаних
результатів обчислювали значення енергетичного потенціалу (ЕП) за
формулою D.E.Atkinson. Принцип методу визначення вмісту фукози (Dishe i
Shettles, 1948), заснований на фотометричному визначенні хромогену, що
утворюється в умовах послідовної дії на фукозу сірчаною кислотою та
солянокислим цистеїном. Вміст NАNА (N-ацетилнейрамінова кислота) в
тканинах визначали за методом Гесса, принцип якого ґрунтується на
утворенні хромогену сіаловими кислотами, які виділяються із складу
глікопротеїдів у результаті гідролізу безбілкового фільтрату сироватки
крові та гомогенату тканин, з розчином оцтової та сірчаної кислот у
киплячій водяній бані. Вміст гексуронових кислот визначали карбазоловим
методом (Шараев П.Н. и др., 1987), принцип якого базується на нагріванні
досліджуваних біологічних субстратів з концентрованою сірчаною кислотою.
У результаті реакції цукри перетворюються в альдегід фурфуролу або його
гомологи, які з карбазолом утворюють хромоген фіолетово-рожевого
кольору. Для оцінки кислотоутворюючої функції СОШ (Тарасенко Л.М.,
Скрипник І.М., 1998) у порожнину шлунка після перев’язки лігатурою
нижнього відділу стравоходу за допомогою шприца через пілорус вводили
1,0 мл дистильованої води. Потім внутрішньошлункову рідину збирали в
хімічний стаканчик і вимірювали рН універсальним іонометром И-130 2М з
поправкою на розведення.У тканинах СОШ щурів визначали загальну
протеолітичну активність за методом (Уголев A.M., Иезуитова Н.Н.,
Масевич Ц.Г., 1969), який ґрунтується на визначенні приросту гліцину, що
утворюється в результаті гідролізу казеїну супернатантом гомогенату
тканин. Протеолітичну активність розраховували в мкмолях відщепленого
гліцину за 1 хв. інкубації на 1 г тканини.
Ступінь виразкового ушкодження розраховували із застосуванням системи
балів (Яковлева Л.В., Оболенцева Г.В., Брюзгінова Л.П., 2001).
Дослідження зрізів проводили на цифровому мікроскопі фірми Olympus “ВХ
41” з використанням спеціальної програми “Olympus DP Soft” та наступним
фотографуванням препаратів із дослідженням клітинних і стромальних
елементів. Характер дольового співвідношення кровоносних мікросудин,
м’язової та власної платівок слизової оболонки визначали з допомогою
внутрішньоокулярної сітки (Автандилов Г.Г., 1980).
Для порівняння та оцінки достовірності отриманих результатів
використовували розрахунок критерію достовірності Ст’юдента (t).
при використанні пірогеналу, що свідчить про зниження функціональної
активності NADPH-оксидази лейкоцитів.
), продукція якого після місячної інтоксикації суттєво зростає. Проте,
у цей же період достовірно підвищується приріст концентрації
ТБК-реактантів за час інкубації (на 30,1%, р0,05). На 14 та 30
добу хронічної інтоксикації нітратом натрію загальна протеолітична
активність у СОШ істотно не змінюється. Після 90-денного введення
нітрату натрію відзначається збільшення загальної протеолітичної
активності в СОШ на 41,9% (р?Oe
"
$
&
(
*
,
.
0
2
4
6
N
|
~
&
&
??
??
????
Hції (90 діб) не призвело до достовірних змін концентрації
ТБК-реактантів. Однак, при цьому виявлене достовірне збільшення величини
концентрації ТБК-реактантів до інкубації (на 26,4%, р0,05) при
відтворенні ПВ на фоні інтоксикації нітратом. Тобто, зменшення
ендогенного утворення оксиду азоту в NO-синтазній реакції може
попереджувати істотне зниження активності каталази, що розвивається
внаслідок взаємодії NO з активним центром цього ферменту. Це припущення,
у певній мірі, підтверджується тим фактом, що при застосуванні
L-аргініну достовірне зниження активності каталази (на 56,2%, р
Здано в набір 03.03.2008 р.
Підписано до друку 04.03.2008 р.
Формат 60х84/16. Папір офсетний. Друк офсетний.
Ум. друк. арк. 1,2. Наклад 100 прим.
Зам. № 117.
Свідоцтво про внесення
до Державного реєстру видавців,
виготівників і розповсюджувачів
видавничої продукції
серія ДК № 1892 від 06.08.2004 р.
Видавництво “АСМІ”.
36020, м. Полтава, вул. Комсомольська, 24.
Тел./факс: (0532) 56-55-29.
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
