мІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
Бутенко Олексій Геннадійович
удк: 611-018.1.001.5 (083.3) : 612.67
Оцінка вікових структурних змін клітин різних типів за допомогою
математичного апарату, створеного на базі теорії нечітких множин
14.03.09 – цитологія, гістологія, ембріологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті геронтології АМН України
Науковий керівник:
– доктор біологічних наук Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут
геронтології АМН України, завідувач лабораторії морфології та цитології
Офіційні опоненти:
– доктор медичних наук, професор Яценко Валентин Порфирович,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, завідувач НДЛЦ,
Національний технічний університет України “Київський Політехнічний
Інститут”, завідувач кафедри медичної кібернетики та телемедицини
– доктор біологічних наук, професор Дзержинський Микола Едуардович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач
кафедри цитології, гістології та біології розвитку
Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин, АМН
України, м. Київ
Захист відбудеться “16“ вересня 2004 р. о 13-30 на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному
університеті ім. О.О. Богомольця (03057, Київ, пр. Перемоги 34).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця (03057, Київ, вул. Зоологічна, 1).
Автореферат розісланий “12” серпня 2004 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор О.М. Грабовой
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Старіння є складним, багатофакторним і внутрішньо
суперечливим процесом (C.S. Atwood et all, 2003). Тому при вивченні його
структурних проявів виникає ряд труднощів, пов’язаних як із
неспецифічністю вікових змін, так і з їхньою гетерогенністю,
гетерохронністю і гетеротопністю, що призводить до морфологічно
різнобарвної картини (В.В. Фролькис и соавт., 2000). Це ускладнює опис,
оцінку і співставлення різноманітних проявів старіння в різних тканинних
і клітинних системах, у зв’язку з чим виникає необхідність їхньої
уніфікації і стандартизації. Підходи, які є в арсеналі сучасної
морфології, не дозволяють ефективно вирішувати завдання, пов’язані з
оцінкою глибини і виразності процесу старіння, зіставленням результатів
у різних клітинних популяціях, у різних вікових групах, при різних
хворобах, на різних етапах їхнього розвитку, при різних
експериментальних впливах.
Методи морфометрії в значній мірі підвищують об’єктивність і
порівняльність результатів морфологічних досліджень (Г.Г. Автандилов,
1990; В.Л. Исаков, 1990; В.П. Яценко, 1993). Однак далеко не завжди
кількісні характеристики здатні правильно відобразити функціональний
зміст явища, що реєструється. Важливе значення для вивчення структурних
особливостей старіння мають методи функціональної морфології, що
дозволили встановити субклітинну локалізацію функцій, а також кореляти
між змінами функції і структури, яка виконує цю функцію.
Для об’єктивної оцінки сукупності структурних вікових змін виникла
необхідність створення такого інструменту, за допомогою якого можливо
було б уніфікувати одиниці оцінки виразності морфологічних,
морфометричних, гісто- і ультрацитохімічних змін, звести в один показник
результати кількісних вимірів і їхніх якісних характеристик.
Розроблений у лабораторії морфології і цитології Інституту геронтології
АМН України метод комплексної морфо-функціональної оцінки (КМФО)
структурних проявів старіння заклав підходи до створення такого
інструменту (А.С. Ступина и соавт., 1993; Т.Ю.Квитницкая-Рыжова и
соавт., 1995). Цей метод став черговим етапом у розвитку
морфо-функціональних досліджень старіння, надавши кількісний вираз
якісним змінам структури. Однак зручним для дослідників інструментом
об’єктивізації морфологічних даних він не став. Метод виявився
громіздким і не пристосованим для використання за допомогою
обчислювальної техніки.
Для подолання цих труднощів, уніфікації шкали виміру змін, що
відбуваються в клітинах і тканинах у процесі старіння, зведення до
мінімуму суб’єктивізму дослідника при прочитанні та трактуванні
препарату, виникла необхідність створення методу об’єктивізації
результатів морфологічних досліджень, який був би реалізований через
комп’ютерну програму, що й було здійснено на основі принципів
функціональної морфології з використанням математичного апарату,
заснованого на теорії нечітких множин.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась у межах науково-дослідних тем лабораторії морфології
та цитології Інституту геронтології АМНУ: “Вікові структурні особливості
клітин різних популяцій під впливом іонізуючого опромінення та за умов
експериментального подовження життя”, номер держреєстрації 0199U000639
(1999-2001 рр.) та “Вікові морфо-функціональні особливості
гісто-гематичних бар’єрів за даними електронної мікроскопії та
ультрацитохімії”, номер держреєстрації 0101U002026 (2001-2004 рр.).
Мета дослідження.
Розробити метод об’єктивізації результатів морфологічних досліджень на
базі теорії нечітких множин – метод ОРМД (нм) – і за допомогою його
інтегральних показників оцінити вікові морфо-функціональні зміни різних
типів клітин і складноорганізованих структур.
Задачі дослідження.
Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні задачі:
Створити метод ОРМД (нм) і розробити технологію його застосування:
враховуючи функціональну значимість всіх структурних перебудов, що
відбуваються в клітинах і тканинах при старінні, створити спеціальний
класифікаційний опис морфо-функціональних змін структурних характеристик
клітини і тканини в процесі старіння;
підібрати необхідну функцію приналежності і поліном для переведення
лінгвістичних даних у числові;
перевірити правильність вибору, розрахувавши як приклад структурні
характеристики по декільком органелам клітини;
написати комп’ютерну програму як інструмент дослідження, що вбирає в
себе всі принципи і деталі методу.
За допомогою запропонованого методу ОРМД (нм) оцінити характер і
вираженість структурних проявів старіння нейронів вентромедіального ядра
(ВМЯ) гіпоталамуса щурів.
За допомогою запропонованого методу ОРМД (нм) оцінити характер і
вираженість структурних проявів старіння кардіоміоцитів лівого шлуночка
щурів.
За допомогою запропонованого методу ОРМД (нм) оцінити характер і
вираженість структурних проявів старіння стінки капілярів лівого
шлуночка міокарда щурів.
За допомогою запропонованого методу ОРМД (нм) оцінити характер і
вираженість структурних проявів старіння судинних сплетінь (СС)
шлуночків мозку щурів.
Об’єкт дослідження: структурні особливості старіння клітин різних типів,
стінки капілярів міокарда і СС шлуночків мозку щурів різного віку.
Предмет дослідження: створення нового методичного підходу для
об’єктивізації результатів морфологічних досліджень в галузі
геронтології; інтегральна оцінка структурних проявів старіння клітин
різного типу і багатокомпонентних утворень за допомогою запропонованого
методу.
Методи дослідження: світлова й електронна мікроскопії, програмування з
використанням теорії нечітких множин.
Наукова новизна одержаних результатів. Нами був створений новий
оригінальний метод для об’єктивізації, інтеграції і стандартизації
результатів морфологічних досліджень, заснований на принципах
функціональної морфології і розроблений на базі теорії нечітких множин.
Вперше за допомогою запропонованого методу ОРМД (нм) були оцінені і
співставлені морфо-функціональні особливості старіння клітин різних
типів (високодиференційовані постмітотичні клітини – нейрони і
кардіоміоцити), а також багатокомпонентних складноорганізованих утворень
(стінка капілярів міокарда і СС шлуночків мозку), що дало можливість
визначити спільні риси і відмінності в характері їх старіння, а також
резервні можливості кожної структури, і характеризувати їх за допомогою
кількісних параметрів та графічних показників. За допомогою методу ОРМД
(нм) вдалося розширити і поглибити уявлення про процес старіння, з
огляду як на ступінь виразності деструкції і адаптації, так і ступінь
їхньої поширеності в досліджуваних об’єктах, а також і ступінь
цілісності, незмінності досліджуваних ознак.
Пріоритетність у створенні комп’ютерної програми, яка є технологією й
інструментом використання методу ОРМД (нм), підтверджена Свідоцтвом про
реєстрацію авторського права, виданим Державним департаментом
інтелектуальної власності України за номером 8028 від 25.07.2003 р.
Практичне значення одержаних результатів. Запропонований метод ОРМД
(нм) є зручним, адекватним і інформативним інструментом для дослідження
структурних особливостей старіння організму. Він дозволяє ближче підійти
до проблеми визначення біологічного віку і дослідження його критеріїв.
Принципи цього методу можливо застосовувати як у будь-якій галузі
експериментальної біології, так і в діагностичній медицині.
Отримані результати дисертації впроваджені в наукову роботу НДЛЦ НМУ
імені О.О. Богомольця. Також можливе використання результатів в
педагогічному процесі.
Особистий внесок здобувача. Автору належить ідея використання теорії
нечітких множин для створення нового методичного підходу, метою якого є
об’єктивізація результатів морфологічних досліджень. Дисертантом
самостійно був зроблений добір і аналіз літератури, проведена
експериментальна частина дослідження, розроблене програмне забезпечення
для реалізації методу і проведений аналіз отриманих результатів,
написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки.
Апробація результатів роботи. Матеріали роботи докладалися й
обговорювалися на засіданні відділення “Медичної інженерії” Академії
інженерних наук України 23.01.2001 року, Київ; на III Українській
Конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті академіка В.В. Фролькіса
28.01.2002 року, Київ; на III Національному конгресі анатомів,
гістологів, ембріологів і топографоанатомів 21-23 жовтня 2002 року,
Київ, на V Українській Конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті
академіка В.В. Фролькіса 28.01.2004 року.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт: 5 статей (4
із них – у фахових журналах, рекомендованих ВАК України), і 4 тези
доповідей на наукових конгресах і конференціях.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 144
сторінках машинописного тексту (основного тексту____ стор.). Містить 24
ілюстрації. Список використаних літературних джерел містить 220
найменувань (99 – країни СНД, 121 – інші країни).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Робота проводилася на щурах-самцях
Вістар двох вікових груп: дорослі (8 міс.) і старі (28 міс.), по 15
щурів у кожній групі. Декапітацію проводили після попереднього
внутрішньочеревного нембуталового наркозу. Досліджували мозок
(вентромедіальне ядро гіпоталамуса (ВМЯ) і СС латеральних шлуночків) і
серце (лівий шлуночок). Для світлооптичного дослідження шматочки
тканини, які підлягали вивченню (мозок, серце), фіксували в 10% водному
нейтральному розчині формаліну, проводку і заливання в парафін
здійснювали відповідно до загальноприйнятої методики, далі виготовляли
серійні зрізи товщиною 7 – 8 мкм. Фарбування препаратів робилося за
допомогою загальноприйнятих методик: гематоксилін – еозин, за Ван-Гізон,
альціановий синій, тіонін за Нісслем.
Для електронно-мікроскопічного дослідження шматочки мозку і серця щурів
двох вікових груп фіксували в 2,5% розчині глутаральдегіда і
дофіксовували 1% розчином осмієвої кислоти (G. Millonig, 1961). Подальше
зневоднення і заливання в смолу (епон 812 або суміш епона з аралдитом)
проводили по загальноприйнятому методу (Б.Уикли, 1975).
Різання блоків проводилося на ультратомі LKB-III (Швеція) за допомогою
скляних ножів, які готувалися на приладі Knife Maker 7801B (LKB,
Швеція). Напівтонкі зрізи фарбували толуїдиновим синім за методом T.
Sato і M. Shamoto (1973). Після фарбування і укладання в канадський
бальзам напівтонкі зрізи вивчали під світловим мікроскопом.
Ультратонкі зрізи фарбували 2% розчином уранілацетата за M. L. Watson
(1958) і цитратом свинцю (E. S. Reynolds, 1963), а потім досліджували за
допомогою електронного мікроскопа ПЕМ – 125 К (SELMI, Україна).
Математична частина методу базувалася на нечітких системах, заснованих
на теорії нечітких множин, розроблених і описаних у 1965 році професором
Каліфорнійського університету (Берклі) Лотфі Заде. Нечіткою множиною А
на множині Х називається сукупність пар виду:
, [1]
– відображення множини U на одиничний відрізок. [0,1] – називається
функцією приналежності (ФП) нечіткої множини А.
Проблему неточності і неоднозначності при описі процесів або станів
біологічної системи вирішуємо введенням поняття лінгвістичної змінної,
що виходить із поняття нечіткої змінної.
Нечітка змінна описується формулою:
av = , [2]
де а – найменування нечіткої змінної; Х = {х} – область її визначення;
Са = {ua (x) / x} – нечітка множина на Х, що описує обмеження нa
можливі значення нечіткої змінної “а” (її семантику).
Лінгвістична змінна (ЛЗ) описується формулою:
bv = , [3]
де b – найменування ЛЗ; Т – множина її значень (терм-множина), яка являє
собою найменування нечітких змінних, областю визначення кожної із яких є
множина Х. Множина “Т” називається базовою терм-множиною ЛЗ; G –
синтаксична процедура (граматика), яка дозволяє оперувати елементами
терм-множин “Т”, зокрема генерувати нові осмислені терми. М –
семантична процедура, яка дозволяє перетворити кожне нове значення ЛЗ,
утворене процедурою “G”, у нечітку змінну, тобто приписати їй нечітку
семантику шляхом формування відповідної нечіткої множини.
Синтаксис “G” задаємо у вигляді безконтекстової граматики Лукасевича,
множина термових символів якої включає множину базових значень “Т”,
логічні операції і модифікатори типів І, АБО.
М(а1 АБО а2 ) = С1 \/ С2 ; [4]
М(а1 І а2 ) = С1 /\ С2 ; [5]
де С1 і С2 – нечіткі множини, які відповідають значенням (нечітким
змінним) а1 і а2 розглянутої ЛЗ.
Таким чином, усі ці побудови призводять до використання нечіткого
введення як способу прирівнювання даних якісного характеру, отриманих
дослідником у природній мовній формі, до деякої штучної шкали, що
допомагає дослідникові вводити дані в природному для нього
поняттєво-мовному вигляді. Далі введені дані переводяться в цифрові й
обробляються з використанням вищезазначених формул, які ми розробляли
спеціально для побудови адекватної математичної моделі. *
Комп’ютерна програма написана на мові Visual Basic for Application у
середовищі Access.
Статистична обробка результатів досліджень по кожній експериментальній
групі проводилася шляхом порівняння середніх арифметичних і їхніх
похибок, використовуючи критерій Ст’юдента.
Результати дослідження і їх обговорення. Для підвищення об’єктивності
оцінки і порівнювальності результатів морфологічних досліджень процесу
старіння виникла необхідність у створенні моделі, яка при своїй
математичній ефективності та адекватності не спрощувала би складності
біологічних процесів, і в той же час була б простою у використанні і
застосовувалася би у вигляді комп’ютерної
________________________
*Висловлюю щиру подяку доктору технічних наук, професору, заслуженому
винахіднику України, заслуженому діячеві науки України, члену Академії
інженерних наук України Володимиру Івановичу Гостєву за консультативну
допомогу в розробці математичного апарату методу ОРМД (нм).
програми. Така модель була нами розроблена на базі теорії нечітких
множин і заснована на принципах функціональної морфології.
В основу запропонованого нами методу ОРМД (нм) покладено спеціально
оформлений опис вікових структурних змін клітин і тканин, складений із
використанням відомих морфо-функціональних корелятів. Характеристика або
властивість конкретної структурної компоненти клітини або тканини
(ознака) логічно ділиться на три ступеня виразності, які лінгвістично
позначені словами-термами: “незначно”, “помірно” і “виражено”, а в
деяких випадках – кількісним рядом. Вищезгадані лінгвістичні терміни є
нечіткими описами зміни ознаки структури в процесі старіння, не
потребуючими будь-яких штучних числових уточнень, що відповідає задачі
даного дослідження.
Основним методологічним засобом такого класифікаційного опису є поділ
усіх морфо-функціональних змін клітини і тканини, які мають місце при
старінні, на деструктивні й адаптивні. Всі структурні зміни, які
свідчать про деструктивні, дистрофічні, атрофічні процеси, і які
призводять до порушення й обмеження функції, умовно позначені терміном
“деструкція” (Д), а зміни, спрямовані на підтримку або підсилення
функціональної активності – терміном “адаптація” (А).
Базуючись на цьому принципі, були створені дві спеціальні шкали для
кількісної оцінки виразності змін Д і А ультраструктури клітинних
органел, а також різних компонентів тканини. Зміни ознак, які свідчать
про розвиток Д, розміщали в лівій частині схеми, а ті, що відносяться до
А, – у правій. Ступінь їхньої зміни на штучній шкалі відповідає всій
сукупності значень в інтервалі від 0 до 3.
Істотним моментом при оцінці вікових змін всіх особливостей клітини і
тканини з віком є “нульова” точка або “точка відліку”. Необхідно визнати
існування гіпотетично “нормальної”, стандартної клітини, структура якої
є типовою для даного типу клітин. Це рівною мірою стосується і тканин. І
хоча “норма” є у певній мірі умовним поняттям, введення “нульової” точки
необхідно для подальших оцінок виразності змін, які відбуваються.
Ця класифікація є одночасно алгоритмом і матрицею опису препарату, яка
логічно характеризує кожну ознаку ультраструктури клітини або тканини.
Потім вона “згортається” у цифрові і графічні показники, що передбачає
не тільки об’єктивізацію результатів досліджень, але також їх інтеграцію
і стандартизацію.
Запропонована класифікація є певною методологічною базою, яка може бути
доповнена і конкретизована, виходячи з задачі дослідника, а також із
специфіки досліджуваного об’єкта. Крім того, запропонована класифікація
динамічна і подальший прогрес морфології, з’ясування функціонального
значення певних морфологічних перебудов неминуче призведе до розширення
й уточнення даної класифікації.
На основі теоретичних розробок, залучення принципів нечітких множин
(Л.Заде, 1965), докладно наведених у розділі “Матеріали і методи”, і
розробленого на цій основі математичного апарату, нами була написана
комп’ютерна програма, яка дає дослідникові можливість використовувати
метод об’єктивізації результатів морфологічних досліджень безпосередньо
при мікроскопіюванні. Програма, створена на основі методу ОРМД (нм) і
написана на мові Visual Basic for Application у середовищі Access,
розраховує ступінь приналежності кожної ознаки клітини і тканини, що дає
можливість кількісно визначити ступені виразності процесів Д і А в
клітині або тканині при старінні, а також ступені поширеності цих
процесів. У підсумку, програма видає п’ять числових величин, що описують
ступінь старіння клітини і тканини: 1) вираженість деструктивних
процесів, 2) поширеність деструктивних процесів, 3) вираженість процесів
адаптації, 4) поширеність процесів адаптації і 5) поширеність ознак, що
знаходяться у незмінному, інтактному стані – показник “інтактності”
(“І”). Остання величина є показником резервних можливостей клітини
протистояти старінню або несприятливим зовнішнім впливам. Вона дозволяє
обчислити “обсяг цілісності”, тобто рівень незмінності структурних ознак
як органел, так і більш складних з точки зору гістологічної організації
утворень. По закінченні роботи дослідника над матеріалом, комп’ютерна
програма, крім зазначених п’яти показників, видає докладний протокол
досліджень. Отримані в такий спосіб дані легко порівнювати, вони являють
собою досить повну, різнобічну й узагальнену характеристику структурних
ознак старіння утворень, які вивчалися.
Для оцінки структурних проявів старіння за допомогою запропонованого
методу були обрані клітини різного типу, а також більш складні
багатокомпонентні утворення, які складаються із клітин різного типу і
різної тканинної приналежності, а також неклітинних структур.
Досліджувалися високодиференційовані, постмітотичні клітини, найбільшою
мірою схильні до вікових змін – нейрони головного мозку
(вентромедіального ядра гіпоталамуса) і кардіоміоцити лівого шлуночка
серця. На наступному етапі була вивчена більш складноорганізована
структура – стінка кровоносних капілярів міокарда, яка складається з
різних клітин і неклітинного компонента (ендотеліальні клітини і
базальний шар, який містить у собі клітинні елементи – перицити та
базальну мембрану), а також перикапілярний простір. Після цього було
проведене дослідження ще більш складного утворення (органу) – СС
шлуночків мозку, який складається із клітин різної тканинної
приналежності (епітелій і сполучна тканина), а також гемокапілярів і
перикапілярного простору, який містить пухку волокнисту сполучну тканину
з великою кількістю фібробластів і макрофагів. Вони складають структурну
основу гемато-лікворного бар’єра мозку.
\
h
‚
„
?
O
\
d
?d
f
h
j
‚
„
†
?
?
¶
“$Zt
v
?
??°Iv
?
TH
e
??????????
d?fooooiaaaaaaaaaaaaOOIAA
&
h†`pB*
dh
:птаційних – 33%, а показник інтактності – 49%. З віком поширеність
деструкції збільшилася до 38%, поширеність адаптації зменшилася і стала
дорівнювати 20%, а показник інтактності знизився до 42%.
У кардіоміоцитах дорослих щурів вираженість деструктивних процесів
склала 7%, а адаптаційних – 5% (Рис.2). Однак із віком ці показники
змінилися, і у старих щурів вони зросли відповідно до 19% та 11%.
Поширеність деструктивних і адаптаційних процесів у дорослих щурів
склала 7%, а показник інтактності – 86%. З віком поширеність деструкції
збільшилася до 57%, поширеність адаптації – до 20%, а показник
інтактності зменшився до 23%.
вираженість поширеність
Дорослі щури (8 міс.)
вираженість поширеність
старі щури (28 міс.)
Рис.1. Характеристика основних показників старіння нейронів ВМЯ
гіпоталамуса мозку щурів. Вираженість Д і А дана у відсотках, р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
